方法論記事

電気化学センサを用いた細菌検出＆識別

DOI：

10.3791/4282

⸱

2013年4月23日

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1Research Service, Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 2Department of Urology, The David Geffen School of Medicine, University of California, Los Angeles , 3GeneFluidics, 4Division of Infectious Diseases, Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 5Department of Microbiology, Immunology & Molecular Genetics, University of California, Los Angeles

この記事について

サマリー

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我々は、迅速な菌の検出および同定のための電気化学センサの測定方法を説明する。アッセイは、リボソームRNA（rRNAの）種特異的配列のためのDNAオリゴヌクレオチド捕捉プローブで官能化されたセンサアレイを含む。捕捉プローブと西洋ワサビペルオキシダーゼ連動DNAオリゴヌクレオチドの検出プローブでターゲットのrRNAのサンドイッチハイブリダイゼーションは、測定電流測定電流を生成する。

要約

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電気化学センサが広く血糖の迅速かつ正確な測定のために使用され、検体の多種多様な検出のために適合させることができる。電気化学センサは、有用な電気信号に生体認識イベントに形質導入​​することによって動作する。シグナル伝達は、電流測定電極に酸化還元酵素の活性を結合することによって起こる。センサの特異性は、酵素の固有の特性、グルコースセンサの場合、グルコースオキシダーゼ、又は酵素及び抗体又はプローブ間のリンケージの積である。

ここでは、直接細菌を検出し、識別するための電気化学センサの測定方法を説明する。いずれの場合も、ここで説明するプローブは、DNAオリゴヌクレオチドである。この方法は、標的リボソームRNA（rRNAの）とキャプチャーと検出プローブのサンドイッチハイブリダイゼーションに基づいています。検出プローブがhに連結されている間に捕捉プローブは、センサー表面に固定されているorseradishペルオキシダーゼ（HRP）。例えば、3,3 '、5,5' - テトラメチルベンジジン（TMB）などの基板は、その表面に結合した捕捉対象検出器複合体を有する電極に追加されると、基板は、HRPにより酸化され、作用電極によって低減される。電極で電流の流れを作り出す、電極からHRPに基板による電子の往復でこの酸化還元サイクル結果。

概要

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細菌の検出および同定のための標的分子としてのrRNAを使用すると、多くの利点を有する。細菌細胞内のrRNAの存在量が標的増幅1を必要とせずにミリリットルあたり250バクテリアの低感度限界のために用意されています。細菌のリボソームRNAは、DNAプローブとのハイブリダイゼーションにアクセス可能なユニークな種特異的な配列を含む。これにより、電気化学センサのアレイは、各センサが異なる種特異的捕捉プローブで官能化されている未知の細菌を同定するために用いることができる。ポジティブコントロールセンサーは、 "ブリッジ"捕捉および検出プローブが内部校正信号を作成するために合成オリゴヌクレオチド標的のために含まれるべきである。

電気化学センサーは、基本的な研究および翻訳の幅広い用途を有する。例えば、ここに記載されたアッセイを正確E.の効果を測定するために使用されているRRN上の大腸菌増殖期細菌の生理学2に興味を持って研究者に大きな関心であると事前rRNAのコピー数、。電気化学センサアッセイの感度は、信号対雑音比によって決定される。信号増幅及びノイズ低減の様々な方法が検討されている。私たちは、センサー表面の化学的性質を改善することは検出プローブおよび/またはHRP酵素の非特異的結合を減少させるための鍵であることがわかります。特に、アルカンジチオール及びメルカプトヘキサノールとの混合単分子膜は、標的ハイブリダイゼーション3に対して捕捉プローブのアクセス可能性を保持しながらより完全に電極表面を被覆することによってバックグラウンドを低減することが見出された。これらの表面化学処理は、複雑な生物学的サンプルを伴うアッセイのために特に重要である。

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プロトコル

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1。電気化学センサーの機能化

  1. 300μMの1,6 - ヘキサン（HDT）、10mMのトリス-HCl、pH8.0、0.3 MのNaCl、1mMのEDTA、10分間、室温で暗所でインキュベートにおいて0.05​​μMの濃度でチオール化捕捉プローブを準備。 HDTを有するチオール化捕獲プローブのインキュベーションは、より一貫性のある結果をもたらし、捕捉プローブのチオール基が低減されることを保証する。
  2. 水分および/または粒子を除去するために5秒間裸金16センサアレイチップ（複数可）に窒素気流を適用する。
  3. HDT-チオール捕捉プローブの6μlのセンサアレイのすべての16のセンサーの作用電極に混合し、4℃で一晩カバーペトリ皿にセンサーチップ（s）を保存し適用します。チオール捕捉プローブは、裸の金電極に直接結合し、HDTは、捕捉プローブの過剰充填防止し、それらの目標とのハイブリダイゼーションを促進し、拡張コンフォメーションを保つように作用する。
  4. ザ翌日、5秒間、窒素気流下で2〜3秒で乾燥し、脱イオンH 2 Oとセンサチップを洗う。
  5. 10mMのトリス-HCl、pH8.0、0.3 MのNaCl、1mMのEDTA、1mMの全てのセンサ16と50分間インキュベート作用電極に6 - メルカプト-1 - ヘキサノール（MCH）6μlのを適用する。これ以降のすべてのセンサチップインキュベーションを室温で覆われたペトリ皿で​​行われる。 MCHは、チオール捕捉プローブまたはHDTは、電極表面上に存在しない任意のギャップを埋める、ブロッキング剤として機能します。

2。試料調製

  1. 5分間16,000 xgで遠心チューブと遠心分離機に成長の対数期（≈0.1 OD 600）で細菌培養液1mlを転送します。培養上清を取り除きます。細菌ペレットを直ちに処理または-80°C、後で使用するために保存することができる。
  2. 徹底的にボットにピペットチップを適用することにより、1MのNaOH10μlに細菌ペレットを再懸濁マイクロチューブのトムと数回ピペッティング。 5分間室温で懸濁液をインキュベートする。
  3. ウシ血清アルブミン（BSA）およびフルオレセイン変性検出プローブの0.25mMの2.5％を含有し、pHが7.2、1 Mリン酸緩衝液50μlを添加して細菌溶解物を中和する。室温で10分間中和された溶解物をインキュベートする。フルオレセイン変性検出プローブは、細菌リボソームRNA標的分子とハイブリダイズする。

3。電気化学センサーアッセイ

  1. 5秒のために、窒素気流下2-3秒、乾燥のために脱イオンH 2 OとのセンサーチップからMCHを洗ってください。
  2. 14センサーのそれぞれの作用電極に中和細菌溶解4μlのを適用し、15分間インキュベートする。標的検出プローブ複合体は、固定されたチオール化捕獲プローブにハイブリダイズする。
  3. 2.5％BSAおよび0.25＆を含む1Mのリン酸緩衝液中でオリゴヌクレオチドを​​ブリッジ1nmの4μlを、pHが7.2を適用μ、Mフルオレセイン変性検出プローブ2陽性対照センサ（信号正規に使用される）と15分間インキュベートする。
  4. 5秒のために、窒素気流下2-3秒、乾燥のために脱イオンH 2 Oとセンサチップを洗ってください。
  5. 15分間のすべての16のセンサーとインキュベートの作用電極に0.5％カゼインを含む1 Mリン酸緩衝液で0.5 U / mlの抗フルオレセイン-HRP4μlの、pHが7.2を適用します。抗フルオレセイン-HRPは、固定化されたフルオレセイン修飾された検出プローブに結合する。
  6. 5秒のために、窒素気流下2-3秒、乾燥のために脱イオンH 2 Oとセンサチップを洗ってください。
  7. センサーチップマウントにセンサチップと負荷の表面によくフィルムステッカーを適用します。全16センサーへのTMB基質のピペットを50μlとセンサチップマウントを閉じます。
  8. ヘリオスチップリーダーを使用しているすべての16センサー用アンペロメトリーとサイクリックボルタンメトリー測定値を得る。電流測定電流は、TMB、rの速度に比例しているセンサー表面に析出（ 図1参照）。

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結果

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私たちは、サンドイッチELISAと同様に構成されている電気化学的測定法について説明します。 図1に示すように、捕捉および検出プローブと標的リボソームRNA（rRNAの）ハイブリダイゼーションを検出プローブ上の3 'フルオレセイン結合に結合する抗フルオレセイン抗体フラグメントに結合したHRPにより触媒される酸化還元反応によって開発されている。分析感度の重要な構成要素は、金電極の表面の化学的性質である。我々は、チオール化捕捉プローブ、メルカプトヘキサノール、及びヘキサンからなる三元系単分子層が著しくレポータータンパク3の結合非特異的バックグラウンドを減少させることによって信号対雑音比を改善することを見出した。アッセイは、 図2に示すGeneFluidics 16センサアレイチップを採用してここで説明する。アレイ内の各センサは、3つの電極、仕事、基準、及びチップ4の縁に接触点を有する補助を含んでいる。チップの読み取り小胞体は、接触点のそれぞれと接続するポゴピンを有する。チップリーダーはコンピュータアルゴリズムによって制御ポテンショメ...

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ディスカッション

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ここで説明する電気化学センサアッセイは、核酸標的の迅速な検出を可能にする。感度および特異性は、順番に長さ及び捕捉および検出プローブのGC含有量に依存するターゲットプローブハイブリダイゼーションの自由エネルギーに部分的に依存する。我々は一般的に、周囲温度（〜20℃）5、6でのハイブリダイゼーションの手順を実行します。チップを含有する被覆チャンバ内に配置されれば、ハイブリダイゼーション工程（3.2および3.3）もまた、ハイブリダイゼーションオーブンでより高い温度で行うことができる蒸発7,8を防止するためにろ紙を湿らせた。最適な信号は、ハイブリダイゼーション部位8の間に隙間なく核酸標的上の隣接部位にハイブリダイズキャプチャ検出プローブ対が得られる。このシグナル増強がスタッキング塩基対によってと "ヘルパープローブ"の効果として知られている隣接する領域のハイブリダイゼーションのアクセシビリティを、増加させることにより動作するように考えられている。キャプチャ検出確率隣接したサイトへの電子ハイブリダイゼーションのrRNAターゲット5の断片の中...

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開示事項

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すべての著者は説明した方法に関連する特許に関する発明である。これらの特許の一つはQvella株式会社にライセンス供与されています。 BMCとDAHはQvella株式会社の持分を持っている。 VGは、電気化学センサアレイチップのメーカーですGeneFluidicsの社長、チップマウント、そして本稿で述べたチップリーダーです。

謝辞

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本研究では、アレルギーと国立感染症研究所からと小児泌尿器科研究の卓越性のためのウェンディとケンルビー基金協力協定賞AI075565（DAHに）によってサポートされていました。 BMCは、小児泌尿器科でジュディスとロバート·ウィンストンの椅子です。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
6-メルカプト-1-ヘキサノール(MCH)シグマ451088室温での保存
1,6-ヘキサンジチオール(HDT)シグマH-12005室温での保存
チオレーテッドキャプチャプローブオペロンN / A100μ0.1x TE の M、-20 °C
フルオレセイン修飾検出器プローブOperonN/A100 μ0.1x TE の M、-20 °C
ブリッジングオリゴヌクレオチドオペロンN/A100 μ0.1x TE の M、-20 °C
抗フルオレセイン-HRP、FabフラグメントRoche11 426 346 9104 >C
Helios チップリーダーGeneFluidicsGFR-2009
センサーチップマウントGeneFluidicsGFR-003
フィルムウェルステッカーGeneFluidicsセンサーチップ付き
金 裸の金 16センサーアレイチップ GeneFluidicsSC1000-16X-B室温で100%N2 牛
血清アルブミンで保存シグマA79064°Cで保管します。C
1M リン酸緩衝液、pH 7.2 0.35M NaH2PO4、0.65M K2HPO4、pH 7.2 に調整
PBS Pierce37528等量の 1M リン酸緩衝液で希釈します。 pH 7.2、4°Cで保存。C
表 1.試薬と機器.
は

参考文献

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  1. Wu, J., Campuzano, S., Halford, C., Haake, D. A., Wang, J. Ternary Surface Monolayers for Ultrasensitive (Zeptomole) Amperometric Detection of Nucleic Acid Hybridization without Signal Amplification. Anal. Chem. 82, 8830-8837 (2010).
  2. Halford, C., et al. Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Sensitive Detection of Precursor Ribosomal RNA Using a Novel Electrochemical Biosensing Platform. Antimicrob. Agents Chemother. 56, In Press (2012).
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