FIBS対応の非侵襲メタボリック·プロファイリング

Summary

その場代謝プロファイリングで用フェルスター共鳴エネルギー移動統合生物学的センサー（FIBS）を校正する方法の説明が提示されている。 FIBSは、非侵襲的に代謝モデルおよびバイオプロセス条件のハイスループットスクリーニングの開発を補助する代謝物の細胞内レベルを測定するために使用することができる。

Abstract

計算生物学の時代に、新しい高スループット実験系では、彼らは、予測の目的のために検証できるようにしたモデルを投入し、改良するために必要である。経時データを取得する場合に、理想的にはそのようなシステムは、破壊的サンプリングおよび分析を妨げる低容積、であろう。必要とされるのは、リアルタイムでかつ非侵襲的に必要な情報を報告することができ、その場で監視ツールである。興味深いオプションは、タンパク質ベースの細胞内濃度のレポーターとして、生体内の生物学的センサーでは 、蛍光の使用である。代謝産物の定量化における用途を発見したin vivoでのバイオセンサーの一つの特定のクラスは、リガンド結合ドメインによって接続された2つの蛍光タンパク質間のフェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）に基づくものである。統合された生物学的センサー（FIBS）をFRETが構成的に細胞株内で生成され、それらは、速い応答時間およびそのスペクトルを有する茶細胞内の代謝物質の濃度に基づいて変更racteristics。本論文では、細胞内の代謝産物濃度の将来の定量化を可能にするために、構成的にグルコースおよびグルタミンFIBSを発現（CHO）細胞株、チャイニーズハムスター卵巣を構築し、バッチ細胞培養におけるin vivoでの FIBSを較正するための方法が記載されている。フェドバッチCHO細胞培養からのデータはFIBSは細胞内濃度の結果として生じる変化を検出する各々の場合にできたことを示している。独立した酵素アッセイによって確認されるようにFIBS、予め作成した検量線からの蛍光シグナルを用いて、細胞内の濃度を正確に決定した。

Introduction

代謝産物監視は、プロセス開発、メディアおよび飼料設計、および代謝工学などのバイオプロセスにおける様々な用途を有する。種々の方法は、酵素^1、化学^2、又は³結合アッセイの使用を介して濃度測定に利用可能である。興味深いオプションは、タンパク質ベースのキー代謝物の細胞内濃度のレポーターとして、生体内の生物学的センサーでは 、蛍光の使用である。小型化は、実際に信号対雑音比の^4,5を改善し、タンパク質ベースのセンサは、遺伝的に外因性試薬は代謝産物分析のために必要ではないという意味を符号化することができるように、超低容量アッセイにおいて、蛍光は便利なツールである。フェルスター共鳴エネルギー移動（FRET）バイオセンサーは、リガンド結合ドメインによって接続された2つの蛍光タンパク質からなる。 FRETは、アクセプター蛍光分子LOCATへの光励起ドナーからのエネルギーの非放射伝達ですぐ近く（<100）で編。リガンドまたは結合開裂は、順番に、発光スペクトルの変化によって測定されたFRET効率の変化をもたらす、フルオロフォアの近接性の変化を誘導し、センサのコンフォメーション変化を引き起こす。 FRET統合生物学的センサー（FIBSは）構成的に細胞株内で生産され、それらのスペクトル特性は、細胞内の代謝物質の濃度に基づいて変化する。 FIBSは動的モデル⁶用の測定を行うために最適です迅速な応答時間を有する。以前のアプリケーションでは^、7月9日 、単一および複数の¹⁰代謝物をモニターし、時空間分布¹¹上のデータを提供することを含む。リガンド結合は、エネルギー移動およびリガンド結合がより密着します（ 図1）に2発蛍光をもたらしたApo-ミンを下げるフルオロフォアの近接性を崩壊させるのApo-マックス、：FIBSは2つの構成で作成することができます。

本研究では_contentは">、プロトコルはチャイニーズハムスター卵巣構成的代謝産物、グルコースまたはグルタミンFIBSを発現（CHO）細胞株を構築するために提示されている。方法論は、将来の定量を可能にするために、インビボでセンサの較正のために確立されている図2に示すように、細胞内代謝物濃度の測定を、これに基づいて、グルコースまたはグルタミンの細胞内濃度二つの栄養素をインプロセスで高濃度で添加したものに、流加培養CHO細胞培養物で決定することができる。結果それは非侵襲的で低コストであるため、独立した酵素アッセイによって確認されるようにFIBS、予め作成した検量線からの蛍光信号を用いて、細胞内濃度を正確に予測が可能であることを実証している。このメソッドは、現在の分析技術に対する実質的な利点を提供する共通とすることができるFIBSのリアルタイム信号を与えて、高速文化を通じてitored。

Protocol

1。細胞株リバイバルとメンテナンス

1. 8mMのL-グルタミンおよび10ml / L 100×ヒポキサン​​チン/チミジンサプリメント（完全増殖培地）を補充9ミリリットルCD-CHO培地中でCHO細胞を復活させる。
2. 5分間100×gで遠心分離する。
3. 新鮮な完全増殖培地10mlに細胞を再懸濁。
4. 1ミリリットルのサンプルを取り出して、血球計数器でパンブルー色素排除法を用いて光学顕微鏡により生細胞濃度を決定する。
5. 125ミリリットル中に3×10 ⁵細胞/ mlの播種密度で培養を開始するには、振盪フラスコ。
6. 120 rpmで回転する軌道揺れプラットフォーム上で、37℃、5％CO ₂の加湿雰囲気のインキュベーター内の文化を維持している。
7. 2×10 ⁵細胞/ mlの播種密度で完全増殖培地中で3〜4日ごとに継代培養する。

2。プラスミドとC細胞株のトランスフェクションバイオセンサー遺伝子をontaining

1. 大規模プラスミド精製キットを用いてプラスミドDNAを調製する。
2. 細胞が活発にトランスフェクションの際に分裂していることを確認するために、適切な条件（37℃、5％CO _2）トランスフェクション前に12から24時間で細胞を維持する。
3. トリパンブルー色素排除法を用いて細胞をカウントし、次いで、1×10 ⁶細胞/ mlの濃度で振盪フラスコ中で125ミリリットルの細胞培養物を20mlの作業容量を準備する。
4. 使用中の細胞株について適切なトランスフェクションキットを使用してください。トランスフェクション試薬の比のプラスミドDNAは、細胞株およびベクターに依存するであろう。これは、この前の最終のトランスフェクションを実施し、製造業者によって指定された範囲内の比率の範囲をテストすることによって最適化されていることをお勧めします。また、少なくとも1つの負の対照細胞を含有する培養限定なしDNAを維持する。
5. 静的モードで4日間インキュベートした後、シャキに転送NGプラットフォームは、125 rpmで回転する。
6. キル曲線によって決定された適当な濃度にプラスミド選択のための適切な抗生物質を追加します。本研究では、ゼオシンをトランスフェクトされた細胞の選択のための400μg/ mlの終濃度に添加した。
7. 対照ウェル中の細胞が死ぬまでは、抗生物質のたびに追加し、細胞株のための適切な時間間隔でメディアを変更。
8. 文化を振っに進行することが最もコンフルエント井戸を使用してください。
9. 凍結混合物1ml中10 ⁷生存細胞を含有するクライオバイアル中に細胞を凍結することにより細胞バンクを確立する。この研究では、これは92.5％の増殖培地および7.5％ジメチルスルホキシドからなる。

3。バッチおよび流加細胞の成長曲線

1. 50ミリリットルの作業容量で振盪フラスコ250ミリリットル中のトランスフェクトされたCHO細胞の三連細胞培養を確立するために、上記の細胞の維持のための指示に従ってください。
2. cultuを維持125 rpmで回転する軌道揺れプラットフォーム上でのCO ₂ 5％で37℃、の加湿細胞インキュベーターでRES、および24時間の間隔で、各成長培養物から4.1ミリリットルのサンプルを削除します。
3. トリパンブルー色素排除法で生細胞濃度と細胞生存率を測定するために試料100μlを使用してください。
4. 生細胞濃度がゼロになるまで繰り返します。
5. 流加細胞培養は、それぞれ、36及び4mmの初期値にそれらの濃度を回復するために、6日目にグルコースまたはグルタミンの適切な量の補給のために繰り返します。なお、純水の同じ体積（ここでは12ml）で供給されるべき、追加の対照培養もまた維持されることが推奨される。

4。比測定をFRET

1. 4℃で5分間100×gで、上記のステップ3.2および遠心機で取り除か毎日サンプルの2ミリリットルを取る
2. Resusp氷冷リン酸緩衝生理食塩水（PBS）2ml中の細胞ペレットを終えた。 6穴プレートにこれを転送し、1ウェルに細胞を含まないブランクサンプルを追加します。
3. すぐに435分の465ナノメートル（青）と510分の520ナノメートル（黄色）の435分の430 nmの波長と発光波長の励起波長で、青と黄色の蛍光のレベルを測定する。
4. FRET比（検出された青色蛍光にわたって検出黄色の蛍光の比率）を計算します。

5。代謝物アッセイ

1. 4℃で5分間100×gで、上記のステップ3.2および遠心機で取り除か毎日サンプルの2ミリリットルを取る上清を取り除きます。
2. 5分間100×gで再び3ミリリットルの氷冷PBSと遠心機で細胞ペレットを再懸濁します。
3. 上清を除去し、上記のように3ミリリットルの氷冷PBSで細胞ペレットを再懸濁します。 15秒、15秒オフのパルスで3分間ずつのサンプル5Xを超音波処理。この時点で、余分な細胞必要に応じて、CTSは凍結することができる。
4. （材料の表を参照）、細胞内のグルコース濃度を決定するために、細胞抽出物試料について、製造業者の指示に従って、適切なグルコースアッセイキットを使用する。
   注：標準曲線を構築するために適切な基準を使用してください。本研究では、基準の濃度は0〜100 mMの範囲であった。
5. 規格の測定値を使用して、標準曲線を構築し（この場合：yは1310.51x - yは吸光度の読み取りであり、xはグルコース濃度であり723.43）最良適合の直線式を見つける。
6. 標準曲線を使用して、アカウントへの希釈を取ってグルコース濃度を計算します。細胞内のグルコース濃度は、この式を用いて計算することができる。
   
   CHO細胞については、単一細胞体積は^、12μM12の気泡径を算出した
7. （材料の表を参照）、細胞内グルタミン濃度を決定するために、細胞抽出物試料について、製造業者の指示に従って適切なグルタミンアッセイキットを使用する。
   注：標準曲線を構築するために適切な基準を使用してください。本研究では、基準の濃度は0〜2 mMの範囲であった。
8. 上記5.5のように、検量線（この場合はy = 203.1x + yは吸光度の読み取りであり、xはグルコース濃度である17.1）を構築
9. 標準曲線を用いて、希釈を考慮に入れて、サンプルのグルタミン濃度を算出する。細胞内グルタミン濃度は、上記の式1を用いて計算することができる。

Results

方法論の概要を図2に示す。本明細書に提示される研究では、CHO細胞をFIBSベクターおよび安定な細胞株にトランスフェクトした400μg/ mlのゼオシン抗生物質の圧力で選択した。構成的にグルコースおよびグルタミンのセンサーを発現する二つの別々の安定な細胞株は、従って作成された。 図1は、本研究で使用される2つのバイオセンサーの構成を示す図である。グルコースセンサは、アポ - 最大原理に基づいており、対応するプラスミドをpRS​​ET-FLIPglu600μΔ11Aphroditeである。これは、E.のF16A変異体に対する増強 ​​シアン蛍光タンパク質（ECFP）、強化黄色蛍光タンパク質（EYFP）のアフロディテ変異体の融合である大腸菌グルコース/ガラクトース結合タンパク質をペリプラズム。 11個のアミノ酸残基は、FRET効率^を向上させるために¹³リンカー領域から除去した。このベクターを用いてpCDNA4/TO uniqのベクターにクローニングしたサイトメガロウイルスプロモーターおよびSV4...

Discussion

FIBS焼入れおよび抽出方法に起因する不確実性を取り除く、この場合、増殖制限栄養素で、 生体内で 、キー分子のその場での定量に有効。知見はFIBS信号及びグルタミングルコースおよび0.3-2 mMの1-5 100mMの範囲で細胞内濃度との間に良好な相関関係があることを示唆している。バッチCHO細胞培養において、これらの濃度は、指数関数、固定、および早期衰退段階で遭遇する。指数関数と固定相は、適切な給餌戦略の設計の点で最も重要である。細胞の代謝要求を推定するため、これらのバイオセンサーの使用は、工業的に適切である。流加実験の結果は、細胞内のグルコースおよびグルタミン濃度の推定値を提供することFIBS '適合性を確認する。早い時点で展示偏差が低いため、生細胞のNumの生じている可能性グルコースFIBSの場合、およびグルタミンFIBSの場合は他のアミノ酸によってガラクトースなどにより 、および/ ​​またはあるため他の代謝物による干渉のBERは、。具体的には、FRET比で20％までの減少がアスパラギン酸、グルタミン酸、グリシン、スレオニン、バリン、チロシン

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
CHO-S Cells	Life Tecnologies	11619-012	細胞株は、研究の目標によって異なります
pCDNA4/TOベクター	Life Tecnologies
TransIT-PRO トランスフェクション試薬	Mirus Bio	MIR 5700	トランスフェクションは、研究中の細胞株に適した任意の方法を使用して達成することができます
Zeocin	Invivogen
CD-CHO培地	Life Technologies	10743-011	細胞増殖培地は、研究中の細胞に依存しています
100x HT サプリメント	ライフ技術	11067-030
L-グルタミン 200 mM (100x)、リキッド	ライフ テクノロジー	25030032
InfinitePRO 200 プレートリーダー	Tecan	FLx800TBI	必要な波長にアクセスできる任意の 96 ウェル蛍光プレートリーダーを代用可能
プレートリーダー用フィルター	Tecan	30000463
Maxiprep プラスミド精製キット	Qiagen	12163	任意の適切なキットを代用可能
Amplex Red グルコース/グルコースオキシダーゼアッセイキット	Invitrogen	A22189	適切なキットを代用可能
EnzyChrom グルタミンアッセイキット	BioAssay Systems	EOAC-100	任意の適切なキットを代用可能
改良型ノイバウアー血球計算盤	フィッシャーサイエンティフィック	MNK-420-010N
インキュベーター	ヌアイレ	NU-5510E