内向き整流カリウムチャネルの小分子モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Summary

内向き整流カリウム（KIR）ハイスループット化合物スクリーニングのためのチャネルの活性を測定するための定量的な蛍光アッセイを開発し、検証するための方法が提示されます。

Abstract

内向き整流カリウム（KIR）チャネルファミリーの特定のメンバーは、高血圧、心房細動、疼痛^1,2を含む様々な疾患のために創薬ターゲットを想定しています。しかし、ほとんどの場合、それらの治療法としての可能性、あるいは基本的な生理機能を理解するための進捗状況は良い薬理学的ツールの不足により減速されています。確かに、内向き整流ファミリーの分子薬理学は、ナノモル親和性のための番号電位依存性カリウム（KV）チャネルのS4スーパーファミリーのそれより大幅に遅れていると選択性の高いペプチド毒素変調器は^3が発見されました。ハチ毒毒素tertiapin及びその誘導体は、Kir1.1とKir3チャネル^4,5の強力な阻害剤であるが、ペプチドは実験だけでなく、治療的に使用が制限され、その抗原特性と貧しい生物学的利用能、代謝安定性、組織浸透度に起因しています。強力の開発改良された薬理学的特性を有する選択的低分子プローブは、完全にキールチャネルの生理機能と治療の可能性を理解するための鍵となるでしょう。

学術、科学者がより良い薬理⁶必要としている分子標的とするシグナル伝達経路のためのプローブディスカバリキャンペーンを開始するために、米国立衛生研究所によってサポートされて分子ライブラリプローブプロダクションセンターネットワーク（MLPCN）は、衛生研究所（NIH）の共通基金の機会を作成しています。 MLPCNは、業界規模スクリーニングセンターや医薬品化学研究者にアクセスを提供し、インフォマティクス、遺伝子や遺伝子ネットワークの機能を解明する小分子プローブを開発するためにサポートしています。 MLPCNにエントリを得るための重要なステップは、ハイスループットスクリーニング（HTS）に適している堅牢なターゲットまたは経路特異的アッセイの開発である。

ここでは、蛍光ベースのタリウム（Tl ^+）フラックスASSAを開発する方法について説明しハイスループット化合物スクリーニングのための^7,8,9,10キールチャネル機能のy。アッセイは、Kの透過性K ⁺同族TLにチャンネル孔⁺に基づいています。市販の蛍光TL ⁺レポーター色素が細孔を通過Tlの貫通フラックス⁺を検出するために使用されます。 ^{BTC、FluoZin-2、7,8} FluxOR：TL ⁺フラックスアッセイに適している少なくとも3市販の染料があります。このプロトコルはFluoZin-2を用いたアッセイの開発について説明します。もともと亜鉛指標として開発·販売していますが、FluoZin-2展示Tlの時に蛍光発光⁺結合で堅牢かつ用量依存的に増加。 FluxORは^7,8使用可能だったので^9,10を行うために続けている前に、我々はFluoZin-2で働き始めた。しかし、彼らの特定のnに最も適した染料アッセイ開発の手順は、すべての3つの色素について本質的に同一であるため、ユーザーは判断する必要がありますeeds。またMLPCNへのエントリーのために考慮されることで合意されている必要がありアッセイの性能ベンチマークを議論する。 TL ^+は容易^にほとんどのK ⁺チャネルに浸透しているので、このアッセイは、ほとんどのK ⁺チャネルターゲットに適応する必要があります。

Protocol

1。安定したポリクローナル細胞株の作製

1. 興味のあるキールチャネルを発現している高品質の安定した細胞株の確立は、堅牢なハイスループットスクリーニングアッセイの開発に向けた重要な第一歩である。構成性K ⁺チャネルの過剰発現は細胞死の経路、安定細胞株の変性とアッセイ性能の損失の活性化につながることができます。 （下記参照）は、これらの潜在的な問題を回避し、アッセイ開発のための便利な内部統制を実現するために、テトラサイクリン誘導発現系は^、8をお勧めします。
2. 文化のB培地（10％FBS、50 U / mlペニシリン、50μg/ mlのストレプトマイシン及び5μg/ mlのブラストサイジンSを含有するDMEM増殖培地）で、標準的な技術を使用して、親のT-REX-HEK293細胞を。トランスフェクションし、安定なクローンの選択のために早期の継代細胞（液体窒素貯蔵から解凍から例えば 3から4までの通路）を使用します。
3. 内板4万t-REX-HEK293細胞75cm ²フラスコフラスコので、次の日の約80％コンフルエントであること。 37℃、5％CO ₂インキュベーター内で一晩培養℃、
4. 製造元のプロトコールに従ってpcDNA5/TO-Kir DNAとリポフェクタミンLTX / Plus試薬の10〜15μgを用いて細胞をトランスフェクトする。 5時間後、B培地でトランスフェク....

Results

テトラサイクリン誘導発現系の使用が特徴的な内因性経路を介してTL ⁺フラックスと関心のあるキールチャネルのための便利な内部統制を提供しています。 図1は、実験の種類で使用されるセルメッキマップの例をいくつか示します。非誘導またはテトラサイクリン誘導細胞を含むウェルの位置が異なる色で示されています。 図2Aは、アッセイ開発と化合物スクリーニングのための最適なTL ⁺濃度を決定するために使用されるソースプレート·マップを示します。色のグラデーションは100％から0.002パーセントTL ⁺に至るまで3倍希釈系列を表します。代表的な蛍光強度マップはそれぞれ、ローからハイへのTL ⁺フラックス値を示すクール·トゥ·ホット色で、 図2Bに示されている。 図1Cに示すように細胞播種マップは、この実験のために使用された。 tに4パラメータロジスティック関数のフィット彼TL ⁺ CRC（ 図2C.......

Discussion

データ処理：いったんデータが収集され、分析の一般的なステップは、実験の最初にF _0を初期値に各ウェルの蛍光応答、Fを、正規化が含まれます。これは、一般的に"静的比"と呼ばれ、 "F / F ^_0"に象徴される_。F0を指示薬色素によって支配されている例では静的比率演算が実質的に、このような照明、信号コレクション内disuniformitiesなどの多くの要因のために修正されますおよび細胞数。背景が適切に静的比率を計算する前に対処することができない限り、染料信号が弱い、またはシステム内のバックグラウンド蛍光や反射が高い例では、静的比は有効になりません。データの正規化した後、活動を定量化し、ヒット曲を選ぶために使用される単一の値に蛍光波形を低減するために典型的である。最も一般的に、これはデータを当てはめることによって行われますTlの添加後10秒でポイント⁺誘発蛍光増加の初期勾配を得るために。ヒットピッキングについては、一般的なアプローチは、試験集団における化合物.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬の名称	会社	カタログ番号	注釈
pcDNA5/TO	インビトロジェン	V1033-20	テトラサイクリン誘導発現ベクター
T-REX-HEK293細胞	インビトロジェン	R71007	テトラサイクリン誘導性細胞株
リポフェクタミンLTX /プラス試薬	インビトロジェン	15338100	トランスフェクション試薬
FBS	ATLANTAバイオ	S11550	細胞培養培地
DMEM	インビトロジェン	11965	細胞培養培地
ハイグロマイシンB	インビトロジェン	10687-010	細胞培養培地
ブラストサイジンS	インビトロジェン	R210-01	細胞培養培地
ペニシリン/ストレプトマイシン	インビトロジェン	15140	細胞培養培地
フリーHBSS - 二価	メディアテック	21022CV	細胞洗浄
トリプシン0.25パーセント	メディアテック	25053CI	細胞解離
テトラサイクリン塩酸	シグマ	T9823	誘導試薬
透析FBS	ATLANTAバイオ	S12650	プレート培地
FluoZin-2	インビトロジェン	F24189	蛍光染料
プルロニックF-127	インビトロジェン	P-3000MP	色素ローディング
HBSS	インビトロジェン	14175	アッセイバッファー
HEPES	インビトロジェン	15630	アッセイバッファー
NaHCO 3を	シグマ	S6297	TL +刺激バッファー
MgSO 4を	シグマ	M2643	TL +刺激バッファー
•のCaSO 4·2H 2 O	シグマ	C3771	TL +刺激バッファー
D-グルコース	シグマ	G7528	TL +刺激バッファー
硫酸タリウム	アルドリッチ	204625	TL +刺激バッファー
HEPES	シグマ	H4034	TL +刺激バッファー
DMSO	シグマ	D4540	溶剤
8チャネルの電子ピペッター	バイオヒット	E300	384内のセルメッキ -ウェルプレート
BD PureCoatアミンコーティングした384ウェルプレート	BD Biosciences社	356719	アッセイマイクロプレート
エコーは、384ウェルマイクロプレートポリプロピレン（384PP）を認定	Labcyte	P-05525	化合物源マイクロプレート
384ウェルマイクロプレートポリプロピレン	グライナーバイオワン	781280
マルチドロップコンビ試薬ディスペンサー	サーモサイエンティフィック	5840300
ELx405マイクロプレートウォッシャー	BioTekの	ELx405HT	自動細胞洗浄
液体ハンドラをエコー	Labcyte	Labcyteエコー550
ブラボー自動リキッドハンドリングプラットフォーム	アジレント·テクノロジー	標準モデル
Hamama津FDSS 6000	浜松市		キネティック·イメージングプレートリーダー