複数の遺伝子欠失を持つ酵母菌株の世代のためのグリーンモンスタープロセス

サマリー

グリーンモンスターメソッドは、緑色蛍光タンパク質をコードするレポーター遺伝子でマークされた複数の削除を迅速に組み立てることができます。このメソッドは、性的失の品揃えや、その他の欠失を保有する細胞の蛍光ベースの濃縮の繰り返しサイクルを通して酵母菌株を駆動に基づいています。

要約

遺伝子欠失のための表現型は、しばしば突然変異が特定の遺伝的背景や環境条件^1,2でテストされているときにのみ明らかにされています。多くの遺伝子が隠された遺伝子の機能^{3,4のマスクを解除}するために削除する必要がある例があります。重要な発見の可能性にもかかわらず、3つ以上の遺伝子が関与する遺伝的相互作用は、主に未踏されています。マルチ変異体の相互作用の網羅的な検索が欠失の可能な組み合わせの膨大な数のために現実的ではありません。しかし、このような共通機能を共有することの大きいアプリオリの確率でパラログのセットなどの遺伝子の選択セットの研究は、有益であろう。

酵母 Saccharomyces cerevisiaeにおいて、遺伝子ノックアウトは、相同組換えを介した選択マーカーと遺伝子を交換することによって達成されます。マーカーの数が限られているので、このメソッドでは、SAMを削除し、再利用のために開発されている電子マーカー^{5,6,7,8,9,10。}時間が生成される削除の数に比例して直線的に必要なので、これらのメソッドを使用して順次工学複数の変異は時間がかかります。

ここでは、日常的に酵母¹¹に複数の削除を工学のためのグリーンモンスター方法を説明します。この方法では、削除に統合された緑色蛍光タンパク質（GFP）レポーターが定量的に各菌株に含まれる削除の数（ 図1）に記載の菌株にラベルを付けるために使用されています。これらの欠失の多くを運ぶ株のフローサイトメトリー濃縮と相まって酵母の接合と減数分裂を経由して、GFP-著しい失の品揃えの繰り返しラウンドは株の欠失（ 図2）の蓄積につながる。各プロセスがラウンドごとに1つ以上の欠失を組み込むとともに、並行して複数のプロセスを実行し、ひずみ建設に必要な時間が短縮されます。 GFPの削除された遺伝子座でのレポーターや"ツールキット"座·どちらグリーンモンスターGMToolkitまたは少なくともGMToolkit-αの1を運びそれぞれのコンテンツは、 ">と呼ばれる最初のステップは、半数体、単変異体を作製することは'ProMonsters、' can1Δ軌跡（ 図3）酵母削除コレクション¹²から菌株を用い、GFP顕著な欠失が便利なユニバーサルGFPでこれらの株に存在する共通のKanMX4カセット交換することによって生成することができます- URA3断片を各GMToolkitが含まれています。どちらか-またはα接合型特異半数体選択マーカー¹とその2つのマーカーのちょうど1つ、両方GMToolkitsが存在する場合に、一括して二倍体の選択を可能にする。

第二段階は、欠失遺伝子座がランダムな組み合わせ、および/または減数recombにより単一細胞内で組み合わせることができるような性的サイクリングを実施することである交配と胞子形成の各サイクルを伴うもののみ。

プロトコル

1。 ProMonstersの世代

1. テト_2-GFPマーカーおよび配列を有するプライマーを用いてプラスミドpYOGM012（アンピシリン耐性）からURA3マーカーを増幅することによって、普遍的なGFPの交換用カセットを準備します。
   GGATCCCCGGGTTAATTAAGGCGCGCCAGATCTGTTTAGCTTGCC CAAGCTCCTCGAGTAATTCGとGGCGTTAGTATCGAATCGACAGCAGTATAGCGACCAGCATTCAC GTACCGGGTAATAACTGATATAAT（太字の地域をターゲットに交換できKanMX4カセットの隣接領域との相同性を提供してください）。 PCR反応は、0.5 ng /μLののテンプレートDNA濃度で始まるPhusionポリメラーゼは、HFバッファ、および3％ジメチルスルホキシド（New England Biolabs）で行われるべきである。 PCRプログラムは98 10秒30秒、98℃35サイクル℃で、49℃で30秒のC、1.5分間72℃である。反応容量は、各形質転換実験に十分なDNAを提供すること>を50μlにする必要があります。私たちは、浄化製品には、列ごとに処理PCR反応の〜50μlでQIAクイックPCR精製キット（Qiagen）を用いますが、精製工程を省略すると、形質転換体の収量を増加させる....

結果

4、GFP-著しい欠損を（ycl033cΔyer042wΔykl069wΔyol118cΔ）を運ぶのa-ハプロイド株は4失を運ぶのα-ハプロイド株と交配したとき（ycl033cΔydl242wΔydl227cΔyer042wΔ）、2つの欠失を持つ（ycl033cΔyer042wΔ）2系統、代表で共有結果が得られた。交配混合物は、二倍体を選択するには、G418およびNATを含むYPDA培地で培養した。結果として二倍体は、胞子形成培地で培養した。胞子はザイモリアーゼ治療、超音波処理により分散させ、半数選択培地で発芽させた。次いで、細胞を、GFPを発現するように誘導した。フローサイトメーターでゲートを使用して、細胞の集団は、残骸や細胞凝集体（ 図5）が含まれている可能性は低いことを選択しました。この集団内では、細胞の最も明るい1％がソートされています。選別された細胞とソートされていない細胞は遺伝だった彼らはプレート上のコロニーを形成した後に入力した。ランダムに選択されたコロニーは、いくつ.......

ディスカッション

我々はグリーンモンスターアプローチを開発したように、我々は、ゲノム再編成につながる、異なるGFPの交換カセット間の組換えの可能性に関心を持っていた。このような事態を軽減することに成功交配と減数分裂の複数のラウンドを受けた細胞のための私達の選択である。再配列ゲノムを持つ細胞は、同一の再調整なしに細胞に交配後少なくフィットすることが期待されています。実際、我々は、GFPカセット¹¹との間の組換えに起因するいかなるゲノム不安定性を観察しなかった。しかし、我々はこの可能性を完全に除外することはできませんので、ユーザーが再配置のために生成された菌株をテストすることをお勧めします。パルスフィールドゲル電気泳動は、総異常を検出するために使用することができます。削除内の配列にアニールするプライマーを用いてPCRを野生型配列の有無を確認するために使用できます。

GF、確立された菌株の蛍光レベルに基づいて、Pの強度は飽和が1〜16の欠失¹¹のテストした範囲内の問題ではないことを示唆している、削除の数とほぼ直線的な関係を持っていた。しかし、多くの非重複欠失を.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬や器具の名前	会社	カタログ番号	コメント（オプション）
G418	シグマアルドリッチ	A1720	（0.2μmフィルター）を水に溶解し、フィルター滅菌してください。ストック濃度：200 mg / mlである。 4℃で保存する
ClonNAT（nourseothricin）	ヴェルナー生体物質	5001000	（0.2μmフィルター）を水に溶解し、フィルター滅菌してください。ストック濃度：100 mg / mlである。 4℃で保存する
ドキシサイクリン	シグマアルドリッチ	D9891	50％エタノールに溶解し、フィルター滅菌（0.2μmフィルター）。ストック濃度：10 mg / mlである。 4週間ごとに新鮮なことを確認します。 4でアルミ箔とストアを使用して光からシールド℃の
ザイモリアーゼ	ZymoResearch	E1005
Difco酵母窒素ベースW / Oアミノ酸	BD	291940
リボルバー（チューブ用回転子）	Labnet	H5600
エンデューロジェルXLの電気泳動装置	Labnet	E0160
ソニファイアー450	ブランソン	101-063-198
ソニファイアー450用マイクロチップ	ブランソン	101-148-062
FACSAriaセルソーター	BD
MoFloセルソーター	ベックマン·コールター-
Biomek FXまたは同等のロボット	ベックマン·コールター		オプション。ジェノタイピングPCRを設定するため。