水性二相系を用いた細胞の共培養パターニング

Summary

水性二相系が細胞のパターンを同時に複数の集団に使用されていました。セルパターニングのためのこの迅速かつ簡単な方法は、デキストランとポリエチレングリコールと2ポリマー溶液との間に存在する界面張力の水溶液の相分離を利用しています。

Abstract

、速く、使いやすく、手頃な価格であり、細胞パターニング技術は、ハイスループット細胞アッセイ、細胞間相互作用や組織工学システムを研究するためのプラットフォームの将来の発展のため必要となります。この詳細なプロトコルは、閾値濃度の上に組み合わせた相分離することデキストラン（DEX）とポリエチレングリコール（PEG）の生体適合性のソリューションを用いて細胞の共培養を生成する方法を説明します。細胞は、このメソッドを使用して、さまざまな構成でパターニングすることができる。セルの除外パターニングは、基板上にDEXの滴を印刷して、PEGを含有する細胞のソリューションでそれらをカバーすることによって行うことができる。 2ポリマー溶液との間に形成される界面張力はDEXの液滴の外側に落下してマイグレーションアッセイに使用することができる円形のクリアを形成する細胞が発生。細胞島はPEG溶液に細胞が豊富なDEXフェーズを分配することによって、またはDEXを覆うことによりパターニングすることができるPEGの溶液を用いて滴。共培養はDEX島パターニングによる細胞除外を組み合わせることによって直接形成することができる。これらの方法は、マニュアルmicropipetting含む液体処理アプローチの様々な互換性があり、実質的に任意の接着細胞タイプで使用することができます。

Introduction

水性二相系（ATPSs）互換性のない2つのポリマーの溶液は十分に高い濃度で一緒に混合される形。相分離は、ポリマー、溶液の温度、pH、および水性溶媒^、1,2のイオン含有量の分子量と極性を含む様々な要因に影響されます。 2ポリマー溶液が別々にある点は、選択された相系の物理化学的特性によって決まりますが、一般に、非変性条件下で低いポリマー濃度（20％未満の重量/重量）で発生し、ATPSsはバイオテクノロジーを使用することができるようにすることですアプリケーション^3-9。

これまでで最も広範囲に研究ATPSは、ポリエチレングリコール（PEG）/デキストラン（DEX）のシステムです。これらの安価で、生体適合性ポリマーによって形成ATPSはもともと分子ショニング^2、10を介して生体分子の精製の ​​ために記述されていた。分割相系に寄与しない付加的な分子や粒子をPEGとDEXと混合している場合に発生します。 DEXまたはPEGのどちらかのためにそれらの相対的な親和性に基づいて、分子や粒子が優先的に二つの相の一つの中に、またはインターフェイスに属します。 PEG / DEX ATPSの別のプロパティには、2つのポリマー相の間の界面張力の存在である。 PEGとDEXによって形成ATPSsは、一般的に、水と油のような他の液-液二相系よりもはるかに低い界面張力を表示していますが、界面張力軍はまだそのようなウイルスは、細胞やタンパク質凝集体²のような小さな粒子に効果を発揮^{、11月13日} 。哺乳類細胞上の任意の有害な影響は、これらの内に組み込まれた場合は最後に、塩の生理的濃度の存在下で低濃度（高分子量ポリマーの品種のための5％未満の重量/重量）で、より高い分子量のPEGとDEXが個別以来、いくつかありますシステム^{14から16。}

最近では、界面特性とATPSsのパーティショニング効果が細胞パターニング^{14、16から20}のための私達の研究室で適用されている。これは、PEGの存在下で細胞培養基板上に微細緻密なDEXのソリューションによって達成された。細胞は、PEG相に組み込まれている場合、それらは、PEG / DEX界面張力²⁰によるDEX滴に入るから除外されます。細胞はDEXのフェーズにパターニングされている場合、それらは界面張力とパーティション^16、17、19で細胞培養基板の表面に保持されます。

セルパターニングのための他の方法とは対照的に、ATPS細胞のパターニングは、学ぶことは簡単であり、唯一のポリマー自体、および細胞培養を行い、マイクロピペッターを使用する機能に関する初歩的な知識を必要とします。セルパターニングのための他の方法は、多くの場合、簡単に目に翻訳されていない特殊な機器と訓練を伴う電子生命科学。たとえば、いくつかの方法（マイクロコンタクト印刷やインクジェット印刷）間接的に続いて細胞接着^21,22のための部位としての役割を果たす培養基質への細胞接着性生体分子のパターンを適用することにより、パターンセル。間接的なアプローチには、いくつかの細胞型のために有用であるが、それらはユーザスキルとパターニングツールを製作するための特殊な装置の高度を必要とし、特定の細胞型/生体分子のパターンに応じて特異性を欠くことができます。あるいは、細胞を層流パターニング、ステンシルやインクジェット印刷^{23から26を}含むダイレクトパターニングのアプローチの方法によって高いパターン特異性で成膜することができる。しかしながら、これらの技術はまた、ユーザーの専門知識と特殊な装置を必要とし、印刷処理中に細胞を損傷することがあります。これらのアプローチは一般に、細胞パターニングのための生命科学分野の有用なツールであることが、細胞の正確なパターンを生成するが、それは費用対効果がなければなりません実装が簡単でND。

ここで我々は、以前に公開された出願に記載されてATPSsを用いてパターン化培養細胞を生成するための詳細なプロトコルを報告している。 micropipettorsのみを使用して、ユーザーは移動アッセイのための細胞除外ゾーンまたはセルの島を生成することができます。これはどちらかDEX期における細胞を保持またはDEXからのPEG相に堆積セルを除外PEG / DEX界面張力の方法によって達成される。これら2つの基本的なパターニング技術を組み合わせることによって、それは急速にそのような肝臓の線維芽細胞の共培養などの細胞の共培養を生成することが可能である。パターニング方法、ATPSパラメータと期待される結果を詳細に説明されています。

Protocol

1。位相システムの特性解析：相分離のための決定しきい値

1. 目的のバッファまたは細胞培養培地15 mlまたは50 mlコニカルチューブに図1（紫ドット）に示すようにPEGとDEXを含む溶液を調製します。以下、PEGとDEXは35 kDaのPEGおよび500kDaのDEXを参照しますが、臨界濃度は、使用される2つのポリマーに応じて変化します。各溶液中のPEGとDEXの質量を記録する。高濃度ポリマー溶液は、溶解するために数時間かかることがあります。ボルテックスは、無血清のソリューションを使用することができます。両方のポリマーが完全に溶解するまでのタンパク質または血清を含有する培地については、ロッキングステージにチューブを置きます。ポリマーを溶解し、初期濃度のメモを取るために使用されるメディアの重量を記録する。
2. ポリマーが完全に溶解したら、溶液は濁って見えるはずです。これは、相分離が発生したことを最初の兆候です。これを確認するには、許可ポリマー溶液を20分間室温で垂直位置で休ませる。 1,000×gで遠心分離し、相分離のプロセスを加速するために使用できます。より高密度下相はDEX-リッチになり、上相は、PEG-リッチになります。
3. ゆっくり管に、追加のバッファーまたはメディアを追加します。少しずつではなくシュート相分離点をするように使用されるべきである。
4. 溶液は遠心分離後に明らかになると、もはや、相分離した場合、相分離のためのしきい値に達しました。チューブの最終重量を記録します。
5. メディアを追加した後、相分離が発生しなくなったときのそれぞれの二つのポリマーの重量％/重量を決定する最終的な重量と一緒に、ポリマーのための前に記録した重みを使用して。
6. これらの値をプロットし、x軸、y軸および％重量/重量％、DEXで重量/重量PEGなど。 binodal曲線として知られているこのプロットは、異なるconcentratiための相分離のための閾値濃度を決定するために使用することができます特定の細胞培養培地中のPEG / DEXのアドオン。

2。構成1：除外パターニング（96ウェルプレートフォーマット）

1. 5.0パーセント重量/重量PEGおよび細胞培養培地の12.8％重量/重量DEXの別個の溶液を調製する。ポリマーは互いに対して平衡化した後ATPSが残っていることを確認するために二回少なくとも臨界点のATPSソリューションを使用しています。 PEG-rich相とその逆にDEXの少量のフラックス量があるため、臨界点以下の濃度の低下などの相系が失われる可能性が臨界濃度近く過ぎて働き。同様に、湿度と温度制御されたインキュベーターに細胞培養皿を転送するには、2つの位相特性を変更し、2つの溶液を混和することができます。注：一部の細胞は他のATPS製剤でパフォーマンスが向上する場合があります。許容される製剤は、第1部から決定binodal曲線に基づいて選択することができる。
2. 除外パットに使用される細胞を回収rning。利用できる細胞の総数/濃度を決定する。オプション：CellTrackerや蛍光顕微鏡法のための他の非細胞毒性のラベルで細胞を標識する。
3. 細胞をペレット化と排除のための細胞の必要な数を達成するために、5.0％のPEGの適切な音量でペレットを再懸濁します。例えば、96ウェルプレートのウェル1は37,500線維芽細胞は翌日合流を生成するために、PEGを200μlに再懸濁されている必要があります。他のタイプの細胞と培養基板サイズのため、必要に応じてこれらの数値をスケーリングします。
4. マイクロピペッターを用いて、乾燥した細胞培養基板上にDEXの0.5μlの液滴を分注する。大きな体積の液滴が大きく除外ゾーンを作り出す。 0.1から1μlまでの範囲のサイズの液滴は除外微細化のために推奨されています。オプション：DEX滴が前もって24時間を堆積させ、室温で脱水させることができる。これは、掃除機のパターンを生成することができます。
5. トンへのPEGの細胞懸濁液200μLを分注し彼はよくDEX滴をカバーする。
6. 37℃で12時間加湿インキュベーター℃、5％CO ₂の場所。皿は取扱い中に傾いていないこと、それはパターンの中断を避けるために、レベルインキュベーターの棚に置かれていることを確認します。
7. のPEG溶液を除去し、培地200μlで3回洗浄する。
8. 新鮮な培地とインキュベーターへの復帰を追加します。
9. 除外ゾーンに細胞の動きを観察するために定期的な文化を監視します。

3。構成2：島のパターニング（96ウェルプレートフォーマット）

1. 上記のように、細胞培養培地は5.0％重量/重量PEGおよび12.8パーセント重量/重量DEXの溶液を調製する。
2. 島のパターニングに使用される細胞を回収する。利用できる細胞の総数/濃度を決定する。
3. ペレットと島のパターニングのための細胞の所望の濃度を達成するために、12.8パーセントDEXの適切な音量で細胞を再懸濁します。 5000 CEの濃度LLS /μL以下を強く接着細胞型に対して推奨されています。難易アタッチまたは緩く付着した細胞を有する細胞は、最大10,000細胞/μlの濃度を考慮してもよい。
4. 上述のように、乾燥した細胞培養基板上に、DEXのピペット0.5μlの液滴の乾燥を避けるために迅速に取り組んでいます。液滴が乾燥させないでください。オプション：PEG溶液200μlを前もってウェルに添加することができます。 DEXの液滴は、それらが底に沈むと文化面をご連絡いたしPEG溶液中に堆積させることができる。これはクリーナー島パターンを生成することができます。
5. PEGの200μlとDEX滴をカバーしています。
6. 37℃で12時間加湿インキュベーター℃、5％CO ₂の場所。皿は取扱い中に傾いていないこと、それはパターンの中断を避けるために、レベルインキュベーターの棚に置かれていることを確認します。
7. のPEG溶液を除去し、培地200μlで3回洗浄する。
8. 新鮮な培養を追加中規模およびインキュベーターに戻ります。
9. 島からの細胞の移動と増殖を外側に観察するために定期的な文化を監視します。

4。構成3：除外共培養（96ウェルプレートフォーマット）

1. 上記のように、細胞培養培地は5.0％重量/重量PEGおよび12.8パーセント重量/重量DEXの溶液を調製する。
2. 除外と島のパターニングに使用される細胞を回収する。各細胞型のために利用できる細胞の総数/濃度を決定する。オプション：いくつかのセルの組み合わせは劇的に異なる増殖指標を表示することがあります。島パターン化細胞（特に長期の培養用）overpopulatingから除外細胞を防ぐために、2時間のためにマイトマイシンCを除外するために使用した細胞を治療したり、収穫前にそれらを照射します。これは増殖を防ぐことができます。蛍光CellTracker色素は、必要に応じて2つの細胞集団を区別するために使用することができます。
3. 細胞をペレット化し、exclusioためのペレットを再懸濁上記のように、細胞の必要な数を達成するために5.0％のPEGの適切な音量にnパターニング。上記のように、細胞の所望の濃度を達成するために、12.8パーセントDEXの適切なボリュームで、島のパターニングにペレットを再懸濁する。
4. マイクロピペッターを用いて、乾燥した細胞培養基板上にDEXの細胞懸濁液0.5μlの液滴を分注する。液滴が乾燥させないでください。
5. PEGの細胞懸濁液200μlとDEX滴をカバーしています。
6. 37℃で12時間加湿インキュベーター℃、5％CO ₂の場所。皿は取扱い中に傾いていないこと、それはパターンの中断を避けるために、レベルインキュベーターの棚に置かれていることを確認します。
7. のPEG溶液を除去し、培地を200μlで3回洗浄する。
8. 新鮮な培地とインキュベーターへの復帰を追加します。
9. 細胞集団の間の相互作用を観察するために共培養を監視します。オプション：コントロールが除外または個人ラージヒル島パターニングを行うことにより調製することができるidually、相互作用しない共培養細胞によるまたはパターニング前または後のいずれかまたは両方の細胞集団への関心の経路を遮断することによって。

Results

セルパターニングのためのPEGとDEXの適切な組み合わせを選択するには、それはbinodal曲線を決定することが重要です。この曲線はATPSが形成でき、温度、pHおよびイオン内容に基づいて、ポリマーの特定のセットで異なる場合がありますする点を区別します。カスタマイズされた培地の処方を必要とする細胞を培養するためには、実験的にbinodal曲線を決定する必要があるかもしれません。これは、はるかにbinodalとそのPEGとDEXの内容で変化する（ 図1、紫の円）からですATPSsのシリーズを生成することによって達成されます。 ATPSが存在する場合、ポリマー溶液を混合したときに曇って表示され、左側の邪魔されない場合は、別のフェーズに平衡状態になります。ポリマー混合物に追加の溶媒を添加することによって、ATPSは、PEG / 0％DEX 0％に近づきます。どこかの時点で、混合物は相分離しなくなります。これが発生したPEG / DEX濃度がbinodal曲線上の点を表します。そのポイント以上でPSはそれができない点を形成し、下記のことができます。 図1の曲線は、10％ウシ胎児...

Discussion

ATPSセルの微細化方法は、細胞培養技術における習熟度を超えて非常に少ない専門知識を必要とし、速やかに習得することができます。このアプローチの利点は、それが、安価で迅速かつ細胞型および文化の様々なフォーマットと互換性があることです。これらの理由から、我々のプロトコルは、簡単に、特に生命科学、細胞の増殖、遊走および走化性、および細胞集団の間でjuxtacrineおよびパラクリン相互作用の影響を研究する人々によって採択されるべきである。ここで紹介するアッセイは簡単にそのようなImageJのようなソフトウェアで利用可能な標準的な画像解析の手順を使用して細胞集団レベルで定量することができる。

一貫性のあるパターンを生成するために、我々は以下の注意事項をアドバイスします。各DEXの液滴がより一貫した液滴ボリュームを提供するように堆積された後、最初にDEXのソリューションを分配するために使用するピペットチップを変更する必要があります。 DEXのソリューションは、比較的粘性であるため、は、ピペットチップの外側表面上に存在するかもしれないとDEX出口のボリューム全体先端ことを保証するために過剰な...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬	メーカー
デキストラン50万kDaの	Pharmacosmos、デンマーク
ポリエチレングリコール35000 kDaの	Sigma-Aldrich社、セントルイス、ミズーリ州
ヒーラ	ATCC、マナッサス
たHepG2 C3A	ATCC、マナッサス
NIH 3T3	ATCC、マナッサス
セルトラッカー	インビトロジェン、カールスバッド、カリフォルニア州
DMEM	Gibco社、カールスバッド、カリフォルニア州
RPMI	Gibco社、カールスバッド、カリフォルニア州
[F12]	Gibco社、カールスバッド、カリフォルニア州
ウシ胎仔血清	Gibco社、カールスバッド、カリフォルニア州