筋芽細胞移植の成功を評価するための非侵襲的な手段が記載されている。この方法は、その発現が異なる撮像モダリティで撮影することができる遺伝子を統合的融合レポーター遺伝子を利用しています。ここでは、利用すること flucレポーター遺伝子配列。
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この記事について
サマリー
要約
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は3500男子 で1に影響を及ぼす重篤な遺伝性神経筋疾患であり、進行性筋変性1,2によって特徴づけられる。患者では、損傷した筋線維を再生させる常駐筋衛星細胞の能力（SCS）は4ますます効率が悪くなる。したがって、健常者の筋前駆細胞（MPCは）/筋芽細胞の移植は、DMDに対する有望な治療アプローチである。幹細胞療法の使用への主要な制限は、しかし、移植細胞の長期的なモニタリングのため、その有効性を評価するための信頼性の高い画像処理技術の欠如である。ここでは、筋芽細胞移植の成功を評価するための非侵襲、リアルタイムのアプローチについて説明します。この方法は、（ホタルルシフェラーゼ[fluc]、単量体赤色蛍光タンパク質[MRFP]とSR39チミジンキナーゼ[sr39tk]）expre遺伝子から成る統一融合レポーター遺伝子を利用していますssionは異なる撮像モダリティ9、10に結像させることができる。陽電子放射断層撮影（PET）、単光子放出コンピュータ断層撮影（SPECT）、磁気共鳴イメージング（MRI）、光学イメージング、および高周波3次元超音波を含むイメージングモダリティ、様々なユニークな長所、短所がそれぞれ、利用可能になりました11。生物発光イメージング（BLI）の研究では、例えば、比較的低コスト、高スループットであるという利点を持っています。これは、本研究では、我々はマウスに移植後の生存能力のあるC2C12筋芽細胞の短期のローカリゼーションのための融合遺伝子と生物発光イメージング（BLI）内に含まれるホタルルシフェラーゼ（fluc）レポーター遺伝子配列を利用して、このような理由からですDMDのモデル12-14（X染色体[MDX]マウスの筋ジストロフィー）。重要なのは、BLIは、標識されたMPCは、移植後の体内動態を検討するための手段を提供してくれますし、tで繰り返し細胞を追跡するために有用であろうIMEとは、次の移行。私たちのレポーター遺伝子アプローチはさらに、私たちは、単一の生体内で複数の画像診断法をマージすることができ、断層の性質、空間分解能と大きな動物とヒト10,11にスケールアップする能力を考えると、PETは、私たちが将来の仕事の基礎を形成します前臨床モデルへと臨床応用への細胞内で開発された方法の迅速な翻訳を促進することが示唆された。
プロトコル
1。 C2C12筋芽細胞の維持と伝播
- プレート75cm 2フラスコでC2C12筋芽細胞および10％の最終濃度になるようにウシ胎児血清（FBS）を添加した高グルコースダルベッコ改変イーグル血清（HG-DMEM）中で細胞を維持。これは筋芽細胞の人口を激減させるように細胞がいつでもコンフルエントになることを許可しないようにしてください。媒体は、隔日に変更する必要があります注：常に暖かい培地を37℃にして、使用する前に水浴のC。
- 筋芽細胞が約80％コンフルエントになったときに、新しいフラスコに継代細胞。培地を吸引します。トリプシン阻害血清を含む培地のすべてのトレースを削除する4〜5ミリリットルハンクス平衡塩溶液（HBSS）で細胞を洗浄します。簡単に言えば2〜3ミリリットル0.25％（w / v）のフラスコから付着筋芽細胞を解離するトリプシン-EDTA溶液で細胞層を洗浄してください。 5分間37℃でインキュベーター内でトリプシンと場所フラスコを吸引します。
- このインキュベーション中にるには、HG-DMEM/10％FBS培地9mlの持つ新しいフラスコを準備します。トリプシン処理後、培地内のすべてのセルのコレクションを確実にするために細胞やピペット4-5回に完全培地10 mlを加える。新しいフラスコに細胞懸濁液1 mlを加え、37℃、5％CO 2中でインキュベート℃、
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結果
50から60パーセントコンフルエント時に、C2C12筋芽細胞を一過上記融合レポーター遺伝子はホタルルシフェラーゼ成る構築物でトランスフェクトした[fluc]、単量体の赤色蛍光タンパク質[MRFP]とSR39チミジンキナーゼ[sr39tk]（ 図1A）。トランスフェクション効率を構築する私たちのレポーターにMRFPシーケンスを利用して、蛍光顕微鏡（ 図1B、C）を介して算出した。細胞の生存性は、BLIの基板、D-ルシフェリン（ 図1D）で標識することにより影響を受けなかった。トランスフェクション後、約100,000 MRFP発現筋芽細胞をmdxマウスの腓腹筋（以前、原稿が提出され決定される）に筋肉内に移植した。10万トランスフェクトしていない細胞が同様に反対側の制御として後肢に移植した。直ちに細胞移植後、マウスは150 mg / kgのD-lucifeを腹腔内（IP）注射したRIN。 〜20分の取り込み期間後、マウスは小動物光学スキャナ（生きた動物の生物発光と蛍光の.......
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ディスカッション
そこで本研究では、移植後の非侵襲的に標的筋芽細胞/ MPCのための高速かつ信頼性の高い分子イメージング、レポーター遺伝子アプローチを説明してきました。この研究はbioluminescenseイメージング（BLI）を介して移植されたMPCの短期的な局在を示しているが、細胞が標的とされる方法は 、実際には、簡単に安定して発現していることが細胞の移植による細胞移植の長期的評価に適用することができますレポーター遺伝子。この目的を達成するために、当社グループは、統一されたレポーター遺伝子を抱いているトランスジェニックマウス系統を生成しています。レポーター遺伝子を発現する細胞のみがBLIを使って可視化のための光子を生成するためにD-ルシフェリンを酸化させる。 D-ルシフェリンの酸化は、遺伝子発現に依存しているので、これは、非侵襲的に画像生存可能な移植細胞へと強力な技術です。 FACSにより単離し、これらのトランスジェニックマウスと衛星細胞（SCS）から収穫された筋肉組織は確かtargeteすることができますmdxマウスに移植後、D。さらに、我々はさらに、DMDの研究分野（原稿提出）に、本明細書で.......
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開示事項
著者らは、開示することは何もない。
謝辞
著者はfluc/mrfp/sr39tkレポーター遺伝子の贈り物をSanjivガンビールに感謝したいと思います。この作品は、カナダの幹細胞ネットワーク（SCN）とジェシーの旅財団によって資金を供給された。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬の名称 | 会社 | カタログ番号 | コメント（オプション） |
| C2C12筋芽細胞 | ATCC | ||
| ダルベッコ改変イーグル培地 | ライフテクノロジーズ | 12800-017 | |
| ウシ胎仔血清 | ライフテクノロジーズ | 12483020 | |
| 0.25％トリプシン-EDTA | ライフテクノロジーズ | 25200から72 | |
| ハンクス平衡塩溶液 | シグマアルドリッチ | H6648 | |
| リポフェクタミン2000 | ライフテクノロジーズ | 11668-019 | |
| ニコンエクリプスTE2000-5 | ニコンインスツル株式会社 | ||
| Xenolight D-ルシフェリン | パーキンエルマー | 122796 | PBS中40 mg / mlの |
参考文献
- Emery, A. E. The muscular dystrophies. Lancet. 359, 687-695 (2002).
- Blake, D. J., et al. Function and genetics of dystrophin and dystrophin-related proteins in muscle. Physiol. Rev. 82, 291-329 (2002).
- Goldring, K., Partridge, T., Watt, D.
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再版と許可
