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方法論記事

膵臓腺癌組織のパラフィン包埋したスライド上のB7-H1（PD-L1）の免疫組織化学的染色

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DOI:

10.3791/4059

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2013年1月3日

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1The Sidney Kimmel Comprehensive Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Oncology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Dermatology, The Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 5The Sol Goldman Pancreatic Cancer Center, The Johns Hopkins University School of Medicine, 6Yale Cancer Center, Yale School of Medicine, 7The Skip Viragh Center for Pancreatic Cancer, The Johns Hopkins University School of Medicine, 8Department of Pathology, The Johns Hopkins University School of Medicine

この記事について

サマリー

B7-H1（PD-L1）とPD-1への結合は、腫瘍の微小環境における主要な腫瘍誘発免疫抑制信号を提供します。膵臓腺癌におけるB7-H1の発現と局在を特徴付けるための免疫組織化学的染色法はここで説明されます。

要約

B7-H1/PD-L1、免疫調節細胞表面タンパク質のB7ファミリーのメンバーは、プログラム死1（PD、その受容体との相互作用を介して細胞性免疫応答の負の調節に重要な役割を果たしている-1）1,2。腫瘍細胞によるB7-H1の過剰発現は、黒色腫、神経膠芽腫、肺の癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌、腎細胞を含むヒトの癌の数で注目されており、抗腫瘍損なうことが示されているTシャツを細胞免疫3-8。

最近では、膵臓腺癌組織によるB7-H1の発現は、潜在的な予後マーカー9,10として同定されている。さらに、膵臓癌のマウスモデルにおいて、B7-H1の封鎖は、抗腫瘍応答11を生成することが示されている。これらのデータは、潜在的な治療標的としてのB7-H1の重要性を示唆している。抗B7-H1の封鎖抗体が故にmulのための臨床試験で検証されています黒色腫と肺、結腸、腎臓、胃、膵臓癌を含む12のtipleヒト固形腫瘍。

最終的にはB7-H1標的療法の恩恵を受ける患者を識別できるようにするためには、B7-H1およびB7-H1の封鎖抗体による処置に対する患者の応答の発現と局在の相関関係を調査することが重要です。免疫組織化学を通してヒト膵臓腺癌組織におけるB7-H1の発現を調べると、この共抑制シグナル伝達分子は、腫瘍の微小環境における腫瘍免疫の抑制に寄与する方法のより良い理解を与える。チェンと同僚によって開発された抗B7-H1モノクローナル抗体（クローン5H1）は、ヒト腫瘍組織の複数のタイプ4,8の凍結切片で信頼性の高い染色結果を生成することが示されているが、パラフィン包埋されたスライド上の染色がするまで挑戦していた最近13から18。我々は、devがある膵臓腺癌組織のパラフィン包埋されたスライドの駆け落ちB7-H1染色プロトコール。ここで説明するB7-H1染色プロトコールは少し背景に、B7-H1の一貫性のある膜と細胞質染色を生成します。

プロトコル

B7-H1/PD-L1、免疫調節細胞表面タンパク質のB7ファミリーのメンバーは、プログラム死1（PD、その受容体との相互作用を介して細胞性免疫応答の負の調節に重要な役割を果たしている-1）1,2。腫瘍細胞によるB7-H1の過剰発現は、黒色腫、神経膠芽腫、肺の癌、乳癌、大腸癌、卵巣癌、腎細胞を含むヒトの癌の数で注目されており、抗腫瘍損なうことが示されているTシャツを細胞免疫3-8。

最近では、膵臓腺癌組織によるB7-H1の発現は、潜在的な予後マーカー9,10として同定されている。さらに、膵臓癌のマウスモデルにおいて、B7-H1の封鎖は、抗腫瘍応答11を生成することが示されている。これらのデータは、潜在的な治療標的としてのB7-H1の重要性を示唆している。抗B7-H1の封鎖抗体は、したがって、複数の人間のための臨床試験で検証されています黒色腫と肺、結腸、腎臓、胃、膵臓12の癌を含む固形腫瘍。

最終的にはB7-H1標的療法の恩恵を受ける患者を識別できるようにするためには、B7-H1およびB7-H1の封鎖抗体による処置に対する患者の応答の発現と局在の相関関係を調査することが重要です。免疫組織化学を通してヒト膵臓腺癌組織におけるB7-H1の発現を調べると、この共抑制シグナル伝達分子は、腫瘍の微小環境における腫瘍免疫の抑制に寄与する方法のより良い理解を与える。チェンと同僚によって開発された抗B7-H1モノクローナル抗体（クローン5H1）は、ヒト腫瘍組織の複数のタイプ4,8の凍結切片で信頼性の高い染色結果を生成することが示されているが、パラフィン包埋されたスライド上の染色がするまで挑戦していた最近13から18。我々は、B7-H1 stainiを開発しました膵臓腺癌組織のパラフィン包埋されたスライドのngのプロトコル。ここで説明するB7-H1染色プロトコールは少し背景に、B7-H1の一貫性のある膜と細胞質染色を生成します。

1。デparafinization

  1. 焼く20分間55℃でスライドします。
  2. 10分間、キシレン中の化学フード内、浸すスライド。
  3. 10分間、新鮮なキシレンに浸してスライドする。
  4. 浸し、5分間100％エタノール中でスライドします。
  5. 5分間、新鮮な100％エタノールでスライドを浸す。
  6. 浸し、5分間、95％エタノールにスライド。
  7. 浸し、5分間、80％エタノールにスライド。
  8. 5分間脱イオン水でスライドを浸す。

2。抗原回復

  1. その後125℃で30秒間のTris-EDTA緩衝液（pH9.0）と圧力鍋の熱、90℃で10秒間、Cに浸しスライド。
  2. 60分間のクールなスライドしてみましょう。
  3. 5分間TBSTに浸しスライド; REPE2倍で。

3。染色

  1. スライド上の組織の周りのソリューションを拭き取ってください。疎水性のペンで組織の周りに円をマークします。
  2. 湿度室でスライドを置き、全体の染色プロセス全体を通して、スライド上の組織の乾燥を避ける。 5分間ペルオキシダーゼブロック内のスライドとインキュベートスライド上に疎水性の円内にペルオキシダーゼブロックの代わりに1滴（完全に組織領域をカバーする約200μl以上）。
  3. 5分間、TBSTで開催その後、TBSTでスライドを洗浄します。
  4. 15分間インキュベートし、各スライドにブロッキングバッファーをブロックエースの代わりに一滴。
  5. 5分間、TBSTで開催その後、TBSTでスライドを洗浄します。
  6. 15分間インキュベートし、各スライド上のアビジン溶液の代わりに一滴。
  7. 5分間、TBSTで開催その後、TBSTでスライドを洗浄します。
  8. 15分間インキュベートし、各スライドにビオチン溶液の代わりに一滴。
  9. SLIすすぎTBSTでデ、その後5分間、TBSTで配置します。
  10. 4で200μlのTBST中κアイソタイプコントロールマウス抗B7-H1モノクローナル抗体（クローン5H1）またはマウスIgG1の1:1000希釈でスライドをインキュベート℃で22時間+ / - のC一晩 - 1時間。 TBST中で最終的な抗体濃度が2.57μg/ mLである。
  11. 5分間、TBSTで開催その後、TBSTでスライドを洗浄します。二回繰り返します。
  12. 30分間1:500濃度（200μlの2％ヤギ血清溶液中）でビオチン結合ラット抗マウスIgG1二次抗体を用いてスライドをインキュベートする。
  13. 5分間、TBSTで開催その後、TBSTでスライドを洗浄します。二回繰り返します。
  14. 15分間インキュベートし、各スライド上のストレプトアビジン - ビオチン複合体の場所は1滴（使用前に少なくとも30分を準備しなければなりません）。
  15. 5分間、TBSTで開催その後、TBSTでスライドを洗浄します。二回繰り返します。
  16. 4分間インキュベートし、各スライド上の増幅試薬の代わりに1滴（TBSTで2:1に希釈したもの）。
  17. TとスライドをすすぐBSTは、その後5分間TBSTで配置します。二回繰り返します。
  18. 15分間インキュベートし、各スライド上のストレプトアビジン-H​​RPの代わりに一滴。
  19. 5分間、TBSTで開催その後、TBSTでスライドを洗浄します。二回繰り返します。
  20. 場所は1つ各スライドの3,3 - ジアミノベンジジン（DAB）基板とクロモゲンのドロップと2分間発色する。
  21. すぐに発色した後、1〜2分間ddH 2 Oでスライドを洗浄します。
  22. 90秒のヘマトキシリン​​1滴でスライドをインキュベートする。
  23. 1〜2分間ddH 2 Oで洗浄します。
  24. 1〜2分間石鹸水道水で洗ってください。
  25. 1〜2分間ddH 2 Oで洗浄します。

4。脱水および取り付け

  1. 3分間80％エタノール中でスライドを浸す。
  2. 3分間95％エタノール中でスライドを浸す。
  3. 5分間100％エタノールにスライドを浸す。繰り返します。
  4. 5分間キシレンにスライドを浸す。繰り返します。
  5. 一滴を追加スライドとカバースリップ場所にCytoseal 60。

表1は、上記の手順で使用する試薬。

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結果

B7-H1の成功した免疫組織化学的染色は、膵臓腺癌におけるB7-H1（茶色信号のDAB発色）の異種発現を実証します。他の人がB7-H1またはB7-H1（ 図2、図3）を少し表現のいずれかの主に細胞質発現を持っているのに対し、一部の膵臓腺癌細胞がB7-H1の主に膜状の発現（ 図1A）を持っています。通常の膵管上皮は少しB7-H1（ 図4）を発現する 。代わりに抗B7-H1抗体のマウスIgG1κアイソタイプコントロール抗体で染色すると、少しバックグラウンド染色（ 図1B）を示しています。

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図1。抗B7-H1とA.免疫組織化学的染色は、クローン5H1抗体は、...

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ディスカッション

凍結切片上のB7-H1の免疫組織化学的染色は、癌3,4の様々な先行研究で報告されている。しかし、臨床腫瘍サンプルは、通常、パラフィン包埋ブロックの形で提供されています。 5H1モノクローナル抗体は、より最近に正常腎細胞癌、子宮頚癌、膀胱癌、悪性黒色腫13から18を含むパラフィン包埋腫瘍組織の染色に応用されてきた。パラフィン包埋9,19または他のモノクローナル抗体を用いた膵臓腺癌組織のクライオスタット20節で、B7-H1の染色も報告されている。ここでは、B7-H1へ5H1モノクローナル抗体を用いたパラフィン包埋された膵臓腺癌組織の正常な染色を示した。膵臓腺癌におけるB7-H1の発現は、メラノーマ4,21などの悪性腫瘍の多くの他のタイプと同様、不均一である。 B7-H1 arの膜と細胞質の両方の式eは腺癌細胞（ 図1と図2）を用いて観察。 B7-H1の膜式は、その生物学的機能と一貫性があります。腫瘍組織におけるB7-H1細胞の役割が検討されていない。通常の膵管上皮または腺細胞（ 図4...

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開示事項

特別な利害関係は宣言されません。

謝辞

EBは、KMB、とHXは均等に貢献しています。本研究では、消化器癌P50 CA062924、NIHのK23 CA148964、ラストガーテン財団、Viragh財団、ASCOの若手研究者賞は、NIH 5T32 CA0090701-28トレーニンググラント、ソルゴールドマン膵臓癌センター、国立膵臓FoundationのNCIの胞子によってサポートされていました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名称 会社 カタログ番号 注釈
CSAシステムダコ K1500 ペルオキシダーゼブロック、ストレプトアビジン - ビオチン複合、増幅試薬、ストレプトアビジン-H​​RPおよびDAB基質とクロモゲン：プロトコルに記載されている以下の試薬が含まれています
アビジン/ビオチンブロッキングキットベクトル SP-2001
ブロックエース Serotec社 BUF029
ビオチン抗マウスIgG1 BD 553441
マウスIgG1 Kアイソタイプコントロール eBioscience社 14-4714-85
TBS（トリス緩衝生理食塩水）、10X Cellgro 46から012-CM 10xTBSは80g / LのNaClおよび24.2 g / LのTIRを含んでいます。
洗浄用ddH2Oで1Xに希釈;
ツイーン20 シグマアルドリッチ P1379 1ミリリットルはTBSTを作るために1X TBSの1Lに加え
ターゲット検索、20X Celerusウェーブ 014-3000-000 ddH 2 Oで1倍に希釈し
190プルーフエチルアルコール Pharmco-Aaper 111000190
200プルーフエチルアルコール Pharmo-Aaper 111000200
キシレン VWR 95057-827
ヘマトキシリンリチャード·アラン·サイエンティフィック 72804
Cytoseal 60 リチャード·アラン·サイエンティフィック 8310から4
カバースリップコー​​ニング 2940-245
湿度室シグマ H6644
表1試薬と機器。

参考文献

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