私たちは、血漿/血清学的検査のために採取した全血からゲノムDNAを単離する新たな方法を説明しています。血漿採取した後、圧縮された血液は、通常廃棄されます。当社の新規の方法は、既存の方法に比べて大幅な改善を表し、追加の血液を要求せず、単一のコレクションからのDNAやプラズマを利用できるようになります。
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この記事について
サマリー
要約
臨床検査は、血液の細胞または流体部分に行うことができる。別の採血管を使用することにより分析することができる血液（全血、血漿または血清）の一部を決定する。人間の疾患の遺伝的基礎を研究に携わる研究所は、ゲノム/遺伝子解析のためのDNAの供給源としてEDTA含有バキュテナーに収集凝固処理全血に依存しています。ほとんどの臨床検査室は、表現型のアウトカム調査の最初のステップとして、生化学的、血清学的およびウイルスのテストを実行するため、抗凝固処理血液もヘパリン含有チューブ（プラズマチューブ）に集められる。したがってDNAプラズマがゲノムおよびプロテオミクスデータの両方の同時並列分析のために必要とされる場合には、EDTAおよびヘパリンチューブの両方に血液を採取するのが通例である。血液は単一の管に収集し、血漿とDNAの両方の原因となることができれば、その方法は、既存のメタへ前進であると考えられるODS。プラズマ抽出後の圧縮された血液の使用は、このように処理された血液試料の量を最小化し、各患者から必要なサンプル数を減らすこと、ゲノムDNAの代替供給源を表す。これは、最終的に時間とリソースを節約できるでしょう。
血漿タンパク質保存用BD P100血液採取システムは、ヒト血液から良好なタンパク質バイオマーカーの発見およびプロテオミクス実験を可能にし、血液のタンパク質含有量を安定させるために、前の血漿または血清採血管1よりも改善された方法として作成された。 BD P100管は、15.8、噴霧乾燥K2EDTA mlの凝固を防止し、血漿タンパク質を安定化するプロテアーゼ阻害剤の凍結乾燥された独自の広域スペクトルカクテルを含有する。また、遠心分離後、血漿および細胞ペレット間の物理的障壁を提供する機械的なセパレータを含む。いくつかの方法は、凝固した血液のsaからDNAを抽出するために考案されているmples古いプラズマチューブ2-4に収集。これらのメソッドからの課題は、主にチューブ（ゲル·セパレータ）の内部セパレータの種類に関連付けられており、凝固した血液の回収が困難である、断片化や血栓を分散させるの不便さ、および分離ゲルによって血栓抽出の閉塞を含まれていた。
私たちは、新しいBD P100チューブに採取した血液からゲノムDNAを抽出し、浄化する最初の方法を提示する。私たちは、P100のチューブからEDTA管からそれにDNAサンプルの品質を比較。我々のアプローチは、シンプルかつ効率的である。 2）機械的なセパレータの除去は、スクロースとの組み合わせを使用して、採血のための機械的なセパレータをプラズマBD P100（BD診断、スパークス、MD、USA）管の1）を使用する：これは、次の4つの主な手順が含まれ無菌クリップ金属フック、3）及び4白血球を含むバフィーコート層の剥離）からのゲノムDNAの単離軟膜は、通常の商業的なDNA抽出キット又は類似の標準プロトコルを使用する。
プロトコル
1。試料捕集
- 適切なインフォームドコンセントを持つ個人からの血液サンプルを収集します。個々については、P100チューブ（BD診断、フランクリン湖、NY、USA）への血液4〜を5ml描く。比較のために、同時にEDTAチューブに血液を採取。
- BD P100管は15.8ミリリットル、噴霧乾燥K2EDTAおよび凝固を防止し、血漿タンパク質を安定化するプロテアーゼ阻害剤の凍結乾燥された独自の広域スペクトルカクテルを含有する。彼らはまた、機械的な区切り文字を含んでいます。処理が発生するまで、全血を採取した後、一晩、60分間室温で両方のチューブを保持する。
- 室温で15分間、2500グラムでBD P100チューブを遠心する。マイクロ遠心チューブにメカニカルセパレーターの上に採取した血漿を転送します。
- -80℃で、セパレーターの下に圧縮血を含む、P100チューブを保管°Cあなたは、DNA内線を開始する準備が整うまでraction。
P100管の血（P100_DNA）から2.1
- P100チューブを-80℃で保存するプラズマ抽出後のC。 3から4ヶ月以内に、5分（ 図1A）のための水浴中で37℃でフリーザーや解凍から圧縮された血液を含むP100チューブを取り出す。セパレーターの上に座って任意の残留プラズマを削除します。セパレーター上記P100チューブ（....
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結果
DNAの品質評価と濃度測定
P100_DNAsの収率はEDTA_DNAsのもの（ 表1、表2）よりも有意に低かった。その吸光度比260/280の値で表されるDNAの純度はP100_DNAとEDTA_DNAサンプルセット（ 表1および2）の両方に類似している。光スミア（ 図2）によって示されるように、いくつかの劣化が、EDTA_DNA試料中に見られるが、DNAの品質は、サンプルの各セット内でかなり均一である。劣化のより多くの兆しを見せEDTA_DNAsも減少DNA濃度を示した。
遺伝子型決定
EDTA_DNAsとP100_DNAsの両方の遺伝子型コールレートを比較した。彼らは同じような通話料金をもたらし、両内部ハップマップコントロールDNA（ 表3）に匹敵した。
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ディスカッション
多くの人間の病気は、遺伝的な原因があり、人間の病気の遺伝的基礎を探求することは増加高品質のDNAが求められます。遺伝学的研究に使用されるDNAの最も一般的な原因は、全血を抗凝固される。ほとんどの臨床検査室では、生化学的な血清学、および表現型アウトカム調査の最初のステップのようなウイルスのテストを実行するので、血液がしばしばプラズマチューブに集められる。血漿の採取後、圧縮された血液は、多くの場合、破棄されます。したがって、DNA、遺伝子研究やテストを行うために必要とされる場合、追加の採血は、同じ患者から必要とされる。それは白血球が含まれているとして廃棄圧縮された血液はDNAの潜在的なソースを表す。したがって、プラズマチューブから圧縮された血液を使用すると、余剰の血を引くか、追加の血液のために患者をリコールする必要なく、より効率的に採取した血液サンプルを使用する機会を提供しています。
元に様々な方法圧縮された又は凝固した血液の白血球からのDNA管は6-10報告されている。これらの方法の課題のほとんどは、プラズマ収集管の設計と関連していた。前の血漿採集管が遠心分離、.......
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開示事項
利害の衝突は宣言されていない。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| BD P100チューブ | BD Diagnostics | 366448 | |
| EDTAチューブ | BD Diagnostics | 367863 | |
| スクロース | Sigma | S9378 | |
| ゼムクリップ | 事務用品 | ||
| 15 mlチューブ | Corning | 430052 | |
| 赤血球 (RBC) | Qiagen | 158389 (キット) | |
| リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) | Thermo Scientific | SH30256.01 | |
| BioSprint 96 DNA Blood Kit (48) | Qiagen | 940054 | |
| 1.7 ml マイクロチューブ | Axygen | MCT-175-C | |
| Human Immuno DNA Analysis BeadChip Kit | Illumina | WG-352-1001 | |
| ビーズアレイリーダー | Illumina | NA | |
| GenomeStudio ソフトウェア | Illumina | N/A |
参考文献
- Yi, J., Kim, C., Gelfand, C. A. Inhibition of intrinsic proteolytic activities moderates preanalytical variability and instability of human plasma. Journal of Proteome Research. 6, 1768-1781 (2007).
- Garg, U. C., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y., Eckfeldt, J. H.
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再版と許可
