方法は新皮質の所定の機能、マイクロドメインにおける蛍光色素でニューロンを標識に記載されている。まず、内因性シグナル光学イメージング、機能マップを得るために使用されます。その後、2光子顕微鏡は、マップのミクロドメイン内でラベルとイメージニューロンに使用されます。
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方法論記事
特定の機能的内因性シグナルの組み合わせによる新皮質のミクロドメインと二光子イメージングにおけるニューロンの標的標識
この記事について
サマリー
要約
非げっ歯類哺乳動物の一次視覚野では、ニューロンはそのような方向性1-4、方向5-7、眼優位8,9と両眼視差9として刺激特徴のための彼らの好みに応じてクラスタ化されます。方位選択性は最も広く研究されている機能であり、好ましい向きの準周期的なレイアウトの連続写像全体の一次視覚野10,11越えて存在している。これらの機能マップの刺激選択的応答につながるシナプス、細胞、ネットワークの貢献を統合することにより、ミリメートルの空間スケールにサブミクロンをまたぐイメージング技術のハイブリダイゼーションを必要とします。従来の内因性シグナル光学イメージングでは、視覚皮質の表面全体機能マップの全体的なレイアウトは、12を決定することができます。カルシウム感受性色素を用いたin vivoでの 2光子顕微鏡の開発は、SYNAPTを決定するために、1つを可能にICの入力は、個々の神経細胞体6,14の数百人から同時に個々の樹状突起棘13やレコード活動に到着。その結果、2光子顕微鏡のサブミクロンの空間分解能を有する結合内因性信号イメージングは、樹状細胞は、セグメントと新皮質内の機能マップのマイクロドメインに寄与するかを正確に決定する可能性を提供しています。ここでは、急速に皮質方位マップを取得し、非げっ歯類哺乳動物における蛍光色素で神経細胞を標識するためのこの機能マップ内の特定のマイクロドメインを標的とするため、高収率の方法を示しています。二光子イメージングに使用されるのと同じ顕微鏡を用いて、我々は最初の内因性シグナル光学イメージングを用いた方位マップを生成します。その後、我々はどちらかのラベルに染料を用いて神経細胞体またはラベルの樹状突起棘と軸索がに表示されていることをこのような単一ニューロンの人口を読み込まマイクロピペットを用いて目的のマイクロドメインをターゲットにする方法を示しています生体。以前の方法に比べて我々の改良が新皮質の機能的なアーキテクチャの枠組みの中で、サブ細胞レベルの分解能を持つニューロンの構造と機能の関係の検討を容易にする。
プロトコル
1。手術の準備
- 麻酔を誘導し、連続的に心拍数を監視し、潮のCO 2、脳波、および温度を終了します。すべての手順は、サウスカロライナ医科大学の制度的動物実験委員会によって承認されたと我々は以前に9,15を公表したものに基づいていた。
- メスの刃で皮膚を切断することによって頭蓋骨の背側表面を露出させる。 Brudonのキュレットを用いて骨を覆う結合組織を解剖する。綿先端アプリケーターと綿ガーゼを使用して骨をきれいにしてください。小さな使者静脈を通って時折出血を止めるために、頭蓋骨に骨ワックスを（必要に応じ）を適用します。
- 黒の塗料（ 材料を参照してください）と混合歯科用セメントを用いて、頭蓋骨（開頭術が行われる関心領域の上の）にチタンまたはステンレス鋼ヘッドプレートを取り付けます。ヘッドプレートの中央に長方形の開口部は、開頭術および光学イメージングのためのアクセスを提供します。ヘッドプレートの上に金属のチャンバーを取り付けます。このチャンバは、水浸対物レンズと撮像のための流体貯水池として機能します。
- 金属ポストを使用してXYステージにヘッドプレートを固定します。
- 歯科用ドリルを使用してheadplateの長方形の開口部内に骨の大面積を薄く。間伐する面積が十分に計画された開頭術の境界を越えて拡張する必要があります。開頭部位で、骨の厚さは、カバーガラスと新皮質の表面との間にアガロースの厚さが決まりますので、高解像度の画像は、新皮質から取得されようとしている場合は、非げっ歯類哺乳動物の厚い頭蓋骨（下記参照）が薄くしなければなら。
- 開頭術のための骨の中に2×2 mm角のアウトラインをドリルで開けます。骨の破片を除去し、基礎となる皮質への放熱を最小限に抑えるために、新鮮な人工脳脊髄液（ACSF）で定期的にチャンバーを洗浄します。必要に応じて臨時の出血を止めるために、骨のワックスを適用します。
- LIFトン3位鉗子で骨弁。
- すべてが細かい鉗子（＃5CO）とVannas春のはさみを使用して硬膜の底層を削除します。非げっ歯類哺乳動物における硬膜は、厚さと不透明ですが、異なる層に除去することができる。出血はまれですが、穏やかに硬膜の残りの層鉗子を使用していて、ACSFですすぐから削除する必要がありゼルフォームと任意の血液の残基で停止させることができます。硬膜の最終層は透明であり、軟膜血管はそれを通してはっきりと見えるはずです。内因性信号イメージング中に硬膜のこの最終層は無傷のままにしておくと、（説明を参照）実験のその後の二光子イメージング相用蛍光カルシウム指示薬の一括読み込みの成功率が増加します。
- 暖かい2％アガロース（ACSFに溶解）のドロップを適用し、直ちに開頭の上にカバーガラスを配置します。呼吸器や心臓血管外科の脈動は解剖顕微鏡の接眼レンズ、または使用することによって最小限に抑えていることを保証するために開頭術をチェック2を明視野モードの光子顕微鏡。
2。内因性シグナル光イメージング
- 内因性信号イメージング時の乾燥からアガロースを防ぐためにカバーガラスの外側の周りACSFに浸したゲルフォームを追加します。
- 二光子顕微鏡（ 図1）の上に標準のCマウントポートに固有信号イメージング、CCDカメラを取り付けます。 XYステージ（ 図1A）の近くにエアテーブル上の照明光源を配置します。位置と開頭とheadplate /チャンバー（ 図1B）上ライトガイドを固定します。内因性シグナルのために必要な反射した赤色光は、CCDカメラ（ 図1C-D）に開頭から直接渡すようにプライマリーダイクロとCマウントポートの下に鏡を収納してください。 4倍空気対物レンズ（NA 0.13、17ミリメートルWD）を使用して、ビューの2 x 2 mmのフィールドには、内因性信号イメージングのための利用可能です。
- リットルの熱フィルターを挿入加熱から皮質を防ぐためIGHTパス。 （546 nmの中心λ）が緑色の光を通過させるフィルタを使用して、皮質表面の血管のデジタル基準画像を記録します。
- 皮質表面下500μmにzのフォーカスを移動します。内因性シグナルを測定するために皮質を照らすために赤色フィルター（630nmの中心λ）を使用します。皮質表面を均一に照明されるように光導波路を配置します。視覚刺激の表示によって生成された光から開頭をシールドします。視覚刺激とレコード反射データの一連の画像を提示する。 10分以内方位マップを生成するには、8刺激（それぞれ向きを4方向、2方向）のシーケンスの4回の繰り返しに対応するデータを収集します。
- 偽色方向マップを生成するために本質的な信号データを分析します。マップ内のポイント-ニューロンの二光子標識、 例えば、風車の向き特異性のための潜在的なターゲット領域を選択すべての優先配向が（ 図2A）収束する。方位マップと皮質表面の脈管構造（ 図2B-C）の画像を重ね合わせる。大血管や動脈15に場所を避けて、ターゲットを選択する機能ドメインと大型水上艦艇の位置のレイアウトを使用します。
3。蛍光カルシウム指示薬のバルク·ロード
- 5μlのDMSO中に1グラムのプルロニックを追加することにより、20％プルロニック/ DMSOの溶液を調製します。完全プルロニックを溶解するために10分間60℃で混合物を加熱する。混合物を室温まで冷まします。蛍光カルシウム指示薬オレゴングリーン488 BAPTA-午前1時（午前OGB-1）50μgのバイアルにプルロニック/ DMSO混合物4μlを添加する。その後、赤色色素（Alexa Fluor 594の、2 mMのストック溶液）1μlとOGB-1はAM 1mMの最終濃度用ピペット溶液35μlを（ 資料を参照）を追加します。で半時間のためのソリューションを超音波処理冷水浴をした後、不純物を除去するために0.45μmのフィルターで遠心分離します。
- 2.0から2.5μmの外側先端径が長いテーパーピペットを引き抜きます。ピペットに染料混合物5μlをロードします。
- ピペットの挿入を容易にし、最高品質の二光子画像を得るために硬膜の最終層を削除します。
- ピペットは皮質層2月3日にその目標に到達するために配置する必要があることを皮質表面上の正確な位置を決定する。当社所定の皮質ターゲットは方位マップ（ 図2）風車特異点である。ピペットは、チャンバ壁と客観の間を通過するように30°の角度で皮質に駆動する必要があります。このように、200μmの皮質表面下の標的領域にラベルを付けるために、皮質表面にピペットエントリの位置が目標位置（ 図3-B）に横約350μm以下となります。
- （XYステージを移動する上で動物とpipetteのマニピュレーターは、センターの目的（ 図3C）の下で皮質表面のエントリの位置に）配置されています。ピペットを簡単に開頭術の壁に沿って客観的または骨に触れることなく、皮質を入力することを保証するために、少なくとも3mmの作動距離（WD）（ 資料を参照）で20倍または40倍の対物レンズを使用してください。エントリの位置は客観下中央に配置されたら、2ミリメートル（ 図3D）による客観のZ位置を上げる。緑の落射蛍光灯が直接皮質表面エントリ位置（上記の目的の下に（と集中）、その先端が中心になるまでピペットを移動するためにマイクロマニピュレータの斜めの軸を使用し、ピペットで赤色Alexa色素を可視化するためにオンにした状態で図3E）。
- 連続OCUを通してピペットの先端を見ながらピペットは、皮質表面（ 図3F）に達するまで、ピペットを垂直（Z軸方向）下げる顕微鏡のラース。明視野照明を使用して、皮質表面の血管や残りの髄膜（軟膜とクモ膜）はピペットは皮質表面に近づくにつれて簡単に見ることができます。ピペットは、目的のエントリの位置に到達しない場合は、ピペットを高め、皮質表面上の血管のランドマークに基づいて再キャリブレーションターゲット。
- 目標を外し、開頭術から過剰な脳脊髄液を芯と糸くずの出ない吸収槍を使用して、隣接する骨を乾燥させてください。開頭術（ 図3G）を通して見える皮質を安定させるために暖かい3％アガロース（ACSFに溶解）のドロップを適用します。非げっ歯類では、3％アガロースは、ニューロンによって蛍光色素の取り込みに成功した脈動を減衰させることが必要である。 2％アガロースとカバーガラスの組み合わせが必要な安定性を提供するので、内因性シグナル光学イメージングの場合のみ2％アガロースが必要とされている。ここでは、全くカバーガラスを3％アガロースので染料ローディングステップのためにされて使用されていません必要。アガロースが固化した後、40倍対物レンズ（0.8 NAは、3.3ミリメートルWD）とACSFで再充填チャンバーを挿入します。
- 明視野からの2光子観察に切り替えて、ピペットの先端の位置を確認します。その先端が皮質（ 図3H）で所望の深さに達するまで、マイクロマニピュレータの対角軸を使用して、ピペットを移動します。染料混合物（数PSI、各パルス0.1秒）の時折圧力吐出パフ目詰まりからピペットチップを防ぐことができます。 OGB-1は細胞のみに入る時に見えるようになるだから、赤色Alexa色素は、皮質内部のピペットチップの可視化のために重要である。
- ピペットチップの深さを確認し、先端がのレイアウトに基づいてターゲットの位置にあることを確実にするために皮質表面上に再注力目的、染料の完全な用量で2月3日皮質層のニューロンをロードしようとする前に表面の血管。ピペットは、レイヤ2/3になっている場合は、染料の混合物の小さなパフが点灯します外空間と暗い影のように円形の細胞体の密集アセンブリを明らかにする。
- 大脳皮質300から600μmの直径の球に神経細胞体をロードするために、30から90パルス、各パルス1.0秒、2月10日PSIを使用して細胞外空間に染料混合物を注入します。圧力のパルスは、組織が動くように強いてはいけません。注入が完了した後、数分待ってから、ピペットと目標を削除します。完全ニューロンによって巻き取られるようにAM OGB-1を可能にするために1時間待つ。
- 染料ロードに使用アガロースを外し、録音室をすすいでください。表面で2-3％のアガロースの小滴を入れて、すばやく開頭の上にカバーガラスを配置します。蛍光色素は光に敏感なので、明視野または落射蛍光灯に皮質をオーバー露出させないようにしてください。客観的なホルダーと再中心XYステージを用いて目的の下で標識された皮質領域に高NA（1.0）の20倍の対物レンズを挿入します。 EXから開頭術をシールドtraneous光源、 例えば 、視覚刺激の表示、遮光材料の複数の層を使用しています。
4。蛍光色素の単一セルのエレクトロ
- 樹枝状形態を研究するために、100μMのAlexa Fluor 594（2mMのAlexa Fluor 594の株式のACSFで1時20希釈）の溶液を調製します。樹状突起の機能的イメージングのためにOGB塩が16,17を使用することができる。
- 1μmの先端サイズが長いテーパーピペットを引き、ピペットに染料の5μlをロードします。機能ドメインを標的とする他のすべての手順は、バルク·ロードする方法（ 図1-3）と同じです。神経細胞体の膜に隣接したピペットチップを配置するには、電極インピーダンスの増加を監視し、細胞外空間を照らすと二光子イメージング中に影のように細胞体を見るために、染料の圧力パフを適用します。
- ピペットの先端は、神経細胞体膜に隣接している場合には、適用するAxoporator 800Aを使用1-3パルス（-8〜-10 V、10ミリ秒パルス）。染料とニューロンの即時充填は2光子顕微鏡で容易に可視化される。ピペットを取り出して、in vivoでの樹状突起と軸索の高解像度の画像を収集する。
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結果
私たちの色素標識法の精度を説明するために、我々は、非げっ歯類の新皮質内の任意の既知の機能マップの最小のマイクロドメインを対象とした。まばらに一次視覚野における方位マップ全体中断特異点である。これらは、すべての優先方位が配向性の偽カラーマップ、 "風車"（ 図2A-B）のような特異点を見て周りの地域ではそのような収束するポイントで発生します。開頭当たり一風車は、特定の15大血管や動脈を避けるために確認してから、色素標識（ 図2Cに緑色の円）に選択されます。 OGB-1 AMのバルクロード機能により、指向格子視覚刺激の配列に蛍光ニューロンのカルシウム指示薬の変化を追跡することは風車の特異点の周りの単一セルの解像度機能マップ（ 図4）を明らかにする。単一セルのエレクトロポレーションを使用すると、樹状突起と軸索の空間的な組織としての風車の特異点に位置イングルニューロンを in vivo（ 図5） で決定される。
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ディスカッション
我々は、新皮質の所定の機能、マイクロドメインにおける神経細胞体（または樹状突起と軸索）の標識を対象とする方法を提案する。二光子顕微鏡によるマージ固有信号光イメージングは、ニューロンの選択が機能してマップ内のニューロンの位置、および神経回路部品と相関するかどうかを、シナプス、細胞は任意の機能マップのマイクロドメインに寄与するかを決定する可能性を提供視覚経験7または臨床的に治療薬18のアプリケーションとその変化。
刺激の向き、方向、眼球優位性や、両眼視差のためのマップは成体野生型げっ歯6,19-21の視覚野に報告されていません。しかし、蛍光色素を用いた神経細胞をロードおよびマウスに使用できる強力な遺伝学的ツールとともに、イメージング·安定性を達成するための容易さは、研究の大部分をもたらしたげっ歯類の代わりに、フェレット、ネコ、サルで行われている大脳皮質の二光子イメージングを用いた。
非げっ歯類哺乳動物の神経細胞の高分解能2光子イメージングが長いため、手術時間、厚...
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開示事項
特別な利害関係は宣言されません。
謝辞
図5Aに示すように樹状突起をトレースするためのグレース·ディオン;、この作品は、我々はまた、外科的処置の支援についてはマシューペトレルラに感謝国立眼研究所R01EY017925とR21EY020985とダナ·ホワイトホール財団からPKへの資金からの補助金によって支えられているとPratik氏Chhatbar用原稿についてのコメント。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 試薬/材料の名称 | 会社 | カタログ番号 | 注釈 | |||||
| 1。ライフサポート/実験準備 | ||||||||
| イソフルレン | ウェブスターの獣医 | NDC 57319-474-05 | ||||||
| イソフルラン気化器 | Midmark | VIPの3000 | ||||||
| フィードバック安定化された毛布 | ハーバード装置 | 50-7079F | ||||||
| ECGモニター | Digicareメディカル | LifeWindow Liteの | ||||||
| 脳波アンプ | AMシステム | 1800 | ||||||
| 脳波ディスプレイモニタ | ヒューレット·パッカード | 78304A | ||||||
| 潮のCO 2モニタを終了 | レスピロニクス | Novametrix Capnoguard 1265 | 換気を最適化 | |||||
| 掘削骨用超硬ドリルのバリ | ヘンリーシャイン | 細かい（0.5mmの先端）と粗（1.25 mmのチップ） | ||||||
| headplate /チャンバー用セメント | デンツプライ | 675571、675572 | ||||||
| ブラックパウダーテンペラペイント | サージェントアート株式会社 | 22から7185 | 遮光性を向上するためにセメントや反射を低減するために追加 | |||||
| アガロース - タイプIII- | シグマ | A9793 | 内因性シグナルと2光子イメージング中に脈動を最小限に抑えるための | |||||
| カバーガラス：5または直径8mm、厚さ0.17ミリメートル | ワールド·イン·プレシジョンインストゥルメント | 502040、502041 | 撮像中に脈動を最小限に抑えるために、カバーガラスは、必要に応じて切断してもよい | |||||
| Brudonのキュレット | ジョージ·ティーマン | 105-715-0、105-715-3 | 頭蓋骨の表面をクリーニング | |||||
| 骨ろう | エチコン | W31G | 素早く出血を止める | |||||
| 綿はアプリケーターをひっくり返した | 電子顕微鏡学 | 72308から05 | 清潔で乾燥した骨表面 | |||||
| デュモン＃5CO鉗子 | ファイン科学ツール | 11295から20 | 硬膜またはPIAの個々の層をつかむ | |||||
| Vannas春はさみ | ファイン科学ツール | 15000から03 | カット硬 | |||||
| ゼルフォーム | ファイザー | 09-0396-05 | 硬膜に出血を止めるために | |||||
| 吸収槍 | ファイン科学ツール | 18105から01 | CSFの超高速で糸くずの出ないウィッ | |||||
| 暗幕材料 | Thorlabs | BK5 | シールド開頭術 | |||||
| 2。色素製剤/注射 | ||||||||
| ジメチルスルホキシド（DMSO） | シグマ | D2650 | ||||||
| プルロニック | シグマ | P2443 | ||||||
| オレゴングリーン488 BAPTA-1 AM | インビトロジェン | O6807 | カルシウム指示薬 | |||||
| Alexa Fluor 594の | インビトロジェン | A10438 | ||||||
| 遠心フィルター（孔径0.45μm） | ミリポア | UFC30HV00 | 注射の前に不純物を除去するために | |||||
| ガラスピペットプラー | サターインスツルメンツ | P97 | ||||||
| ホウケイ酸ガラス（1.5ミリメートル外径）キャピラリーfilamented | ワールド·精密機器 | 1B150F-4 | 染料噴出ピペット | |||||
| Microloader | エッペンドルフ | 5242 956 003 | ピペットに染料をロードするための | |||||
| 極微操作装置 | サターインスツルメンツ | MP-285 | ピペットを配置するには | |||||
| 圧力パルスコントローラ | パーカー·ハネフィン | PicoSpritzer III | 染料の圧力注射用 | |||||
| 単一セルのエレクトロ | 分子デバイス | Axoporator 800A | 染料のエレクトロ | |||||
| 3。本質的なIMA変更する | ||||||||
| 4xの目標（0.13 NA、17ミリメートルWD） | オリンポス | UPLFLN4X | ||||||
| 本質的なハードウェア/ソフトウェア | 光イメージング株式会社 | イメージャ3001 / VDAQ | VDAQソフトウェアはエピソードイメージングのために使用されている | |||||
| CCDカメラ | Adimecの | Adimecの-1000 | ||||||
| 光源用電源 | 関西電力 | 15-15MのATE | ||||||
| 光源 | 光イメージング株式会社 | HAL 100 | 皮質表面での光強度は3-5 mWです | |||||
| グリーンフィルタ（血管画像用） | 光イメージング株式会社 | λ= 546nmで（バンドパス30nm）を | 表面の脈管構造の参照画像のために | |||||
| 赤色フィルター（真性信号用） | 光学ImagiNG株式会社 | λ= 630nmの（バンドパス30nm）を | 内因性シグナルを収集するには | |||||
| 熱フィルター | 光イメージング株式会社 | KG-1 | ||||||
| 4。二光子リグ/イメージング | ||||||||
| 二光子顕微鏡とソフトウェア | プレーリー·テクノロジーズ | Shen らを参照してください。光路、フィルタ、レーザーパワーのための2012 | ||||||
| Ti：サファイアレーザー | スペクトラ·フィジックス | マイタイXF | ||||||
| 20倍（0.5 NAは、3.5ミリメートルWD） | オリンポス | UMPLFLN20X | 0.5 NA対物は（ない2光子イメージングのための）開頭の上にピペットを整列させるためにのみ使用され | |||||
| 20倍（1.0 NAは、2.0ミリメートルWD） | オリンポス | XLUMPLFLN20X | ||||||
| 40倍（0.8 NAは、3.3ミリメートルWD） | オリンポス | LUMPLFLN40X/IR | ||||||
| 空気テーブル | ニューポート | ST-200 | 外部振動から準備を隔離 | |||||
| XYステージ | マイクの機械株式会社（アットルボロー、マサチューセッツ州） | XYステージ上に配置実験対象とサッターのマニピュレーター | ||||||
|
参考文献
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