可逆小分子またはバイオセンサー応用のためのマルチコンポーネント構造を固定化するために、マイクロ流体オンチップキャプチャ - 環化反応

サマリー

我々は、順次、オンチップバイオ直交環化学と抗体抗原取り込みを使用して、低分子の急速な可逆固定化および表面プラズモン共鳴（SPR）の研究のための官能化ナノ粒子集合体のための手法を提案する。

要約

配向および固定化密度を制御有する生物活性小分子の迅速な表面固定化のための方法は、バイオセンサー、マイクロアレイの用途に非常に望ましい。本研究では、TCO / TZ-誘導体化分子のマイクロ流体の固定化を可能にするために非常に効率的な共有結合性バイオ直交トランスシクロオクテン（TCO）の間[4 +2]環化反応および1,2,4,5 -テトラジン（Tzの）を使用する。我々は、表面プラズモン共鳴（SPR）を用いて連続流条件下で、リアルタイムでプロセスを監視する。可逆的な固定化を可能にし、センサ表面の実験範囲を拡張するために、我々は、付加環化反応と非共有結合抗原 - 抗体捕捉成分を結合する。交互にセンサ表面にTCOまたはTzの部分を提示することによって、複数の捕獲 - 環化のプロセスは、多成分構造体の様々なオンチップ·アセンブリとの相互作用の研究のために一つのセンサー表面上に今や可能である。私たちは、私バイオセンサーチップ上に2つの異なる固定化実験で、この方法をllustrate、小分子、FK506結合タンパク質12（FKBP12）に結合AP1497と同じ低分子固定化され、 その場官能化ナノ粒子中の一部として。

概要

効率的な結合反応は、バイオテクノロジーの様々なアプリケーションのために表面に生物活性分子を付着させるための貴重なツールです。最近では、非常に高速なバイオ直交トランスシクロオクテン（TCO）および1,2,4,5 -テトラジン（Tzの）間の[4 +2]環化反応は、細胞表面、細胞内構造、抗体およびナノ粒子を標識するために使用されてきた^{1。 - 7}ここでは、表面プラズモン共鳴（SPR）相互作用分析のための多成分構造の可逆オンチップ合成のために、抗原/抗体捕捉（GST /抗GST）との組み合わせで、[4 +2]付加環化反応を使用してモニターリアルタイムでのプロセス（ 図^1）。8,9特に、キャプチャ付加環化戦略が確立されたプロトコルを使用して表面の再生を可能にします^。8結果として、新たなアッセイの様々なリガンドの向きや密度を制御して安定したセンサ面の集合体フォーマットが可能になりました。使い方この戦略は、我々は、TCO / TZ-誘導体化小分子の固定化を実証し、バッファの様々な条件で環化率を特徴づける。我々は、直接、固定化GST抗原に結合した場合、キャプチャ·環戦略がその標的と相互作用する低分子の能力を保持していることを確認するために、一例として、FKBP12 ^10-12結合しFKBP12分子AP1497の間のよく知られた相互作用を選びましたまたは固定化ナノ粒子（NPS）へ。

プロトコル

1。 GSTおよびナノ粒子（NP）複合体の調製

1. GST-TCOの調製：
   1. GST（PBS中1 mg / ml）を100μlにTCO-NHS溶液8μL（DMSO中50 mm）を追加し、室温で1時間混合物を振る。
   2. のZebaスピン脱塩カラムを使用して過剰の試薬を除去。 GST-TCOコンジュゲートを含有するろ液を回収し、使用前に4℃で保存する。
2. GST-TZの準備：
   1. GST（PBS中1 mg / ml）を75μlにTZ-NHS溶液6μL（DMF中25 mm）を追加し、室温で1時間混合物を振る。
   2. PBS25μlの反応混合物を希釈し、スピン脱塩カラムを用いて精製する。 GST-Tzのコンジュゲートを含有する濾液を、使用前に4℃で保存する。
   注：質量分析（MALDI-TOF）は、平均して約10 Tzのか、TCO分子は、GSTに結合させたことを示した。
3. NP-TCOの調製：
   1. TCO-NHS溶液を100μl（DMSO中50 mM）をを追加アミノ化ナノ粒子を150μl（NP-NH _2、8.7mgの鉄/ PBS溶液で、3nmの鉄心〜8,000のFe / NP）と室温で1時間、混合物を振る。
   2. PBS緩衝液で溶出したNAP-10カラムを用いたゲル濾過によって過剰の試薬を除去する。 NP-....

結果

データおよび図は、参照8から適応されている。

向きや密度の制御付きの生理活性小分子の効率的な可逆的な固定化は、新しいバイオセンサーのアプリケーションの開発に重要な役割を果たしている。 TCOとTzの間の高速バイオ直交反応を用いて、我々は、生物学的活性を保持したリガンド面の段階的な組み立ておよび再生のための方法を記載している。 図2は、-TzをBnNH ₂の固定化のリアルタイムモニタリングを示す。 GST-TCOの溶液応答して〜400 RUの上昇をもたらすプレ固定された抗GST表面上に注入される。 TZ-BnNH ₂回目の注射は、応答の高速〜15 RUの上昇を示しています。誘導体化された抗原のいかなる解離は、構造安定性のための証拠を提供するランニングバッファーに切り替えた後に観察されない。表面は、複数のキャプチャ·環サイクルを可能にするために、サイクルの最後のステップで再生されている。私達この手順をINGとAP1497-TZ分子とTZ-BnNH ₂部分を交換すると、そのターゲットFKB.......

ディスカッション

ここで説明するキャプチャ付加環化の方法は、ラベルフリーチップベースの相互作用および動力学的研究のための修飾ナノ粒子および小分子を迅速に、可逆的な固定化を可能にします。固定化プロトコルは、<小分子リガンドの10μMの濃度を必要数分で行うことができる。リガンド濃度と接触時間の固定化密度を調節することにより厳密に制御することができる。我々のデータは、オンチップバイオ直交反応がそれらの標的と相互作用するその場での官能化ナノ粒子又は固定化された小分子の能力を維持することを示している。また、低分子量の2小分子、（TCOとTzの）間の二分子付加環化率を特徴としている。我々は、類似のアッセイは、他の高速なバイオ直交反応の速度を測定し、比較するために行うことができることを想定する。

可逆、連続した流れのオンチップナノ粒子の固定化とその場で官能化PRovidesすべての精製、固定化およびスクリーニングのための別の手順が必要です従来のナノ粒子の合成と比較すると、同様の実験^。13〜15でのスクリーニングとの相互作用解析のための修飾ナノ粒子の様々への迅速なアクセ.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Reagent
センサーチップCM5	GEヘルスケア	BR-1005-30
アミンカップリングキット	GE Healthcare	BR-1000-50
GSTキャプチャキット	GE Healthcare	BR-1002-23
NAP-10カラム	GEヘルスケア	17-0854-01
GST、1X PBS	Genscript	Z02039	1 mg/ml
rhFKBP12	R& で凍結乾燥Dシステムズ	3777-FK
界面活性剤 P-20	GE ヘルスケア	BR-1000-54
グリシン 2.0	GE ヘルスケア	BR-1003-55
Zebaスピン脱塩カラム	Thermo	89882	7 K MWCO
Amicon Ultra 4	Fisher	UFC810096	100 K 遠心フィルター
TCO-OH	Ref.8		合成
TCO-NHS	Ref.8		自社合成 ※Click Chemistry Tools #1016-25
Tz-BnNH2	Ref.8		自社合成
Tz-NHS	Ref.8	764701	自社合成 ※シグマアルドリッチ社より市販 #764701
NP-NH2 = CLIO-NH2	Ref.8		自社合成
AP1497, AP1497-Tz	Ref.8		合成
Equipment
>SPR バイオセンサー	GEヘルスケア	Biacore T100

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