マウスにおける造影MRIによる視神経線維の整合性in vivoイメージング

サマリー

このビデオでは、ナイーブマウス視覚投影の造影MRイメージングのための急性視神経挫滅損傷および慢性視神経変性に関連視神経変性の繰り返しと縦のin vivo試験では、臨床3 Tスキャナを使用して、方法を示しているノックアウトマウス（P50 ^KO）。

要約

齧歯類の視覚システムは、視床と中脳の中心を入力する視神経を形成する網膜神経節細胞とその軸索を包含し、視覚野のシナプス後予測。その明確な解剖学的構造、便利なアクセス可能性に基づいて、ニューロンの生存、軸索再生、およびシナプス可塑性の研究のために好ま構造となっています。 MRイメージングにおける最近の進歩は、マンガン媒介コントラスト強調（MEMRI）を使用して、この突起のレチノ-視蓋部分のin vivo可視化を可能にした。ここでは、（200ミクロン^）3の解像度は一般的な3テスラスキャナを用いて達成することが可能なマウスにおける視覚投影、MEMRIを説明するためのプロトコルを提供する。私たちは、15ナノモルのMnCl ₂の単回投与量の硝子体内注射は24時間以内で完全な投影の飽和向上につながる方法を示しています。網膜を除いて、信号強度の変化が独立しているその一致視覚刺激または生理的老化の凹み。私たちは、縦方向に、この手法をさらに適用する軸索急性視神経損傷を受けて変性症はMn ^{2 +}輸送によるパラダイム病変部位で完全に逮捕を監視します。逆に、活性^の Mn ^{2 +}輸送は、生存率、数、および軸索線維の電気的活性に定量的に比例する。このような分析のために、我々は視覚的な突起を含む感覚の自発的な萎縮を表示するトランスジェニックマウスモデル（NF-κB活性P50 ^KO）での視覚的なパスに沿って^の Mn ^{2 +}輸送動態を例示している。これらのマウスでは、MEMRIは減少したが、このようにしてNF-κBの突然変異により、構造および/ ​​または機能障害の徴候を明らかにし、野生型マウスと比較して^の Mn ^{2 +}輸送を遅延しないことを示します。

要約すると、MEMRIは便利in vivoアッセイを橋渡しし、characterizatiための死後の組織学を投稿神経線維の完全性と活動の上。これは、縦方向の軸索変性と再生に関する研究、本物または誘導性表現型変異マウスの調査のために非常に有用である。

概要

その有利な神経解剖学的構造に基づいて、げっ歯類の視覚系は、神経保護¹又はプロ再生効果^2,3を媒介するために、薬理学的化合物およびそれらの能力を評価するためにユニークな可能性を提供しています。また、最近では、シナプス前足場タンパク質ファゴット^4を欠損したマウスで例示したように、マウスの突然変異体の機能的および神経解剖学的特性の研究を可能にします。さらに、補助的なツールの広いスペクトルが電図および行動試験、および固有信号の光イメージングによる皮質再配列の決定により、 例えば 、網膜神経節細胞（RGC）とのRGC軸索番号だけでなく、RGC活性の特色に追加与える。レーザー顕微鏡の最新技術開発が視神経（ON）と脳のホールマウント標本の深い組織蛍光イメージングによってRGC再生の現場での可視化を可能にする。このhistolog中iCalのアプローチは、光シート蛍光顕微鏡と組み合わせて、テトラヒドロフランに基づく組織のクリアをONに求心路遮断および視索⁵に再入力する単繊維の解像度を可能にします。このような技術は、解像度と成長パターンの決定に優れているかもしれませんが、彼らは、特に長期的な再生過程を評価することが望まれている個々の成長の節目、の繰り返しと縦の分析を有効にしないでください。

造影MRIは、マウスおよびラット^6,7における網膜視蓋投影の....

プロトコル

全ての動物介入は実験動物の動物実験のための欧州条約および眼と視覚研究における動物の使用に関するARVO声明に従って行われる。全ての実験は、地元の倫理委員会によって承認されています。マウスにおけるON損傷の手順は、他の場所に記載されている^9。

1。硝子体内注射マンガン

1. アシスタントの助けを借りて、スキャン前にMRにマンガン^{2 +}注入24時間後に行う。 （滅菌PBS中で420〜450 mg / kg体重）5％抱水クロラール溶液の腹腔内注射により動物を麻酔。追加の局所麻酔のため、前目の穿刺に角膜に液体conjuncain一滴（0.4％塩酸オキシブプロカイン）を適用。目ごとに15ナノモル^の Mn ^{2 +を}注入するには、132のLH _{2 <}中1MのMnCl ₂ストック溶液1リットルに希釈することによって、 例えば 、7.5のMnCl ₂溶液を調製/サブ> O。 34gの小さなハブリムーバブルニードル（RN針）に接続されている5μLハミルトンシリンジに最終溶液の負荷5μL。
2. 右目で始まる場合には、双眼顕微鏡下で、ゆっくりと開いた左側のマウスを置き、左手の親指と人差し指の間に右目を修正。右手で注射器を手に取り、先端に近い針を手に取る。眼球の非外傷性....

結果

正確に視覚投影の活力と機能性を評価するために、このイメージング技術の能力は、硝子体とのRGCによるその取り込みに非毒性^の Mn ^{2 +}投与量の正確なアプリケーションに依存している。この主要な仮定は、層の特定^の Mn ^{2 +}取り込みがオートメタログラフィー（TIMM染色^）21によって実証されている図1にテストされています。網膜切片を対照として15ナノモルまたは150ナノモル^の Mn ^{2 +、}またはPBSのいずれかのivit塗布後 24時間で分析した。 PBSは、網膜は、信号で増強されていない注射し、一方、（点線N = 3）、この時点ではMn ^{2 +}網膜は、MRI加重T ₁における最大シグナル増強を示して注入された（N = 3;点線）（ 図1 、）のパネルを残しました。 150ナノモル注入された目の中hyperintensiveシグナル増強に注.......

ディスカッション

視覚系のMEMRIはナイーブおよび病理学的条件下での機能性を評価するための従来の神経生物学の手法を拡張します。離れて孤立した中枢神経系の線維トラクトの整合性にユニークな洞察を提供するから、MEMRIを簡単に視覚に指定されたパラダイムの即時の影響を調査するために、行動試験、 例えば 、検眼、視覚ベースの水作業を補充することができます。また、電気生理学的およびin vivoでの機能的な視覚的特性評価と組織学的調査をリンクします。技術はマイナーな個人間で高い信頼性と再現性がある（ 図3、図4中のエラーバーを参照）、同一グループ内で差異。興味深いことに、15ナノモルの用量ではMn ^{2 +}取り込み及び軸索輸送そのシグナル増強は、追加^の Mn ^{2 +}電源⁹によって上昇することはできませんプラトーに達するように、飽和プロセスです。実用的な観点からビュー、このような用量反応シグナル増強に特徴的な最小化し、少なくともある程度、注入に関連するバリエーション。注目すべきことに、投与量およびMn

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
塩化マンガン(II)溶液 1 M	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	M1787	MEMRI造影剤
Conjuncain	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 7617666	0.4% oxybuprocaine hydrochloride
Floxal eye drops	Dr. Mann Pharma, Berlin, Germany	PZN 3820927	3 mg/ml ofloxacin
軟膏 panthenol	Jenapharm, Jena, Germany	PZN
クロラール水和物	シグマアルドリッチ、タウフキルヒェン、ドイツ	C8383	420-450 mg / kg体重
ハミルトンシリンジ	ハミルトンカンパニー、リノ、ネバダ州、米国	7634-01	SYR 5 & マイクロ;l, 75 RN, no NDL
34 G needle (34/35/pst4/tapN)	Hamilton Company, Reno, NV, USA	207434/00	取り外し可能な針 RN, 34 G, 長さ 38.1 mm, ポイントスタイル 4
双眼鏡 Stemi-2000	ツァイス, オーバーコッヘン, ドイツ
3 T MRI スキャナー Magnetom TIM Trio	Siemens Medical Solutions, エアランゲン, ドイツ
ラットヘッドコイル	Doty Scientific Inc., Columbia, SC, USA
マウスホルダー			カスタムメイド
赤色光ランプ
冷凍セクションミディアムNEG-50	モフィッシャーサイエンティフィック、シュヴェルテ、ドイツ	6502	切片用組織埋め込み
水素リン酸ナトリウム一水和物(NaH2PO4·H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	硫	化物灌流106346
非水和物 (Na2S·9H2O)	Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany	208043
Gum arabic	Roth, Arlesheim, Switzerland	4159	for TIMM staining
Hydroquinone (C6H6O2)	Roth, Arlesheim, Switzerland	3586
クエン酸 (C6H8O7)	Roth, Arlesheim, Switzerland	6490
クエン酸三ナトリウム二水和物 (C6H5Na3O7·2H2O)	Merck, Darmstadt, Germany	106448
硝酸銀 (AgNO3)	Roth, Arlesheim, Switzerland	7908

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