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Summary

グリーンモンスターメソッドは、緑色蛍光タンパク質をコードするレポーター遺伝子でマークされた複数の削除を迅速に組み立てることができます。このメソッドは、性的失の品揃えや、その他の欠失を保有する細胞の蛍光ベースの濃縮の繰り返しサイクルを通して酵母菌株を駆動に基づいています。

Abstract

遺伝子欠失のための表現型は、しばしば突然変異が特定の遺伝的背景や環境条件^1,2でテストされているときにのみ明らかにされています。多くの遺伝子が隠された遺伝子の機能^{3,4のマスクを解除}するために削除する必要がある例があります。重要な発見の可能性にもかかわらず、3つ以上の遺伝子が関与する遺伝的相互作用は、主に未踏されています。マルチ変異体の相互作用の網羅的な検索が欠失の可能な組み合わせの膨大な数のために現実的ではありません。しかし、このような共通機能を共有することの大きいアプリオリの確率でパラログのセットなどの遺伝子の選択セットの研究は、有益であろう。

酵母 Saccharomyces cerevisiaeにおいて、遺伝子ノックアウトは、相同組換えを介した選択マーカーと遺伝子を交換することによって達成されます。マーカーの数が限られているので、このメソッドでは、SAMを削除し、再利用のために開発されている電子マーカー^{5,6,7,8,9,10。}時間が生成される削除の数に比例して直線的に必要なので、これらのメソッドを使用して順次工学複数の変異は時間がかかります。

ここでは、日常的に酵母¹¹に複数の削除を工学のためのグリーンモンスター方法を説明します。この方法では、削除に統合された緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーターが定量的に各菌株に含まれる削除の数（ 図1）に記載の菌株にラベルを付けるために使用されています。これらの欠失の多くを運ぶ株のフローサイトメトリー濃縮と相まって酵母の接合と減数分裂を経由して、GFP-著しい失の品揃えの繰り返しラウンドは株の欠失（ 図2）の蓄積につながる。各プロセスがラウンドごとに1つ以上の欠失を組み込むとともに、並行して複数のプロセスを実行し、ひずみ建設に必要な時間が短縮されます。

GFPの削除された遺伝子座でのレポーターや"ツールキット"座·どちらグリーンモンスターGMToolkitまたは少なくともGMToolkit-αの1を運びそれぞれのコンテンツは、 ">と呼ばれる最初のステップは、半数体、単変異体を作製することは'ProMonsters、' can1Δ軌跡（ 図3）酵母削除コレクション¹²から菌株を用い、GFP顕著な欠失が便利なユニバーサルGFPでこれらの株に存在する共通のKanMX4カセット交換することによって生成することができます- URA3断片を各GMToolkitが含まれています。どちらか-またはα接合型特異半数体選択マーカー¹とその2つのマーカーのちょうど1つ、両方GMToolkitsが存在する場合に、一括して二倍体の選択を可能にする。

第二段階は、欠失遺伝子座がランダムな組み合わせ、および/または減数recombにより単一細胞内で組み合わせることができるような性的サイクリングを実施することである交配と胞子形成の各サイクルを伴うもののみ。

Protocol

1。 ProMonstersの世代 テト2-GFPマーカーおよび配列を有するプライマーを用いてプラスミドpYOGM012（アンピシリン耐性）からURA3マーカーを増幅することによって、普遍的なGFPの交換用カセットを準備します。 GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCGとGGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC GTACCGGGTAATAACTGATATAAT（太字の地域をターゲットに交換できKanMX4カセットの隣接領域との相同性を提供してください）。 PCR反応は、0.5 ng /μLののテンプレートDNA濃度で始まるPhusionポリメラーゼは、HFバッファ、および3％ジメチルスルホキシド（New England Biolabs）で行われるべきである。 PCRプログラムは98 10秒30秒、98℃35サイクル℃で、49℃で30秒のC、1.5分間72℃である。反応容量は、各形質転換実験に十分なDNAを提供すること>を50μlにする必要があります。私たちは、浄化製品には、列ごとに処理PCR反応の〜50μlでQIAクイックPCR精製キット（Qiagen）を用いますが、精製工程を省略すると、形質転換体の収量を増加させることができる。 あるいは、制限酵素EcoRI（New England Biolabs）を用いてプラスミドpYOGM057（アンピシリン耐性）を消化することによって、標的テト2-GFPおよびKanMX4の相同URA3マーカーと同様、領域を含む断片を放出。この反応におけるDNA濃度は約30 ng /μlにする必要があります。反応容量は> 34μLである必要があります。 KanMX4以外の領域にGFPのカセットを統合するための、適切な相同配列に上記のPCRプライマーの相同領域を調整します。 ユニバーサルGFPの削除カセットでKanMX4酵母ノックアウトコレクション12からA-ハプロイド株を形質転換。のウッズとGietz 13 0.34μlを別のプロトコルに続いてDNAサンプル（精製されたPCR産物または非精製制限消化）は、各形質転換実験に使用されるべきです。 CAA-裏プレートに形質転換混合物（0.67％酵母窒素ベース、2％グルコース、0.6％カザミノ酸、0.0025％アデニンヘミ、0.005％トリプトファン、2％寒天）のプレート5分の1。 単離されたコロニーを得るために新鮮なCAA-浦プレート上で形質転換体のうちストリーク。 成長の欠如を確認するために200μg/ mlのG418を含むYPDAプレート上にコロニー由来の細胞を移す。成功したGFPの統合​​を確認するには、手順（1.5）に従う – （1.9）コロニーPCRを行う。 0.2 mlのPCRチューブや96ウェルプレートのウェルに溶解緩衝液2μl（0.1Mリン酸ナトリウム、pH 7.4、ZymoResearchから1ユニットザイモリアーゼ）にコロニーから採取された細胞を追加します。ピペットチップの内と外液をピペッティング。 P200ピペットマン（ギルソン）を使用してミネラルオイルを1滴（約20μL）をオーバーレイ。 37℃で混合物をインキュベート95℃で20分、その後のC℃で10分間。 50μlの水で溶解液を希釈します。 10回inとoutソリューションをピペッティングして混和します。 上流の隣接領域にアニールは、シーケンスCCTGAGAAAGCAACCTGACC（カセットの先頭から285 bp）のプライマーと組み合わせること、（A）フォワードプライマーと10μlのPCR反応を用いてライセート1μlを、（B）の逆を分析プライマーその一連GCATTGGGTCAACAGTATAG（端から375 bp）のプライマーと対下流領域にアニール（C）の二つの配列がCGTACTCCTGATGATGCATGと（181 bp）のGACGAAATACGCGATCGCTGとKanMX4にアニールするプライマー、及び（D）は、2つのプライマーをその標的遺伝子の野生型配列（ 図4）にアニールする。削除コレクションで株の約8％が14異数性を含むことが知られているので、（D）は重要です。正しい形質転換体は、正の（A）と（B）と（C）と（D）と負になります。 紹介する形質転換にGMToolkitは、形質転換株および1.6 mlのエッペンドルフチューブにRY0146（GMToolkit含有）またはRY0148（GMToolkit-αを含む）のいずれかの250,000個の細胞から約250,000個の細胞を追加します。渦。 RY0146 RY0148との遺伝子型はMATαlyp1Δhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0met15Δ0can1Δ:: GMToolkit-[CMVpr-rtTA KanMX4 STE2pr-SP-his5]とMATαlyp1Δhis3Δ1leu2Δ0ura3Δ0met15Δ0can1Δ:: GMToolkit-α[CMVpr-rtTA NatMX4 STE3pr·アールLEU2]、それぞれ。 prはプロモーターを意味する。細胞数は、前培養物の光学密度から推定されるべきである。 2分間、800×gで遠心分離します。 上清を取り除きます。 空気交換を可能にするために、70％エタノールで処理した画鋲を使用して蓋に穴を開ける。 YPDA培地（1％酵母エキス、2％ペプトン、2％グルコース、および0.003パーセントアデニンhemisulfat50μlを追加e）に示す。渦。 5分間800×gで遠心分離します。 湿ったボックスにチューブを置きます。これは、空のチップボックス、小さなチップスタンド、湿らせたペーパータオルを使用して作成できます。 30℃で一晩ボックスをインキュベート℃に第一は、CAAの浦プレート上の細胞をストリーキングで交尾二倍体を選択してください。 1日のために30℃で静置します。 二倍体を選択するための200μg/ mlのG418を含むYPDAプレート上で単離されたコロニー（1％酵母エキス、2％ペプトン、2％グルコース、0.003％アデニンヘミ、2％寒天）を作るためにバルク領域、ストリークからそれらを細胞を取り出す含むGMToolkit-GMToolkit-αを含む二倍体を選択するか、または100μg/ mlのnourseothricin（NAT）15。 3日間30℃で静置します。 隔離されたコロニーから始めて、寒天培地（1％酵母エキス、3％ディフコ栄養ブイヨン、5％ブドウ糖なしでGNA培地500μlに細胞の大部分を移す。オートクレーブグルコースとtの残り彼のコンポーネントは別々としてふたが付いている5mlの培養管でカラメル化を避けるために、2×ソリューション）を緩めた。 30℃で5時間、水平管を回転℃に回転軸は、管の長手方向軸に平行である必要があります。 で使用されているコロニーを確認して（1.21）裏は、+ CAA-裏板の上にそれらをストリーキングで。 2分間、800×gでチューブを遠心分離します。上清を捨てる。 最小限の胞子形成培地（;フィルター滅菌を1パーセント酢酸カリウム、0.005％酢酸亜鉛）500μlを添加する。渦。 2分間、800×gでチューブを遠心分離します。上清を捨てる。 リピート（1.25） – （1.26）倍。 7.5μg/ mlのリジン、7.5μg/ mlのロイシン、5μg/ mlのヒスチジン、5μg/ mlのメチオニン、および1.25μg/ mlのウラシル（栄養要求株の胞子形成率を高めるために）を補充した最小限の胞子形成培地1mlを追加。渦。 1日室温でチューブを回転させます。 2日間30℃でチューブを回転させます。 2分間800 xgで1.6 mlのエッペンドルフチュー​​ブに、この混合物の125μLを遠心分離します。上清を捨てる。 ザイモリアーゼ溶液（100mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH7.4、1Mソルビトール、及びZymoResearchからザイモリアーゼ2単位）の50μlを添加する。ピペットチップの内と外液をピペッティング。 1時間30℃でインキュベートする。 0.02％NP-40の50μlを添加する。ピペットチップの内と外液をピペッティング。 5分間室温でチューブのままにしておきます。 水500μlを添加する。 チューブを氷上に置きます。 ソニファイアー450（ブランソン）と3.2 mmのマイクロチップを使用して15秒に1の出力設定（最弱設定）で二回、この混合物を超音波洗浄します。超音波処理の2ラウンドの間、〜0℃に温度を戻すためにチューブを氷上に置く 5分間、800×gで遠心する。上清を捨てる。 SC-裏彼を200μl加え（a）またはクロスGMToolkitまたはGMToolkit-αを組み込むためのものであるかに応じて、SC-裏レイ（α）の媒体。メディアを準備するには、SC – 裏のHisレイ培地（0.67％酵母窒素ベース、2％グルコース、0.01％アルギニン0.01％、アスパラギン酸、0.01％グルタミン酸、0.01％イソロイシン0.01％、リジン、メチオニン0.01パーセント作る、0.01％フェニルアラニン、0.08％セリン、0.04％トレオニン、0.002％チロシン、0.03％バリン、0.0025％アデニン、0.005％トリプトファン、0.003％アデニン、0.005％トリプトファン）および滅菌ヒスチジンまたはロイシンでそれを補うために、使用前に最終濃度0.01％になる。 70％エタノールで処理した画鋲を使用して蓋に穴をあけます。 2日間30℃で水平にチューブを回転させます。回転軸は、管の長手方向軸に平行である必要があります。 SC-裏彼またはSC-裏レイ寒天プレート（上記と同じ成分を加えた2％寒天上の細胞外ストリークは、トレオニンとアスパラギン酸の後に追加する必要がありutoclaving; ProMonster株の単離されたコロニーを作るために）注ぐ前にヒスチジンまたはロイシンを追加します。 2。性的サイクリング SC-HIS（）または°Cで一晩1.6 mlエッペンドルフチューブを用いて30℃で交配型に応じて、SC-レイ（α）を100μlの確立されたGFPの欠失株の培養物を回転させます。空気交換のために、70％エタノールで処理した画鋲を使って穴を開ける。水平チューブを回転させます。回転軸は、管の長手方向軸に平行である必要があります。 大挙して交配を介して複数の株を横断することが可能です。ソートされたサンプルは、直接2日間30℃で200μlのこの目的は、培養細胞に使用される場合。 SC-裏のHis-Leuの媒体へとヒスチジン（0.01％）またはロイシン（0.01％）：培地を調製し、ウラシル（0.0025％最終濃度）を追加します。 1.6ミリリットルEPPEで250,000半数体細胞とGFP欠失株25万のα-半数体細胞を混ぜるndorfチューブ。渦。 （1.17） – 次の手順（1.11）によって、これらの細胞を交配。 緩め蓋を5mlの培養チューブに200μg/ mlのG418および100μg/ mlのナットを含む500μlのGNAの媒体に交配混合物10μlを転送します。出発OD 600がおよそ0.1である。 24時間30℃で培養を回転させます。 GMToolkit-αのGMToolkitとNatMX4でKanMX4両方を含む唯一の二倍体は、G418およびNAT（ 図3）の存在下で増殖することができるので、これは二倍体の選択を可能にする。 G418とナットを含む新鮮なGNAの500μlに1日間培養液20μlを転送します。出発OD 600がおよそ0.2である。 対数期（〜1のOD 600）にセルを持って来るために5時間30℃でチューブを回転させます。 二倍体の胞子形成と胞子を分離するために（1.38） – ステップ（1.24）に従ってください。 2つの300-μLに胞子形成細胞の懸濁液を分割部品と別の1.5 mlのエッペンドルフチュー​​ブにそれぞれを置く。 5分間、800×gで遠心する。上清を捨てる。 1チューブのペレットに、-半数を選択するには、SC-Hisを100μlの培地を追加します。他のチューブのペレットには、α-半数を選択するために、SC-Leuの培地100μlを添加する。 30℃で一晩チューブを回転させます。最終OD 600が 0.5未満でなければなりません。 OD 600が高くなりすぎる場合は、室温で培養することを試みる。 GFPを誘導するために、新鮮なSC-HIS（）または20μg/ mlのドキシサイクリンを含むSC-レイ（α）を100μlの培地を追加します。ドキシサイクリンの最終濃度は10μg/ mlである。渦。 2日間30℃でチューブを回転させます。 3。フローサイトメトリーキャップを5 mlのポリプロピレンチューブ（BDファルコン＃352063）に10μg/ mlのドキシサイクリンを含む事前にフィルタ処理されたTEバッファー900μlの液（pH 7.5）を入れると交換セル5 mLのポリスチレンチューブからストレーナーキャップ（BDファルコン＃352235）。ポリプロピレンチューブは、フローサイトメトリーに適しています。ストレーナーキャップは大きい粒子を除去するために望まれている。 優しくセルストレーナーキャップのドキシサイクリンをTE緩衝液75μlを置く。 キャップで解決策に誘導された細胞の25μlを添加する。 メッシュに対してピペットマンの先端を押しながら、ストレーナーを通して統合ソリューションのすべてを撃つ。 ストレーナのキャップを押し下げて、ボルテックスチューブ。 SC-HisまたはSC-Leuの200μlでフィルされたコレクションチューブ（1.6 mlのエッペンドルフチュー​​ブ）を用意します。 セルソーターを起動し、メーカーの説明書に従って設定を調整します。 渦両方コレクションチューブ（コートに媒体と壁）とセルソーターにそれらをロードする前に細胞が入ったチューブ。 サンプルのフローサイトメトリーデータを取得する。 GFPを含有していない株はネガティブコントロールすることができます。 並べ替えのためにゲートを描きます。 （）高いGFPの強度を発揮することができる細胞凝集を避けるために、FSCの高さのプロットとFSCを用いたパルス幅とパルス高MoFloソーター用または不釣り合いに小さいFSCの高さのプロットを用いて前方散乱（FSC）のために過度に大きなパルス幅の外れ値を破棄FACSAriaセルソーター（ 図5、左上のパネル）の領域。 （B）は大FSC（面積）を細胞凝集のために期待されているので、最低FSCおよび側方散乱（SSC）の細胞破片が頻繁に発見された値を使用して領域を回避しながら、唯一、FSCで下位20％に細胞を取る（ 図5、右上のパネル）。 （C）は、SSC（面積）とGFPシグナルは（面積）は、多くの場合、正の相関がある。単に上記ゲート与えられた最も明るい細胞を取っているので、高SSCの値を持つ細胞を濃縮するでしょう、各点から明るい細胞の同様の比率を取るために、GFP強度およびSSCのプロットを用いて人口の周囲に沿ってゲートを描くSSCの軸（ 図5、ボットのOM-左図）。 （C）で選択された集団は、（B）で選択された人口の0.1から1パーセントでなければなりません。 （3.10）で与えられた基準とコレクションチューブに200個の細胞をソートします。必要に応じて一斉にプロセスについてや、より複雑な人口を必要とする他のプロジェクトのために、より多くの細胞をソートします。 渦コレクションチューブを培地で選別された細胞をカバーする。 プレートジェノタイピング用YPDAプレート上の細胞のサブセット（例えば、50セル）。 2日間30℃で静置します。 （1.8） – ステップ（1.5）以下〜12個のコロニーのための溶解液を作る。 そっと先端を持つプレートに触れることにより、G418およびNATを含むYPDAプレート上のスポットにで使用されるチップ（1.5）上の残りの細胞を移す。選択された半数は、この板の上に育つべきではありません。二倍体はもっとGFPのコピーを持っていることがあるため、明るくなるかもしれません。このテストでは、半数体選択の効率を示すことができます。 タイピングについては、10μlのPCR rを用いてライセート1μlを分析するシーケンスCCTGAGAAAGCAACCTGACCのプライマーと対になって削除された各遺伝子の上流隣接領域にアニールすることをフォワードプライマーとeaction。 可能であれば、多重PCR反応（条件は単一の変異体の溶解液を用いて決定することができる）。または384ウェルフォーマット – PCRは96で行うことができます。後者の形式は、わずか5μlの反応容量に適しています。マルチチャンネルピペットまたは液体ハンドリングロボットを用いて行うことができるPCRマスターのアレイ化するプライマー及びこれらの混合物に、細胞溶解物のほかに異なるミックス。異なるPCRミックスに同じライセートを追加するときにチップの変更は省略可能です。 PCR産物を分析します。ジェルXLウルトラV-2の電気泳動システム（Labnet）は、マルチチャンネルピペットを用いて試料のローディングと互換性があります。 からの情報（3.16）と（3.18）をもとに、遺伝子型を希望している可能性半数体を識別します。 新鮮なプレート（YPDA、CAAの浦、またはSC-Ura-His/Leu）にこれらの株を確立します。また、それらの凍結-80℃で25％グリセロール℃、そのような削除された遺伝子およびパルスフィールド·ゲル電気泳動のための野生型配列の有無の確認などの追加テストが推奨されています。 有用菌株と（2.1）から性的サイクルを繰り返します。

Representative Results

4、GFP-著しい欠損を（ycl033cΔyer042wΔykl069wΔyol118cΔ）を運ぶのa-ハプロイド株は4失を運ぶのα-ハプロイド株と交配したとき（ycl033cΔydl242wΔydl227cΔyer042wΔ）、2つの欠失を持つ（ycl033cΔyer042wΔ）2系統、代表で共有結果が得られた。交配混合物は、二倍体を選択するには、G418およびNATを含むYPDA培地で培養した。結果として二倍体は、胞子形成培地で培養した。胞子?…

Discussion

我々はグリーンモンスターアプローチを開発したように、我々は、ゲノム再編成につながる、異なるGFPの交換カセット間の組換えの可能性に関心を持っていた。このような事態を軽減することに成功交配と減数分裂の複数のラウンドを受けた細胞のための私達の選択である。再配列ゲノムを持つ細胞は、同一の再調整なしに細胞に交配後少なくフィットすることが期待されています。実際、?…

Materials

Name of the reagent or instrument	Company	Catalogue number	Comments (optional)
G418	Sigma-Aldrich	A1720	Dissolve in water and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 200 mg/ml. Store at 4 °C.
ClonNAT (nourseothricin)	WERNER BioAgents	5001000	Dissolve in water and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 100 mg/ml. Store at 4 °C.
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891	Dissolve in 50% ethanol and filter-sterilize (0.2-μm filter). Stock concentration: 10 mg/ml. Make fresh every four weeks. Shield from light using aluminum foil and store at 4 °C.
Zymolyase	ZymoResearch	E1005
Difco yeast nitrogen base w/o amino acids	BD	291940
Revolver (rotator for tubes)	Labnet	H5600
Enduro Gel XL electrophoresis unit	Labnet	E0160
Sonifier 450	Branson	101-063-198
Microtip for Sonifier 450	Branson	101-148-062
FACSAria cell sorter	BD
MoFlo cell sorter	Beckman-Coulter
Biomek FX or equivalent robot	Beckman Coulter		Optional. For setting up genotyping PCRs.