方法論記事

ウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー - 高分解能質量分析（UPLC-HRMS）を使用した生物源から非標的メタボロミクス

DOI：

10.3791/50433

⸱

2013年5月20日

 ,  ,  ,  , 
1Centers for Cancer Pharmacology and Excellence in Environmental Toxicology, Department of Pharmacology, University of Pennsylvania

この記事について

サマリー

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非標的メタボロミクスは、代謝プロファイルのスナップショットを生成する仮説を提供します。このプロトコルは、細胞、血清、または組織からの代謝物の抽出と分析を紹介します。代謝物の範囲は、液 - 液相抽出、差分解析ソフトウェアに結合されたマイクロウルトラパフォーマンス液体クロマトグラフィー/高分解能質量分析法（UPLC-HRMS）を用いて調査している。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは含めて興味のある生物学的サンプルのための代謝プロファイルを分析するためのワークフローを提示し、細胞、血清、または組織。試料を最初に液 - 液相抽出により極性および非極性画分に分離され、部分的に下流の分析を容易にするために精製される。水溶液（極性代謝物）と初期抽出の有機的（非極性代謝物）のフェーズの両方が代謝物の広い範囲を調査するために処理される。代謝産物は、そのパーティション特性に基づいて異なる液体クロマトグラフィー法により分離される。この手法では、マイクロ超性能（UP）LC方法を提示したが、プロトコルがより高い流量と低い圧力に適合している。質量分析計への導入は、一般的な最適化された化合物または元の条件のいずれかを使用してすることができます。イオンの広い範囲の検出は、最近、Cでの高解像度を使用して幅広いのm / z範囲にわたって正と負の両方のモードにおいてフルスキャンモードで行われるalibrated楽器。ラベルフリー差分解析は、バイオインフォマティクスプラットフォーム上で実施される。このアプローチのアプリケーションは、代謝経路のスクリーニング、バイオマーカー探索、及び薬剤開発が含まれています。

概要

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HRMSの分野における最近の技術の進歩のために、関連性の低い、仮説生成メタボロミクスのアプローチは、複雑なサンプルの分析に実現可能なアプローチになっています。百万ルーチン低い部分を容易にし10万分解能（ppm）の質量精度が可能な1質量分析計が広くなっている複数のベンダーから入手できる。2,3この質量精度は、分析対象のID、同位体パターン認識、および付加物の識別の予備割り当てに大きな特異性と信頼性を可能にします。4適切な抽出法と高性能LCまたはUPLC、複雑な混合物と結合したときリテンションタイムデータから得られ、追加の特異性を分析することができる。5 UPLCが大きくクロマトグラフィー効率を有する、可能なメタボロームの大きいカバレッジを作る高い感度、解像度、分析時間を可能にする。6得られた大量のデータセットを任意に統合することができ多重差解析ソフトウェアおよび7,8,9,10,11推定されるヒットが最初にピーク検出アルゴリズムの組み合わせ、精密質量ベースの化学式予測、フラグメンテーション予測を用いて同定することができる。有用なパターンや目的の分析物について個々の採掘、および化学データベース検索。このアプローチは、定量化のための現在の金の標準的な方法である研究MS /選択/ UPLCまたは多重反応モニタリング時間のかかる完全な構造の識別に以上に敏感とより具体的な安定同位体希釈の開発のためのターゲットの優先順位付けを可能にします。12

生体試料の様々な性質は、尿13、セル14、血清15、または組織16の抽出プロトコルの最適化につながっている。このプロトコルの特徴抽出細胞、血清、組織のために。適切な場合には、コメントや追加の参照はmodificaのために含まれています安定同位体を含めることに対処するための手順のtions、または特に不安定な代謝物の包含のため。

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プロトコル

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1。細胞からのサンプル抽出

  1. 細胞の10センチ板の場合：事前標識を10mlのガラス遠心管にメディアで持ち上げられた細胞懸濁液1.5mlを集める。接着ラインのために、細胞を氷上で保存メディア1.5mlに優しいスクレイピングと解除されるべきオプション ：社内基準が使用されている場合は、この段階で適切な分量を追加します。
    コメント ：細胞代謝のクエンチングは、特定の代謝物のために極めて重要である。時間に敏感な代謝産物の分析のために、このような冷メタノール抽出などの手続きを考慮すべきである。17
  2. サンプルを含む10 mLガラス管の各々に6 mlのクロロホルム（CHCl 3中）/メタノール（CH 3 OH）（2:1、v / v）を追加する。 30分間低速でシェーカーまたはマルチボルテックスのサンプルを設定します。振盪後、サンプルを4℃で10分間、1,935×gで低加速/減速設定で遠心分離℃で完全に相を分離する。
    オプショナル ：CHCl 3中の使用を避けるために、抽出は（CH 2 Cl 2中 ）をジクロロメタンで行うことができる18,12。
  3. 長い茎パスツールピペットを使用して、新しいプレ標識を10mlのガラス製遠心管に有機（下）層を転送します。 4.1に進みます。
  4. きれいなプラスチック2ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに後で上部の水を移す。窒素ガス下で試料を蒸発する。水相の脱塩のために2.6.2に進みまたは直接分析のために4.1に進みます。

2。血清からのサンプル抽出

  1. プラスチック2ミリリットルエッペンドルフチューブに血清を20μlを移しオプション ：社内基準が使用されている場合は、この段階で適切な分量を追加します。
  2. 10秒間CH 3 OH、ボルテックスの190μLを加える。
  3. 10秒間のCHCl 3、ボルテックスの380μLを加える。
  4. 相分離を誘発するために、H 2 Oを120μLを加える。ボルテックスは、10秒間のサンプルと10 RTで平衡化させ分。
  5. 4℃で10分間、8,000×gでサンプルを遠心°Cのフェーズを分離する。
  6. きれいなプラスチック2ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに低い有機相を転送します。 4.1に進みます。
  7. きれいなプラスチック2ミリリットルエッペンドルフチュー​​ブに後で上部の水を移す。窒素ガス下で試料を蒸発する。
  8. 200μlのH 2 Oに再懸濁サンプル酸または塩基試薬（0.1％酢酸、ギ酸、0.1％水酸化アンモニウム）を優先的にpH感受性代謝物を抽出するために使用することができる。完全に再懸濁試料に氷上で20分間超音波洗浄します。
  9. 500μlのCH 3 OHでC18スピンカラムをアクティブにします。
  10. 500μlのH 2 Oの2回の洗浄とスピンカラムを平衡化した後、サンプルをロードします。酸/塩基試薬が使用される場合、洗浄工程では、この濃度を維持する。
  11. サンプルを脱塩する500μlのH 2 Oで洗浄します。酸/塩基試薬を使用する場合は、再度、洗浄、この濃度を維持するステップ。
  12. あらかじめ標識クリーン2ミリリットルエッペンドルフチューブにH 2 Oで3 OH CH200μlの80％の2倍量の溶出。酸/塩基試薬が使用される場合、再度、洗浄工程では、この濃度を維持する。 4.1に進みます。

3。組織からのサンプル抽出

  1. 組織によっては、凍結した組織の10から100 mgの間で使用。氷浴中で1mlのPBS（1 M、pHが6.8）で予め標識した2ミリリットル低く保持エッペンドルフチューブに組織の全部分を追加してオプション ：内部標準が使用される場合、添加する前に、バッファに追加する組織。
  2. 各エッペンドルフで30秒間電気ティッシュグラインダーで氷の中に組織をホモジナイズする。試料との間に、それぞれ、CH 3 OHとH 2 Oを含む2つの別々のチューブに組織グラインダーを清掃。
  3. あらかじめ標識を10mlのガラス遠心チューブにプラスチックピペットで組織ホモジネートを転送します。転写後、各エッペンドルフチュー​​ブをリンスCH 3 OH 1mlで2倍とガラス管の組織ホモジネートに洗浄を追加します。
  4. 組織ホモジネートおよびCH 3 OHの洗浄を含む10ミリリットルのガラス管のそれぞれにのCHCl 3 4ミリリットルを追加します。 30分間低速でシェーカーまたはマルチボルテックスのサンプルを設定します。
  5. 振とう後、完全に相を分離し、10分間1,935 xgで低加速/減速設定でサンプルを遠心オプション ：クロロホルムを使用しないように、抽出をCH 2 Cl 2で開発されている。
  6. 長い茎パスツールピペットを使用して、新しいプレ標識を10mlのガラス製遠心管に有機（下）層を転送します。 4.1に進みます。
  7. 長い茎パスツールピペットを使用して、新しいプレ標識を10mlのガラス製遠心管に水層を転送します。脱塩のために2.6.2に行くか4.1に進みます。

4。 UPLCのためのサンプルの再懸濁及びろ過

  1. SAMPを蒸発させる窒素ガス下レ。
  2. 再構成は、所望UPLC法（ 表1参照）の出発溶液の適切な量のサンプルを下に乾燥させた。 50〜100μlのは、通常、望ましい再懸濁ボリュームです。優しくボルテックスおよび/または分析物を溶解するのを助けるために上下にサンプルをピペット。
  3. サンプルが完全にフィルタ（〜5分）を通過するまで14,000×gで、最大で0.22μmのナイロンチューブフィルタとスピンに試料を移す。試料中に残っている沈殿目に見えるがないことを確認してください。
  4. インサート付き予め標識UPLCバイアルにフィルターサンプルの上清を移す。キャップバイアルは、その後サンプルバイアルの底から任意の気泡を除去するためにバイアルをフリック。チルドオートサンプラ（4-5℃）にサンプルを置きます。

5。 UPLCのセットアップ

  1. 液体クロマトグラフのための制御ソフトウェアを使用して、に示す条件をベースにして有機試料の実行を作成する表1。 。次いで、 任意 の表1に示す条件から水相のための方法を作成して、標的分析物の既知のセットは高い関心がある場合、これらの化合物の重標識アナログを用いUPLC条件を最適化し、これらの条件を使用してメソッドを生成する。
  2. UPLCが十分に平衡化することができます。これは、カラムを取り付け、新しいカラムの平衡量（通常3-5カラム容積）については、製造元の指示に従って前に溶剤の完全なプライミングを含める必要があります。将来の問題の診断に役立つ圧力をバック開始のログを維持します。

6。質量分析計のセットアップ

  1. 高分解能質量分析計のための制御ソフトウェアを使用して、 表2に示す条件を用いたポジティブモードメソッドを作成します。次に同じ条件を用いて、ネガティブモードメソッドを作成オプション ：標的分析物の既知のセットは、高いintである場合erest、最適ソースおよびこれらの化合物の重標識類似体を用いた光学条件、およびこれらの条件を使用してメソッドを生成する。
  2. きれいにし、測定器を校正、分析計に安定したスプレーを確立し、校正液が十分にソースと光学から放散するための時間を可能にします。スプレーの許容安定性は、使用されているLC法と同じ流量でキャリブレーション溶液の注射で少なくとも100スキャンにわたって強度のRSD 3〜5％を与える必要があります。
  3. すべてのサンプルのシーケンスを設定し、適切な注入量を設定して、最初のサンプルの前に空白を実行します。サンプル間のキャリーオーバーやマトリックス効果が疑われる場合は、十分な空白/洗浄を実行します。サンプルは、分析によって導入されるバッチの影響を回避するために乱数発生器と鍵を用いてランダム化された方法で設定すべきである。
    コメント ：おそらくターゲットの安定同位体標準または分析基準を含む品質管理サンプルはできる信頼性、再現性、および有効な結果のトラブルシューティングと保証する上で極めて貴重。溶媒ブランク続い標準サンプルのみの技術的複製は、ブランクランに信号強度と保持時間のずれだけでなく、キャリーオーバーにアクセスするために使用することができます。
  4. シーケンスを開始し、圧力変動、または実行渡る信号強度の損失を含む問題を定期的に監視します。深刻な問題が検出された場合は、実行を停止し、6.2から繰り返す。

7。微分解析

  1. 2つのワークフローは、このプロトコルのために提示されています。最初はSIEVE 2.0、サーモフィッシャーによって販売独自のラベルフリー微分解析ソフトウェアを使用することです。第二ワークフローがXCMSオンライン、スクリプス研究所を通じて、無料のプラットフォームを介して行われます11は 、差動解析を開始する前に、手動でのTICをチェックしたり、ランの再現性を確保するために、サンプル中の任意の既知化合物のフィルタリングクロマトグラムを見てと、すべてのサンプルを通して注入/ UPLC /スプレー安定。
  2. SIEVE
    1. 質量分析計からSIEVEがインストールされているワークステーションのハードドライブに。生データファイルを転送します。 （ 注：それは解析の速度を制限することができるようにネットワーク接続されたポートまたはUSBポート接続されたドライブに保存されたデータのふるいを実行することはお勧めできません。）
    2. SIEVEを開き、新たな実験を開始します。
    3. SIEVEに適切なファイルをロードします。
    4. 比較群を割り当て、SIEVE、分析のためのパラメータを生成できるように単一の参照ファイルを選択します。
    5. プロンプトに従って、個々の実験の要件に従って任意のパラメータを調整します。分析時間を長くすることができますそれは頻繁に戻って、より寛大な設定などのパラメータを緩め、次に厳しいパラメータで開始しすることをお勧めします。
    6. パラメータに正または負のモードの正しい付加物リストをロードします。
  3. XCMSオンライン
    1. ファイルを変換するオンラインXCMSの許容形式に。我々のケースでは、我々は形式をmzXMLに変換19
    2. オープンXCMSオンライン、およびジョブを作成します。
    3. アップロードし、データセットの名前を付けます。唯一の2つのデータセット（ 例えば 、コントロール対トリートメント）スタンドアロンXCMSは頭に頭の比較に限定されているようにアップロードすることができます。
    4. ドロップダウンリストから目的の設定を選択します。事前設定のパラメータが異なる計装のセットアップのために利用可能であり、これらは、さらに実験的なニーズに合わせて変更することができます。我々のケースでは、HPLC-Orbi2設定を使用します。
    5. ジョブをサブミットして確定します。
  4. データ解析
    1. 分析が終了したら、それぞれSIEVEとXCMSフレームと機能のリストについては、移入されます。液晶配向は、任意のランドマークピークを重ねていることを確認してください。アラインされていないLCの実行のいずれかが画期的ピークに大きな偏差を示す場合、これは、サンプルに問題があることを示している場合があります。
      オプション ：内部標準が使用される場合SIEVEは、第見つける対応するピークグループと選択したフレームに正規化する。オンラインでXCMSの場合、正規化は、エクスポート後のスプレッドシートで行うことができます。
    2. のようなサンプル集団（ 例えば、コントロールサンプル）内の変動係数（CV）によってデータをプロット。大規模CV値は、1つまたは複数のサンプルの問題を示すことができる。希望の特性（ 例えば、p値<0.05、倍の変化> 1.5、グループ内の低い標準偏差など ）に基づいてリストをソートします。
    3. グループ間で適切なピークアラインメント、ピーク積分、ガウスピーク形状、信号強度、同位体、及び付加割り当ての各ピークを調べます。
    4. さらに分析するために必要に応じてデータをエクスポートしたり、確認との MS n実験用ターゲットマスリストを生成する。

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結果

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示された結果は、農薬やミトコンドリア複合体I阻害剤ロテノンとSH-SY5Y神経膠芽腫細胞の6時間の処理から選択したデータを示す。簡潔にするために、唯一の有機相ポジティブモードデータが提示される。サンプルが処理され、上述したように分析した（ 図1、表1、表2）とラベルフリー定量化、およびSIEVE XCMSオンラインで2つの差解析プラットフォーム上にロードした。ヒットの数が多い（ 図2、図3）は 、差動解析に使用される2つのプログラムによって識別されますが、これらの機能は、おそらくアーティファクト、不完全に統合されたピークは、と疑問分析値の他の機能が含まれています。これは、適切な信号強度、同じグループのサンプルを、バックグラウンドレベル、および良好なクロマトグラフピーク形状（ 図3）との間の低い変動をヒットをスクリーニングすることによって判断することができる。

downstreを実証するために、初期のヒット曲の確認私、私たちは3 ppmの内の私達の治療化合物ロテノン（

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ディスカッション

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非標的メタボロミクスは、内因性または生体異物生物変換を調査したり、興味のあるサンプルからの代謝プロファイルを取得するための強力なツールを提供しています。サンプル、生成された大規模なデータセットに対応する能力、および有用な情報（ 例えば、精密質量データベース検索）のデータセットをマイニングする機能を分離して分析するために使用される技術の分解能と感度を持つ技術スケールの出力。最近では、これは高分解能質量分析計の進歩によって容易に、かつ高又は超高性能液体クロマトグラフィされている。差分解析ソフトウェアは、分析ボトルネックに対処して、高スループットでの保持時間シフト、フィルタリング、および統計分析のためのピーク検出調整を達成することができる。適切なインフォマティクスパイプライン20,21,22選択は、アルゴリズムセントロイディングデータに関して考慮事項を含めるべきであるピーク検出、ピーク積分、alignmenT、MS / MSデータを統合する能力、および同位体または付加物に対処する能力。適切なケムインフォマティクスデータベースの23選択も考慮すべきである。24,25,26,...

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開示事項

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著者らは、開示することは何もありません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

私たちは、NIHの助成金P30ES013508と5T32GM008076の支持を認める。またSIEVE 2.0とDRSへのアクセスのためにサーモサイエンティフィックに感謝します。ユージンCiccimaro有用な議論のためのサーモサイエンティフィック社のマーク·サンダース。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
試薬
Phosphate緩衝生理食塩水Mediatech21-031-CM
水 (H2O)Fisher ScientificW7-4(optima)
アセトニトリル (CH3CN)Fisher ScientificA996-4(optima)
メタノール (CH3OH)FisherScientificA454-4(optima)
IsopropanolFisher ScientificA464-4(optima)
クロロホルム(CH3Cl)Sigma-Aldrich366927ハザード
ジクロロメタン(CH2Cl2)Acros Organics61030-1000クロロホルム
ジエチル エーテルSigma-Aldrich を置き換える346136クロロホルム
ギ酸 (FA)を置き換えるには Fisher Scientific(optima)
NH4OHFisher ScientificA470-250(optima)
Ammonium forte (HCOONH4)Sigma-Aldrich78314
MicroSpin C18 Columns NestGroup IncSS18V
Pasteurピペットフィッシャーサイエンティフィック13-678-200
10 ml ガラス遠心チューブキンブルチェイス73785-10
10 ml プラスチック遠心チューブCellTreatCLS-4301-015
LC バイアル (ガラス)Waters60000751CV
LC インサート (ガラス)WatersWAT094171
LC バイアル (プラスチック)Waters
0.22 μm フィルターCorning8169ナイロン
2 ml Eppendorf TubesBioExpressC-3229-1Low Retention
Equipment
高分解能質量分析計Thermo ScientificLTQ XL-Orbitrap
HPLC/UPLCWatersnanoACQUITY UPLC
SourceMichrom ThermoAdvance Source
Differential Analysis SoftwareThermo ScientificSieve 2.0
nanoACQUITY C18 BEH130Waters1860035461.7 μm粒径、150 mm x 100 μm
アセンティス エクスプレス C8シグマ アルドリッチ542622.7 μm 粒子サイズ、15 cm x 200 μメートル
186002640

参考文献

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