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方法論記事

エンドセリン-1誘発性中大脳動脈閉塞中大脳動脈を可視化するために頭蓋窓を利用

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DOI:

10.3791/50015

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2013年2月22日

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1Department of Physiology and Functional Genomics, University of Florida , 2Department of Neurosurgery, McKnight Brain Institute, University of Florida , 3Department of Anatomical Sciences, Shiraz University of Medical Sciences, Shiraz, Iran

この記事について

サマリー

この記事では、中大脳動脈の近位部分を表示するために時間的な頭蓋骨切除術を使用して頭蓋窓を通してラット大脳動脈を可視化するための方法を説明します（図1）。この汎用性の高い方法は、脳動脈の反応性を測定するために、薬物送達の様々な技術と組み合わせることができます。

要約

頭蓋ウィンドウの作成 ​​は1-3脳の皮質表面上の構造の直接可視化を可能にする方法です。このテクニックは、ラット大脳を覆う多くの場所で行うことができますが、最も簡単に容易にアクセス可能な正面または頭頂骨上クレイニエクトミを作成することにより行われる。最も頻繁に、私たちは近MCAに隣接する脳実質にエンドセリン-1の注入で発生する中大脳動脈血管径の変化を定量化する虚血性脳卒中のエンドセリン-1中大脳動脈閉塞モデルとの組み合わせでこのテクニックを使用している4、5。エンドセリン-1誘発MCAO中にMCAの近位部分を可視化するために、我々は、ラットの頭蓋骨の外側面（ 図1）上の側頭骨を通して頭蓋窓を作成するための技法を使用しています。脳動脈硬無傷または硬膜切開とretraとのいずれかで可視化することができますCTED。最も一般的に、我々は、脳実質への血管収縮ペプチドの送達を伴うエンドセリン-1誘発MCAOので、可視化時に硬膜をそのままにしておく。これは、薬物送達のための可視化容器の真上に硬膜を切開する必要を回避します。このプロトコルは、同様にこの方法に関連する潜在的な落とし穴の多くを回避する方法として、段階的に脳動脈を可視化する頭蓋ウィンドウを作成する方法について説明します。

プロトコル

このプロトコルは、インスティテューショナルアニマルケアによって承認され、使用フロリダ大学の委員会（動物実験委員会）及び "実験動物の管理と使用に関する指針"（第8版、全米科学アカデミー、2011）に準拠していました。

材料

  1. 動物：8週齢、雄、手術時に250〜300グラムの重量を量るのSprague Dawleyラット（Charles River農場、ウィルミントン、MA、USA）。
  2. 麻酔
    1. 吸入麻酔システム（VetEquip社、プレザントン、カリフォルニア州、米国）
    2. イソフルラン麻酔（バクスター薬学、ディアフィールド、イリノイ州、アメリカ）
  3. 定位システム（デヴィッド·インスツルメンツKopfは、タハンガ、CA、USA）を
    1. 小動物の定位システム
    2. ラットの非破裂耳バー
    3. ラット用ガス麻酔ヘッドホルダー
  4. 温度調節
    1. BAT-12マイクロプローブ温度計（世界精密機器株式会社、サラソタ、フロリダ州、米国）
    2. T /ポンプ、TP600サーマルブランケット（Gaymarインダストリーズ社、Orchard Park、ニューヨーク、アメリカ）
  5. 手術器具
    1. Metzenbaumはさみ、アイリス鉗子、ブルドッグクランプリトラクター、26ゲージ針ベベル、ボビー焼灼キット（世界プレシジョンインスツルメンツ社、サラソタ、フロリダ州、米国）と10μLシリンジ
    2. マイクロモータードリル（Stoelting、ウッドデール、イリノイ、米国）
    3. 0.8ミリメートルラウンドドリルいが（Roboz手術器具株式会社、ゲーサーズバーグ、メリーランド州、米国）
    4. ストルツボン縫合鉗子（ボシュロム社、ロチェスター、NY、米国）
  6. 外科用品
    1. 3.0ナイロン縫合糸（オアシス、メタワ、イリノイ、米国）
    2. 綿棒、Puralube眼軟膏（フィッシャー·サイエンティフィック、ピッツバーグ、PA、USA）
    3. 手術のポイントとストリップ（メドトロニックXomed株式会社、ジャクソンビル、フロリダ州、米国）
    4. 電気バリカン（オスター、プロビデンス、ロードアイランド州、米国）
  7. 化学品
    1. エンドセリン-1（アメリカンペプチド、サニーベール、カリフォルニア州、米国）
    2. クロルヘキシジン2％（Agrilabs、セントジョセフ、ミズーリ州、米国）
  8. 可視化装置
    1. 手術用顕微鏡（ザイラー音源と製造、セントルイス、ミズーリ州、米国）
    2. ソニーハンディカムHDR-SR11（ソニー、港区、東京、日本）
    3. 光ファイバ照明装置（TechniQuip社、リヴァーモア、カリフォルニア州、米国）
  9. 血管径の測定
    1. VLCメディアプレーヤー（パリ、フランス）
    2. 画像Jソフトウェア（ImageJの1.42qソフトウェア、米国国立衛生研究所、ベセスダ、MA、USA）

1。手術前のステップ

  1. 手術に先立ち、ラットを水とげっ歯類への無料アクセスを12：12明/暗サイクルで飼育されています。
  2. 麻酔が誘導室では100％O 2ガスの混合物中のイソフルラン4％で誘導される。
  3. カラス頭のnは、電気バリカンで剃毛されています。
  4. ラットは、温度制御された操作面の上に横たわって吸収パッド（サーマルブランケット）に発生しやすい位置に配置されており、ヘッドはガス麻酔フェイスマスクの配置で始まる定位装置内に配置されています。
  5. 次に、耳の棒を挿入して締められている。
  6. プロシージャ麻酔中に100％O 2ガス混合物中のイソフルラン2％で維持されます。
  7. 眼科用潤滑剤軟膏を両眼に適用され、まぶたが外科手術中に目の乾燥を防ぐために閉鎖されています。
  8. プローブは、37の定数動物のコア温度を維持するために挿入され直腸温度±0.5℃
  9. 定位固定装置にしっかりと保持された麻酔したラットの頭で手術領域はクロルヘキシジンと生理食塩水3回を交互に清めです。

2。プリ頭蓋窓の準備

ontent ">前頭蓋ウィンドウを作成するには、ラットは、他の必要なハードウェアの注入によって、任意の実験のために準備されるべきであるし、必要な外科的処置を受ける必要があります。このプロトコルのために、我々が以前にエンドセリン-1（ET-用のガイドカニューレを移植しました1）誘起MCAO、表題の関連資料に示すように、 "ラットにおけるレーザードップラー血流計の指針と虚血性脳卒中のエンドセリン-1誘発性中大脳動脈閉塞モデル。"

3。頭蓋窓の作成

ガイドカニューレや実験に必要な機器を配置した後、頭蓋窓は直接ストローク手順の間に、中大脳動脈の近位部分を可視化するために作成されます。

  1. まず、はさみ内側開始および横方向に働く側頭筋を覆う皮膚を切開するために使用されます。
  2. 側頭筋は、電気メスを使用して二等分してから、映像設備に3.0ナイロン縫合糸を使用して退避させる側頭部を安定させ、。
  3. それは側頭骨に反射して約3〜4mmの正方形が軌道に尾と頬骨突起の根元に上側頭骨の扁平部分に描かれています。
  4. ドリルは、徐々に側頭骨から無料骨の輪郭の一部を切り取るために使用されます。それは硬膜や脳の皮質に損傷を与えることができるため注意がドリルにあまり圧力をかけることを避けるために注意するべきです。
  5. 滅菌生理食塩水との頻繁なリンスは、手術野の可視化を向上させ、頭蓋骨の過熱を防ぐために行われます。
  6. 硬膜に関連付けられている血管を破らないようにしながら緩い角から開始し、temoporal骨片を慎重に微ラット歯鉗子を用いて除去する。
  7. 硬膜はそのまま残されており、残骸は、滅菌生理食塩水を用いて洗い流しています。

4。大脳動脈狭窄の記録

リアルタイム、ET-1誘発MCAOを受けているラットの画像をキャプチャする方法を示すために、10トン ">は、このプロトコルで使用されます。

  1. 血管作動性化合物を適用する前に、ベースラインのビデオは、少なくとも1分間記録されなければならない。針が脳実質内に下ろされた後、ET-1誘発MCAOについては、基準値の記録が行われますが、ET-1の注射前に。
  2. シリンジポンプは注入のために開始され、1時間または所望のエンドポイントまで記録されます。針は焦点面の乱れを防ぐために録画中の場所に残されます。
  3. ラットは、この手順に従って承認されたプロトコルに従って深く麻酔し、安楽死させなければなりません。

5。画像解析

血管径は可視MCAのどの部分を決定することができる。一例として、我々は、ET-1注射前と後の時点で血管径を測定するMCAの1分岐を使用します。 STIビデオからLLフレームはVLCメディアプレーヤー（VideoLANの）を使用して、1分間隔でキャプチャされます。

  1. VLCプレーヤーをインストールして開かれます。
  2. ツールは、[設定]を選択して、設定は下の "すべて"に変更され、 "設定の表示。"
  3. "映像メニュー"が左側のサイドバーに展開され、 "出力モジュール"がその後に展開されます。 "シーン·フィルタは"シーンのビデオフィルタメニューを表示するために選択される。
  4. "シーン"は、ファイル名の接頭語のためのボックスに入力されています。
  5. ディレクトリパスの接頭辞が定義されています。それでもフレームが保存される場所です。
  6. 記録比率は依然としてフレームキャプチャの所望の速度に基づいて選択されます。映像は毎秒29フレームでキャプチャされた場合、 "1749"（29フレーム/秒×60秒/分）は1つがまだ1分ごとにフレーム保存するボックスに入力する必要があります。すべての変更が保存されています。
  7. 目的のビデオは自動的に1分ごとに一度静止フレームを保存するためにVLCプレーヤーで開かれます。
  8. 血管径は、これらを使用して測定され画像。最初はImageJソフト（NIH）が開かれます。
  9. 次に、測定することは依然としてフレームはImageJので開かれます。
  10. "分析"メニューを選択することによって、 "測定値を設定"から開かれており、すべてのボックスがオフになっています。
  11. 次に、直線ツールが選択されています。
  12. キーボードショートカットの "Ctrl +"は、必要に応じて、回線が血管径を測定する血管経路に垂直に配置されてズームインするために使用されます。
  13. 最後に、血管の長さは、血管の長さを得るために "分析"メニュー、次に "測定"（Ctrl + M）を選択することによって得られる。
  14. このプロセスは、少なくとも3回繰り返し、それぞれの静止フレームで測定された各測定容器で平均化されます。
  15. 比較は、複数のラットを用いて作製することができるように、各時点での血管径は、ベースラインの血管径に正規化されます。これを行うには、各容器の％ベースラインの直径を計算するために×100％式現在の直径/直径ベースラインを使用しています。

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結果

まだキャプチャされたビデオ·ショーから撮影した画像その後大脳動脈径の変化、ET-1注入が容易にこの頭蓋窓技術（ 図2）を使用して理解することができる。 ET-1を注射後数分以内に、容器が収縮し始めます。最終的には血管が視覚化することが困難になり、脳組織は蒼白になるでしょう。約20分後、ET-1の効果が減少すると血管が徐々に約45分後にベースラインの直径に戻って、拡張するために開始されます。発生し、より明白な血管収縮に加えて、皮質表面は、ET-1投与後青白くなります。必要に応じて校正された顕微鏡レチクルと血管径の絶対変化を計算することが可能である。複数のラットとの間の比較のために、我々は手順中に発生した血管径の相対的な変化を計算します。これらの測定は、ImageJのソフトウェア（NIH）を使用して実行されます。次にRELを表すグラフ時間をかけて血管径でative変化します（ 図3）を構築することができる。

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ディスカッション

それはマイナーな修正4,5で多くの実験のニーズを満たすように変更することができるように要約すると、この頭蓋窓調製技術は、非常に汎用性があります。例えば、我々は正常に頭蓋窓（メッカ、AP、2009年から2011年）を通じて可視化さ大脳動脈に直接焦点を当てるレーザードップラーフローメトリーを使用して、特定のMCAの分岐で脳血流を監視しています。また、硬膜切開と同様の調製は 、in vivo血管反応槽3 内に作成する血管作動性化合物の局所投与で使用することができます。この技法のために故障率を下げるために頭蓋のウィンドウを作成する際、いくつかの要因を考慮する必要がある。これらの要因の多くは、脳動脈の良好な可視を得ることに関連しています。それを覆う硬膜や血管がドリルビットで破壊されないように頭蓋骨切除術を最初に作成するとき、注意しなければなりません。これは最高の達成され滅菌生理食塩水で頻繁に洗浄することにより破片をクリアして、頭蓋骨を冷却する。それが削除されたときに第二に、骨片を静かに持ち上げなければならない。断片は容易に引き離していない場合は、ドリルビットは、より多...

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開示事項

特別な利害関係は宣言されません。

謝辞

この作品は、アメリカ心臓協会グレーター東南アジアアフィリエイト（09GRNT2060421）、米国医師会からとフロリダ臨床およびトランスレーショナル科学研究所の大学からの補助金によって支えられている。アダムメッカは、NIH / NINDS、NRSA博士号を取得する前の仲間（F30 NS-060335）です。ロバートRegenhardtは高血圧でフロリダ大学学際的なトレーニング·プログラム（T32 HL-083810）から博士号を取得する前のフェローシップの支援を受けた。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬の名称 会社 カタログ番号 コメント（オプション）
吸入麻酔システム VetEquip株式会社プレザントン、カリフォルニア州、米国 901806
イソフルラン麻酔バクスター薬学、ディアフィールド、イリノイ州、アメリカ合衆国 1001936060
小動物の定位システムデビッド·インスツルメンツKopfは、タハンガ、CA、USA 900
非破裂耳バー、ラットデビッド·インスツルメンツKopfは、タハンガ、CA、USA 957
ラットガス麻酔ヘッドホルダーデビッド·インスツルメンツKopfは、タハンガ、CA、USA 1929
BAT-12マイクロプローブ温度計世界プレシジョンインスツルメンツ社、サラソタ、フロリダ州、アメリカ合衆国 BAT-12
T /ポンプ、サーマルブランケット Gaymarインダストリーズ、オーチャードパーク、ニューヨーク州、米国 T /ポンプ、TP600
Metzenbaumはさみ世界プレシジョンインスツルメンツ社、サラソタ、フロリダ州、アメリカ合衆国 501254
アイリス鉗子世界プレシジョンインスツルメンツ社、サラソタ、フロリダ州、アメリカ合衆国 15915
ブルドッグクランプリトラクター世界プレシジョンインスツルメンツ社、サラソタ、フロリダ州、アメリカ合衆国 14119-G
10μLシリンジ26-gaugue 世界プレシジョンインスツルメンツ社、サラソタ、フロリダ州、アメリカ合衆国 SGE010RNS
ボビー、高温焼灼キット世界プレシジョンインスツルメンツ社、サラソタ、フロリダ州、アメリカ合衆国 500392
ラット歯鉗子0.12 Stotz E1811
マイクロモーターのドリル Stoelting、ウッドデール、イリノイ、米国 51449
0.8ミリメートルラウンドドリルいが Roboz手術器具株式会社、ゲーサーズバーグ、メリーランド州、アメリカ合衆国 RS-6280C-1
ストルツボン縫合鉗子ボシュロム社、ロチェスター、NY、アメリカ
ナイロン縫合糸、サイズ3.0 オアシス、メタワ、イリノイ、米国 MV-663
綿棒フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、PA、アメリカ合衆国 22-029-488
Puralubeの眼軟膏フィッシャーサイエンティフィック、ピッツバーグ、PA、アメリカ合衆国 NC0138063
電動バリカンオスター、米ロードアイランド州プロビデンス、 78005-301
PBS中80μMの濃度に希釈し、ET-1 アメリカンペプチド、サニーベール、カリフォルニア州、米国 88から1-10A
クロルヘキシジン、2％ Agrilabs、セントジョセフ、ミズーリ州、米国 1040年、牧師6月6日、NAC番号：10580322
外科用顕微鏡ザイラー音源と製造、セントルイス、ミズーリ州、米国進化xR6
ソニーハンディカムソニー、港区、東京都 HDR-SR11
光ファイバー照明 TechniQuip社、リヴァーモア、カリフォルニア州、アメリカ合衆国 FO1-150
VLCメディアプレイヤー （パリ、フランス）
画像Jソフトウェア健康、ベセスダの米国国立衛生研究所、米国マサチューセッツ州

参考文献

  1. Levasseur, J. E., Wei, E. P., Raper, A. J., Kontos, A. A., Patterson, J. L. Detailed description of a cranial window technique for acute and chronic experiments. Stroke. 6, 308-317 (1975).
  2. Baumbach, G. L., Dobrin, P. B., Hart, M. N., Heistad, D. D. Mechanics of cerebral arterioles in hypertensive rats. Circ. Res. 62, 56-64 (1988).
  3. Regrigny, O., et al. Effects of melatonin on rat pial arteriolar diameter in vivo. Br. J. Pharmacol. 127, 1666-1670 (1999).
  4. Mecca, A. P., O'Connor, T. E., Katovich, M. J., Sumners, C. Candesartan pretreatment is cerebroprotective in a rat model of endothelin-1-induced middle cerebral artery occlusion. Exp. Physiol. 94, 937-946 (2009).
  5. Mecca, A. P., et al. Cerebroprotection by angiotensin-(1-7) in endothelin-1-induced ischaemic stroke. Exp. Physiol. 96, 1084-1096 (2011).

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