方法論記事

ファージディスプレイされた合成抗体ライブラリーから、スケーラブルな高スループットの選択

DOI：

10.3791/51492

⸱

2015年1月17日

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1The Recombinant Antibody Network, 2The Banting and Best Department of Medical Research, University of Toronto, 3Antibiome Center, University of California, San Francisco at Mission Bay, 4Department of Biochemistry and Molecular Biology, The University of Chicago

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

この方法は、同時に、抗原の何百に対するファージディスプレイコンビナトリアル合成抗体ライブラリーから、スケーラブルで高スループットの選択を行うための視覚的な伴奏して説明する。このパラレルアプローチを使用して、我々は、標準的な免疫アッセイにおいて機能的に多様な抗原に対する高い親和性および特異性を示す抗体断片を単離した。

要約

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両方の基礎および臨床研究用途のニーズを満たす抗体に対する要求が高く、劇的に、将来的に増加する。しかし、伝統的なモノクローナル技術は、このタスクまでだけではないことは明らかである。これは、プロテオームのアクセス可能なすべての要素を、高品質で再生可能な親和性試薬の需要を満たすために別の方法が開発された。そのために、ファージディスプレイされた合成抗体ライブラリーからの選択を行うためのハイスループット法は、多様な抗原を伴う用途のために考案されており、迅速なスループットと成功のために最適化された。ここで、プロトコルは、ビデオデモを手動96チャンネル液体ハンドラーまたは自動ロボットシステムのいずれかを使用してターゲットの数百に対して高い多様性ライブラリからのFabファージクローンの並列選択を示して詳細に説明する。このプロトコルを使用して、1人のユーザーが抗原の数百を生成することができ、並行して、それらに対する抗体を選択して、6〜8週間以内に結合する抗体を検証する。強調表示は、i）生存抗原フォーマット、ii）の事前選択抗原の特徴付け、iii）の特異的かつ高親和性クローンの選択に影響を与える重要なステップが、監視の選択の有効性および早期の抗体クローンの特徴付けのiv）の方法。このアプローチでは、我々は、シングルパス膜受容体を含む多くのターゲットクラスに分泌されるタンパク質ホルモン、及びマルチドメイン細胞内タンパク質を合成抗体断片（Fabを）取得している。これらの断片は、容易に完全長抗体に変換され、高い親和性および特異性を示すことが確認されている。さらに、それらは、ウエスタンブロッティング、ELISA、細胞の免疫蛍光、免疫沈降、および関連アッセイを含む標準的な免疫アッセイの様々な機能的であることが実証されている。この方法は、抗体の発見を加速し、最終的に目標Oの実現に近づく私たちをもたらすでしょうfのプロテオームの再生、高品質な抗体を生成する。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ポストゲノム時代の開始と、特徴づけるおよびタンパク質を調節する高品質の結合試薬の利用可能性は、新たな研究および治療の道を開くことが不可欠である。抗体は、基礎研究および診断ツールおよび潜在的な治療薬として、学術および産業研究者の両方に重要であり続ける。当然のことながら、カスタム抗体を生成するために、従来のハイブリドーマ技術に依存してそのほとんどが契約抗体開発企業の印象的な成長があった。それにもかかわらず、ファージディスプレイ抗体ライブラリーを用いたin vitroの選択は、従来の技術では限界が1、2に直面することができますユニークな利点と成功を提供することができる強力な代替技術になりつつある。

研究ツールとして、高品質の抗体についてのかなりの需要に照らして、再生可能な抗体を生成するための2つの主要な課題は、1）選択スループットおよび2）抗原avはあるailability。グループの数は、現在のスループットおよび抗体認識の速度を増加させることを目的とインビトロ選択パイプに記載されている。これらの説明は、詳細完全長ビーズベース6,8-またはプレートベース3,4抗原固定化スキームのいずれかを使用して、3,4、または構造的に関連するドメイン5,6,7を標的とするいずれかの際に選択することを含む実行可能な種々のアプローチを。さらに、遺伝子合成技術9の成長採用が合理的に費用効果と潜在的に精製された、完全長の抗原の十分な量を得ることが困難を緩和することができ、特に、単離されたドメインから、体系的抗原の生成を行った。タンデムに二つの技術を用いて、自己完結型のスケーラブルな抗原生成および抗体選択パイプラインは、発現される抗原ドメインの大きなセットのための抗体の並列単離を可能にし、茶のための試薬の開発を容易にするよう考案された構造的または機能的に関連するタンパク質の全体のクラスをracterizing。

この目的、表現可能な抗原ドメイン、遺伝子合成のインシリコ同定カップル統合されたパイプラインに向けて、抗原と拡張性のファージディスプレイされた抗体の選択のハイスループット細菌発現が開発されている。このパイプラインは、（ライセンスまたは材料移転契約を通じて、ますます利用できる抗体ライブラリを含む）は、ほとんどの生命科学研究室が利用できる唯一の​​基本的なインフラを必要としますが、工業規模での使用のためにも、自動化に適している。このプロトコルを使用して、親和性タグ化抗原ドメインの数百を生成することが可能であり、日常的には、これらの抗原の多くに非常に特異的な抗体断片を単離する。

ファージディスプレイ技術は、Fab、scFvは、自律のFvドメインであり、aを含む組換えアフィニティ試薬のさまざまな形式で実証互換性を示している小さ ​​な「代替フレームワーク」（設計されたアンキリンリピートタンパク質（ダルピン）、フィブロネクチン（FN）、リポカリンドメインと10以上）の成長配列。それは、これらの方法は、ライブラリーの他のタイプに適合させることができると推測されるが、議論は、Fab抗体フラグメントの単離この実施例では制限されている。この技術を用い、小さな低ナノモル親和性を有するFabを、全長タンパク質に結合し、そのような免疫蛍光法などのイムノアッセイにおいて機能的である多くはRNA結合タンパク質などが正常に選択された転写因子ドメイン、SH2ドメイン、を含むタンパク質ドメインをタグ付け、免疫沈降および免疫組織化学。重要なのは細菌の生産の提供を通じて、組換え結合クローンは、完全に再生可能であると表現構築から再生成することができ、したがって、厳密なクローンの検証の費用を正当化、一貫性、再現性と費用対効果を増加させた。

このPROTでocol及び添付ビデオは、固定化抗原ドメインを使用してファージディスプレイライブラリーからの抗体選択のための基本的な方法が実証されている。この特定の方法はまた、首尾よく使用されてきた13,14,2他のタグ11,12,13および選択フォーマットが、マイクロウェルプレートに受動的吸着により固定化されたGSTタグ付きタンパク質ドメインを使用する。特定と検証のために特別に濃縮されたクローン性抗体を単離することを目的とした選択パラメータの並列モニタリングと選択の設定や行動のための重要な考慮事項が詳述されている。

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プロトコル

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1.抗原ジェネレーション

注：抗原ドメインを合成し、適切なIPTG誘導発現構築、商用、さまざまなベンダーによってクローニングすることができる。

  1. 化学的にコンピ、T1-ファージに発現構築物をトランスフォーム耐性、BL21 E.化学的コンピテント細胞の20 Lを加えた96ウェルPCRプレート中で、氷上で1×KCM20μlの中でDNAをコードする10ngの混合による大腸菌細胞 。
  2. 室温で10分間、20分間、氷上で細胞/ DNA混合物をインキュベートし、次いで氷上で再び2分間通気性のプレートシールで、グルコース（SOC）培地で予め加温し超最適ブロス100μlのレスキュー覆う前と2.5センチメートルオービタルシェーカーで200rpmで1時間37℃で振とう。
  3. ルリア - ベルターニ（LB）カルベニシリンを補充/寒天プレート（100μg/ mlの）とのために使用される単一のコロニーを得るためにO / Nを成長する上で形質転換細胞のプレートを5μlグリセロールストックを生成する。
  4. 5μlのグリセロールストックとの2YT /炭水化物のメディアの1ミリリットルを接種し、2.5センチメートルオービタルシェーカーで200rpmで振とうしながら96ウェルディープウェルブロック中で37℃で12時間成長する。
  5. NZYのmedia15に接種し、この培養物の1：40希釈物と（0.05％グルコース、2％のラクトース、および100μg/ mlのカルベニシリンを補充した）、その後2.5センチメートル軌道で30℃、200rpmで6-8時間振盪シェーカー。
  6. ペレット細菌および以前に公開protocols16,17に従ってNi-NTA樹脂を100μlを含む96ウェルフィルタープレートでハイスループットで抗原タンパク質を精製する。
  7. ブラッドフォード色素結合assay18によって精製したタンパク質の濃度を測定し、SDS-PAGEゲル上で分離し、クマシー染色で10〜50μgのの可視化によって大きさや純度を特徴づける（ 図2を参照）。
    注：この段階で、タンパク質はさらに、タンパク質凝集19を評価する方法を特徴とすることができるまたは抗原の性質及び選択パイプラインの要件に応じて20を折り畳む。

ファージライブラリーの調製と滴定

  1. T1ファージ耐性E.の単一コロニーを選択してください大腸菌を50μg/ mlのテトラサイクリンを補った2YT培地の1ミリリットルへの細胞。
  2. 細胞増殖が視覚的に確立されると、2YTの大きなボリュームでの培養を希釈（ライブラリー希釈につき、一般45μL、下記参照。）感染症のための細胞の十分な容量を確保するために、50μg/ mlのテトラサイクリンを補足した。
  3. 30分間ペレット化、氷上でインキュベートし、オートクレーブ処理の20％PEG-8000の1/5体積、2.5 MのNaCl（PEG-NaCl）で保存緩衝液からのファージを沈殿させることによって使用するためのライブラリーを作製するには、12000×gで遠心分離することによってファージを沈殿させた。
  4. 上清及び再懸濁をtを調整すること、1×PBS pH7.4中、0.2％BSAおよび0.05％のTween（PBT）の適切な容量のファージを沈殿させ捨てるOの選択のための適切なファージの濃度は、必要に応じて、適切なライブラリのカバレッジを確保する。ステップ2.9と議論を参照してください。
  5. 、無菌のマルチウェルプレートに1×PBS pHが7.4の45μLに5μlのファージのアリコートを希釈混合し、同じ緩衝液中で10倍希釈系列を作成します。
  6. T1ファージ耐性Eの45μlに各ファージ希釈の5μlを添加する。大腸菌別のマルチウェルプレート中で対数増殖期（OD 600 = 0.4〜0.8）の細胞は、通気性のシールでカバーし、2.5センチメートルオービタルシェーカーで30分間、200rpmで振とうしながら37℃でインキュベートする。
  7. 100グラム/ mlのカルベニシリンとコロニーが見えるまで37℃でO / Nを成長さを補った予め温め寒天プレートに上のウェルのそれぞれから感染した細胞のプレート5μL。
  8. 次のように全体のファージ/ mlのを計算します。
    最も希薄サンプル×200×10 のi（ただし、i =最大NUMでカルベニシリンプレート上のコロニーのファージ/ mlの=数希釈液のファイバれるコロニー）が明らかである。
  9. 次のようにライブラリの多様性のカバレッジを確保するために、コーティングされた抗原井戸の数を決定するには、計算します。
    コー​​ティングされた抗原井戸の数が必要=
    理想の倍のカバレッジ*ライブラリの多様性
    100μlのあたりファージの＃

ファージディスプレイライブラリーから3抗体選択

3.1）抗原の固定化

  1. 抗原の品質に影響を与えることができるし、希釈を容易にするために、凍結融解サイクルを回避するために、非結合96ウェルプレートの中の100×作業濃度（ 例えば、500グラム/ ml）のアリコートに正規化ストック抗原タンパク質プレートを準備。
  2. PBSでストックプレートから希釈することにより、1日以前の選択の各ラウンドに株式タンパク質溶液からの抗原でコーティングされたプレートを準備します。
  3. GSTタグ化抗原タンパク質または陰性対照pの100μlのコート96ウェル高タンパク質結合性ポリスチレンプレートrotein PBS中5μg/ mlの（GST、BSA、ニュートラアビジン等）。マイクロプレートシェーカー上で250 rpmで4℃CO / Nで振る。
  4. コー​​ティングされたからのタンパク質溶液を除去するマイクロプレート、緩衝液（1×PBS pH7.4中の0.2％BSA）でブロックし、200μlの抗原コーティングされた、負の選択プレートをブロックし、1〜2時間、室温で250rpmで振とうする。
  5. ブロッキング後、0.05％のTween（PT）手動または自動化されたマイクロプレート洗浄機を使用してバッファーで1×PBS pH7.4の200μlのブロックされたタンパク質でコーティングされたプレートを4回洗う。

3.2）ライブラリプリクリアランスおよび抗原ファージインキュベーション

  1. ネガティブコントロールタンパク質または無料の親和性タグでコーティングしたウェルの数にPBT緩衝液中で調製ファージライブラリを100μl（10 12ファージ）の移動を介して非（またはTAG-）特異的結合ファージディスプレイ抗体フラグメントクローンのライブラリーを破壊するタンパク質（ 例えば、GST）ターゲットの数に相当し、ファージをインキュベート250rpmで振とうしながら室温で1〜2時間のためにウェル中。
    注：代替またはネガティブ選択の追加の手段として、インキュベーションはまた、過剰の存在下で実施することができる（5-25μM）可溶性タンパク質の親和性タグ（ 例えば、GST）をさらにタグ結合クローンを除去し、特定のターゲットの回復を促進する結合クローン。
  2. 抗原コーティングしたプレートにネガティブ選択からのファージ上清を移し、特異的結合クローンの捕獲のために、250rpmで振とうしながら室温で1〜2時間インキュベートする。
  3. 未結合のファージを除去し、マイクロプレートのウェルを洗浄8-15回PT緩衝液で手動またはマイクロプレートウォッシャーを使用して。溶出直前に過剰洗浄バッファーを削除します。

3.3）溶出、感染およびファージ増幅

  1. 初期の選択の日には、T1ファージ耐性E.の単一コロニーを選択大腸菌 2YT培地の1ミリリットルへの細胞を、50μg/ mlのテトラサイクリンを補足し、37℃ののWiで成長2.5センチメートルオービタルシェーカーまたは同等で200rpmで振盪番目。
  2. 細胞増殖が確立され、目で見ることができたら2YTは（一般的に選択当たり100μlウェル）感染細胞の十分な容量を確保するために、50μg/ mlのテトラサイクリンを補足して、メディアの音量を上げる。
  3. 0.4〜0.8のOD 600が結合したファージを洗浄した抗原プレートに細胞100μlを追加し、30分間37℃で振る溶出するために、次に、（約5-7時間）に達するまで細胞を増殖させる。
  4. 1×10 10 cfu / mlでの最終濃度になるようにM13K07ヘルパーファージを加え、200rpmで振盪しながら45分間37℃でインキュベートする。
  5. 2YTの1.2ミリリットルに転送細胞はV底96ウェルディープウェルブロックに150 / mlのカルベニシリンおよび75 / mlのカナマイシンを添加し、2.5 cm単位で200 rpmで振とうしながら37℃でO / Nを育てるオービタルシェーカー。

3.4）は、ファージの調製とセレクの繰り返しラウンドン

  1. 4℃で15分間、4000×gでの遠心分離によってペレット細菌。
  2. 10X PBTの1/10容量で中和し、ミックス、ミニチューブ、96ウェルの滅菌マイクロプレート青いボックス内で複製プレートからのファージ上清を等量混ぜる。選択の繰り返しラウンドは3-4ラウンドの（ ステップ3.1.1から開始）または濃縮が観察されるまで負の制御タンパク質と比較して（セクション4と7を参照）。
    注：選択の初期段階で重要な/検出可能な濃縮は予想されないとき（ すなわち、1丸めおよび2）、（ 図3に示す第7の代表的結果参照）入力および出力ファージ力価の定量を確保するのに役立つかもしれない（ディスカッションに記載されている）成功した​​選択のための最小のファージ濃度と、プールのELISAよりも適切である。

プールされたELISAによる4キャラクタリゼーション

  1. コー​​ト96ウェル高タンパク·バインド3.1項に従ってを2μg/ mlの抗原タンパク質または陰性対照タンパク質（GST、BSA、ニュートラなど）のGSTタグ付き100μlのポリスチレンプレートをると4℃CO / Nで振る。
  2. 、過剰抗原を外しマイクロプレートシェーカー上で250rpmで、室温で1〜2時間振盪しながらブロッキング緩衝液200μlのプレートをブロックし、どちらの手によってまたは自動プレート洗浄機により200μlのPT緩衝液で4回洗浄する。
  3. 、RTで15分間、250rpmで振とうし、200μlのPT緩衝液でプレートを8回洗浄するファージ上清（PBT緩衝液中の20：10-1 1に希釈）を100μlを適用する。
  4. 抗M13-HRPを100μl（：PBTバッファ内の5000 1）を追加します。その後、200μlのPBSで二回200μlのPT緩衝液でプレートを6回洗浄し、RTで30分間、200rpmで振とうする。
  5. 1100μlの適用：1 TMB基質を5〜15分間の開発（又は実質的な色が開発されるまで）、その後1 MH 3100μlを添加することによって反応を停止 PO 4および450nmでプレートを読んだ。
  6. 一般的には、ファージプールにおける濃縮は> 2の非特異的結合に対する特異的結合の割合としてラウンド3-4で観察することができる（ 図4参照）。
    注：これは、（むしろ、標的結合剤よりも）、タグ固有の結合剤の濃縮を示し、負の対照タンパク質に対するその高い絶対結合シグナルは非特異的富化を示し、または「アフィニティータグタンパク質上の高い絶対結合シグナルに留意することが有益であるスティッキー "のバインダー。

5.クローンの選択、配列決定および特性評価

シングルのFabファージクローンの5.1）の単離

  1. シークエンシングおよび特性のための個々のクローンを単離するために、T1ファージ耐性E.に中で増幅ファージプールの10分の 1の体積に感染大腸菌丸底マイクロタイタープレート中で対数増殖期（OD 600 = 0.4〜0.8）の細胞は、breathaでカバーBLEプレートシール及び37℃で30分間、200 rpmで振盪しながらインキュベートする。
  2. 2YT培地で10倍連続希釈液を調製し、100グラム/ mlのカルベニシリンを補充した独立した寒天プレート上にプレートアウト。
  3. 1×10 9 M13K07ファージ/ mlの補充した2YT /炭水化物のメディアの450μlに、単一のコロニーをピックアップし、200 rpmで振盪しながら37℃でインキュベートミニチューブ96ウェル無菌のマイクロプレート青いボックスにO / Nを育てる。
  4. 4℃で10分間4000×gでスピンによってペレット細菌。
  5. クローンのファージ上清を代表的な結果を図に示す。いるのFabファージクローン（5.4節で説明したように）、または固定化された抗原に対して特異性を決定するためのクローンの直接結合ELISAのために（セクション5.3および21に記載）の配列決定のために使用することができる5。

特徴付けのためのFabクローン5.2）式

  1. 以下の適切な電子へのクローニングXPRESSIONベクトル（説明を参照）、シングルEを選ぶ大腸菌表情で形質転換されたコロニーを滅菌した爪楊枝またはピペットチップを用いて96ウェルディープウェルプレートで2YT /炭水化物のメディアの1ミリリットルの中に構築し、200rpmで振とうしながら、37℃で12〜16時間、成長する。これは、手動または自動化コロニーピッカーを用いて行うことができる。
  2. Studier らの方法論に従って96ウェルディープウェルブロックにグルコース/乳糖/グリセロールを補ったNZY培地の1.5ミリリットルに成長している文化の40μlの移転。15
    注：あるいは、細胞は、非補充1mMのIPTGの添加によって誘導されたタンパク質の発現に3-4時間（OD 0.8~1.0）のために増殖させることができる。
  3. 通気性のシールとの文化ブロック（複数可）をカバーし、200 rpmで振とうしながら30℃で6〜8時間、Fabクローンを発現する。 15分間4000×gでスピンプレートは、細菌細胞をペレット化して上清を除去、カバープレートホイルシールで、溶解するまで-20℃でペレットを凍結する。
  4. 100μlの溶解バッファー（トリスHCl 50mMの、200mMのNaCl、1.25％トリトンX-100のpHを1mg / mlのリゾチーム及び10 Uベンゾナーゼ/ mlで培養し、プロテアーゼ阻害剤と8.0）で収集したペレットから発現されたFabを解放し、2振盪4℃でhr。
  5. （5.3節を参照）を4℃で15分間4000×gでの遠心分離により細胞破片を除去し、ELISAプレートによる特異性の初期特性評価で使用するための粗溶解物の上清を収集します。

クローンのFab ELISAを直接結合することによって5.3）クローンキャラ

  1. 代わりに384ウェルプレートのウェルにPBS中2μg/ mlの抗原を30μlを等分3.1節で説明したように抗原を固定化。 96チャネル·ベースの分注ヘッドを使用するときにプレートのクワッドベースの抗原のレイアウトは、試薬移動を容易にすることができる。 3.1節に従って洗い、ブロックELISAプレート。
  2. から収集クリア溶解物 5.2節には、EVAの固定化抗原に直接適用することができるバインディングのluation。 200 rpmで振とうしながら室温で15分間、ウェルあたりの溶解物の30μlのをインキュベートする。
    注：精製のFabクローンのタンパク質が交互に説明したのと同じ方法で、PBT緩衝液中10μg/ mlに希釈し、抗原または陰性対照タンパク質（GST、BSA等）を含有するブロックされたウェルに各クローンの30μLを印加し、現像することにより使用することができ以下に。あるいは、Fabをファージは、ファージ10μlの上清を希釈して使用することができる20μlのPBT緩衝液（セクション5.1を参照）（1：3）と（ステップ4.4に記載さ - 4.5）、抗M13-HRP抗体を用いて検出する
  3. 過剰溶解液を取り出し、ウェルを洗浄し、手動または自動化されたプレートを用いたPTバッファー100μlで8倍速を洗浄し、余分なバッファを削除します。
  4. 200 rpmで振とうしながら室温で30分間、PBTバッファ内の二次抗FLAG抗体の5000希釈：1の30μlのをインキュベートする。
  5. 洗って、開発し、セクション4.3に従って定量化する - 4.5。
    注：代表的な結果特異的および非特異的結合クローンの両方を示すが、図5に示されている。

5.4）クローンの配列決定

  1. 表2に示したようにPCRマスターミックスを調製する。
  2. PCRプレートのウェルに適切なプライマーを用いて調製したPCRマスターミックスの20μlに適切なPCRテンプレート（ファージ上清または再懸濁シングルファージミド含有細菌コロニーのいずれか）の2を添加する。
    注：個別のマスターミックスは、両方の重鎖および軽鎖遺伝子の配列決定のために必要とされる。
  3. PCR設定- 表2に示すパラメータを用いてPCR反応を実行します。
  4. 300 nmのネーター上DNA可視化染色および画像化を補充し、1％アガロースゲル上にローディング色素との反応終了液5μlを混合してPCR反応の成功を確認する。
  5. 0.2を含む滅菌水10μlにPCR産物2μlのを追加します。;およびエキソヌクレアーゼおよびエビアルカリホスファターゼの各μlの配列決定のための準備として、過剰のプライマーを除去するために10分間80℃で酵素を不活性化し、20分間37℃でインキュベートする。

自動選択6.スケーリング

6.1）ピペットベースのリキッドハンドリング

  1. 水中1％（w / v）のブロモフェノールブルーを用意し、0.45ミリリットルのフィルタを使用して不溶性粒子を除去する。
  2. （16希釈液合計）水中1％ブロモフェノールブルー溶液の千希釈し、2倍連続希釈を続行：プレートリーダーで吸光度の直線範囲を決定するには、1を準備します。
  3. 平底96ウェルプレートに各希釈液100μlを移し、590nmで吸光度を読み取る。希釈係数に対してプロット絶対吸光度とその後の試験のための線形範囲のハイエンド半ばでの希釈を選択します。
  4. 水にまたは実際の溶液にブロモフェノールブルーを追加します。それは、3 96ウェルプレートにピペット操作のための十分なボリュームに加え、リザーバ内のデッドボリュームで、前の手順で選択した希釈に基づいてピペットでされます。
  5. 化学天秤に水をピペッティングしてテストボリュームを実現するシングルチャネルピペッターのキャリブレーション（水100μlをRTで100mgの重量を量る。）
  6. 較正されたピペッターを使用して、平底96ウェルプレートのうちの少なくとも3つのウェルを染色溶液の試験体積を転送し、トリプリケートで、590nmでその吸光度を読み取る。
  7. 化学天秤で3つの空の平底96ウェルプレートを秤量し、その質量を記録します。
  8. 3枚の96ウェルプレートのそれぞれのリザーバからピペットテスト容積と連で、590nmでその吸光度を測定する。
  9. 各プレートを計量し、質量の差を計算する。
  10. まず、（ 例えば 、±5％）を各ウェルの吸光度が許容範囲内で均一であるかどうかを評価し、それらが目と一致するかどうかE吸光度を校正ピペットマンで手ペッティングにより得られた。特定のチャンネルが（例については、 図6を参照）一貫して過大または過小配信している場合は、修理手順に従い、すべてのチャネルが均一のボリュームをお届けするまで、評価手順を繰り返します。
  11. 第二に、一度すべてのチャネルが、ウェルあたりの平均質量差を算出することにより、そのボリュームの正確さを確認する、均一なボリュームを提供することが確認されている。例えば、100μlのために設定完全に校正液体ハンドラーはプレートあたりの水の9.60グラム、またはウェルあたりの水の0.10グラムをお届けします。配信実ボリュームは、意図ボリューム上にまたは下に一貫している場合には、補正係数は、実際に100μLを送達するために、110μlのプログラミング、すなわち 、適用することができる。
    注：ABことを保証するために、手で96ウェルプレートに小さなボリュームの場合、 例えば、10μlの、染色溶液中で10倍以上のブロモフェノールブルーを使用し、水のプレアリコート90μlのsorbancesは測定可能であり、線形の範囲に入る。

6.2）自動プレート洗浄

  1. セクション3.1で説明したように（各条件のための2つのプレートが試験される）を、96ウェルマイクロプレートの別々のウェルに陽性標的およびネガティブコントロールタンパク質を固定化する。
  2. 室温で1時間、ブロッキング溶液とのインキュベーションにより非特異的結合部位をブロックする。
  3. 10 13 CFUの同一の100μlアリコートを追加/すべてのプレート内のすべてのウェルにPBT中のFab-ファージ溶液を結合標的および室温で2時間穏やかに攪拌しながらインキュベートミリリットル。
  4. 、それぞれの条件に応じて感染し、滴定およびELISA用1プレート用1プレートを二つのプレートを洗ってください。
  5. （第4節で説明したように）抗M13 HRP抗体および比色基質または開発（（M13K07追加）と7.2.1ずに3.3節で説明したように）、細菌や滴定への直接感染による洗浄の有効性を評価する。
  6. ファージ力価のFRオム特異的クローンは、多くの場合、クローンは特異的に結合し、それに対して固定されたタンパク質からの10 5〜10 7ファージ/ mlの範囲で得られる。陰性対照タンパク質（ 例えば、BSA）への結合が予想され、一般的に10 2〜10 5ファージ/ mlのが観察され、しかし、非常に低い力価いくらかの残留（ すなわち 、<10 1）が損なわれる可能性が過度にストリンジェントな洗浄を知らせることができる選択。
  7. ELISAによって決定され、結合したファージは、ロボットの洗浄が確立手洗い結果（ 図7）と同等であるかどうかを決定するために正と負の対照タンパク質の絶対結合シグナルと比較する。

6.3）プレート洗浄除染

  1. 開始するには、試験対象の除染プロトコルを実行。
    注：我々は、少なくとも二重の総ライン容量を使用することをお勧めし、プライムと、0.5％の次亜塩素酸ナトリウム中で5分間新たに希釈したFRをワッシャーヘッドをソークオム市販の漂白剤（典型的には6％の次亜塩素酸ナトリウム）。
  2. ラインまで、首相及び滅菌（オートクレーブ処理）を水に5分間ワッシャーヘッドを浸して、最終的に、プライムシステムは、空気に満ちている。
  3. 首相滅菌水または洗浄緩衝液でライン。
  4. 一度無菌の96ウェルマイクロプレートを洗浄し、滅菌したプレートシールで洗濯機とシールから削除する。これは、事前汚染制御板である。
  5. アリコートO / Nの100μlを96ウェルプレートの全てのウェルにファージ培養上清を増幅した。
  6. 一度ファージ含有プレートを洗浄し、その後洗浄機から取り外し、プラスチックまたはホイルプレートシールで密封する。これは、汚染制御板である。
  7. テストされている除染プロトコルを実施する。この例では、繰り返しは6.3.1と6.3.2を繰り返します。
  8. 一度無菌のマイクロプレートを洗浄し、その後洗濯機とシールから削除する。これは、汚染除去試験プレートである。
  9. 対数期のE.のプレート50μL滴定プレートに大腸菌 ;これは、事前infecあるション制御板。
  10. 事前汚染、汚染や除染96ウェルプレートを開封し、Eの100μlを添加する各ウェルについて新しいチップを使用して全てのウェルに、対数期の成長段階において、大腸菌 、。
  11. 密封し、200rpmで30分間37℃でインキュベートする。
  12. 10cmの2YT /炭水化物のプレートに各96ウェルプレートの3ランダムウェルからプレート感染細胞50μlを、37℃CO / Nでインキュベートする。
  13. 1ミリリットルの2YTプラスウェルあたり100グラム/ mlのカルベニシリンを含むディープウェルプレートに各プレートの全てのウェルからの転送、感染細胞50μlを、37℃でO / Nを育てる。
  14. 除染プロトコルを繰り返し、ドライワッシャーラインを残す。
    注記：プレートまたは液体培地中でなしO / Nの成長は、感染前制御、プリ汚染制御または汚染除去試験プレート上で観察されるべきである。多くのコロニー、成長、汚染制御プレート上で観察されるべきである。の有効性についてではない場合、何の結論ない汚染除去プロトコルを行うことができる。理想的には、除染のプレートはコロニーとO / NプレートのウェルのいずれにもO / Nの成長をもたらすません。除染プロトコルのストリンジェンシーは、より長い時間と追加のサイクルを浸す、高い漂白剤濃度を増加させることができる。

7.入力/出力滴定

7.1）入力ファージ滴定

  1. 滅菌濾過したPBSで50μlにファージの5μlアリコートを希釈し、混合する。
  2. マルチチャンネルピ ​​ペットまたは96チャンネルピ ​​ペッターを用いて10〜10に滅菌濾過PBSで連続10倍の希釈を準備します。
  3. T1ファージ耐性E.の45μlに中に希釈したファージ5μlの接種大腸菌の対数増殖期の細胞（OD 0.6~0.8）、37℃で30分間通気性シール付きカバーさインキュベートする。
  4. プレートを100μg/ mlのカルベニシリンを補充したLB /寒天プレートに上に感染した細胞の5μLとO / N AをインキュベートT 37℃。
  5. ファージ濃度はコロニーは2.8節で詳述の計算によると表示されているほとんどの希薄サンプルから推定することができる。

7.2）出力ファージPitrations

  1. E.を添加することによって、プレートに結合したファージの溶出を以下の大腸菌の細胞は、オートクレーブ処理2YT培地で50μlにファージ感染細胞の5μlアリコートを希釈
  2. マルチチャンネルピ ​​ペットまたは96チャンネルピ ​​ペッターを用いて10〜6オートクレーブし2YT培地で連続10倍希釈を準備します。
  3. プレート5100μg/ mlのカルベニシリンを補充した寒天プレートに上の感染細胞のμL、37℃でO / Nインキュベートする。
  4. ファージ濃度はコロニーは2.8節で詳述の計算によると表示されているほとんどの希薄サンプルから推定することができる。
    注：いずれの場合も（ すなわち、入力および出力ファージ力価、両方のテトラサイクリン上のコロニー数との比較（合計CELリットル数）およびカナマイシン（ヘルパーファージ力価）も有益であり得る。

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結果

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本明細書中に記載されるプロトコルは、並行して、コンビナトリアルファージディスプレイされたFabライブラリーからstructurally-と機能的に関連する抗原ドメインの両方の様々な抗体断片を単離するために使用されている。抗原の可用性に関連する問題は、抗体の選択23に適している発現可能な抗原ドメインのインシリコ同定によって、多くの場合、回避することができる。 （ 図1）は、同じ実験室内抗体選択に抗原発現を結合することにより、選択に重要な抗原パラメータをより容易に制御することができる統合されたパイプラインを構築することが可能となる。ほとんどの場合、ドメインの境界を注意深く決定は、抗体選択における使用の成功のために96または24ウェルディープウェルプレート（ 図2）において、ハイスループット表現から十分に純粋な抗原の十分量の発現および単離を可能にする。相次ぐ中、選択プロセスのラウンドは、抗原に特異的に結合溶出したファージの濃度およびファージの濃縮は、ELISAアッセイのいずれかにおいて、ファージ滴定（ 図3）またはファー...

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ディスカッション

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体外抗体の選択で行う場合、選択成功の二つの主要な決定の際、選択するための、よく折り畳まれた抗原標的の1）分離と高機能の多様化抗体ライブラリの2）利用可能である。多くの場合、十分に折り畳まれた、全長タンパク質の十分な量の利用可能性を制限することができる。この制限を克服する1つのアプローチは、適切な親和性タグを細菌発現ベクターへの挿入のための生物情報分析部22から識別され、合成されたドメインを使用することである。

、溶解度を増加させる精製を容易にし、不安定なドメインを安定化させるためのバイオテクノロジー用途に用いられているタグには様々なものがある。11、任意の所望の挿入配列は、汎用性の高い抗原生成プラットフォームを可能に仮想的に合成する能力が。 GSTタグ付き形式が一般的ですが、成功した結果が、以前にされているヘキサヒスチジンは、Fc、ハロ、マルトース結合タンパク質との部位特異的ビオチン化タグを使用して得られ、それは無数の他のアフィニティータグは、同様のプラットフォームで使用するために最適化することがで...

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開示事項

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著者らは、開示することは何もない。

謝辞

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組換え抗体ネットワーク抗体選択および特性パイプラインとロボットの選択プラットフォームの資金調達購入のためのイノベーションのためのカナダの財団の開発に資金を提供するためのタンパク質捕獲試薬のプログラム-私たちは、NIHの共通基金を承認したいと思います。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
材料
ニューブランズウィック Innova44 スタッカブルインキュベーターシェーカーエッペンドルフM1282-0004
リクビデーター 96チャンネル 手動ベンチトップピペッティングシステムアナケム株式会社LIQ-96-200
マイクロプレートシェーカーVWR12620-926
サーモサイエンティフィック ソルバル ST-40 ベンチトップ遠心分離機サーモ製品
ELx405 セレクト ディープウェル マイクロプレート ウォッシャーBiotekELX405USD
カスタム ハイスループット自動ファージ選択ロボットS&P Robotics
プラスチック円錐形ファルコンチューブ:50 mlVWR21008-178
プラスチック円錐形ファルコンチューブ:15 mlVWR89039-668
Axygen 1.7 ml 微量遠心チューブコーニングMCT-175-L-C
96ウェル/384ウェル マキシソーププレートシグマM9410-1CS
コーニング 96ウェル V-ボトムディープウェルブロックコーニング3960
Axygenミニチューブ96ウェル滅菌マイクロプレートブルーボックスコーニングAXY-MTS-06-C-R-S
通気性粘着プレートシーリングフィルムVWR60941-084
会社名 カタログ番号
ポリエチレングリコールバイオショップPEG800.1
酵母エキスBioshopYEX401.1
バイオトリプトンBioshopTRP402.1
N-ZアミンΣC7290
グルコースΣG8270-1KG
ラクトースBioshopLAC234
グリセロールBioshopGLY001.500
カルベニシリン BioshopCAR544.10
kanamycinBioshopKAN201.25
テトラサイクリン BioshopTET701.25
Tween 20BioshopTWN510.500
一塩基性リン酸カリウムBioshopPPM302.1
二塩基性リン酸ナトリウムAnachemia84486-440
塩化ナトリウムBioshopSOD001.10
塩化カリウムBioshop POC308.1
塩化カルシウムBioshopCCL302.500
マグネシウム硫酸塩EMDMX0070-1
塩化マグネシウムBioshopMAG510.500
NH4ClAmresco0621-1KG
Na2SO4BioshopSOS513.500
寒天BioshopAGR001.500
SybrSafe DNAゲル染色InvitrogenS33102
リン酸Acros Organics 201140010
リゾチームBioshopLYS702.25
ベンゾナーゼNovagen71205
Triton X-100BioshopTRX506.500
プロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤ロシュ11 836 170 001
Ni-NTA樹脂 Qiagen1018240
1,000倍ヘルパーファージ (M13K07) ストック (1013 ファージ/ml)NEBN0315S
HRP 標識 M13 特異的抗体 (抗 M13-HRP)。GE Healthcare27-9241-01
TMB基質:等量のTMBとH2O2ペルオキシダーゼ基質を混合します KPL50-76-00
dNTPsBiobasicDD0056
Taq ポリメラーゼGenscriptE00007
ExonucleaseGE Healthcare EZ0073X-EZ
エビアルカリホスファターゼGE ヘルスケアE70092Z-EZ
75004525試薬

参考文献

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