レシオメトリック二分子ビーコンを使用して、生細胞における単エンジニアのRNA転写物のリアルタイムイメージング

サマリー

レシオメトリック二分子ビーコン（RBMBs）は、生細胞内の画像の単一操作されたRNA転写物に使用することができる。ここでは、マイクロポリアルタイムで単一のRNA転写物の蛍光イメージングによる細胞内へのRBMBsの配信、RBMBsの調製および精製を記載している。

要約

両方の遺伝子発現の時間的および空間的調節は細胞機能に重要な影響を持つことができ、成長の実現は、単一の生細胞内の個別のRNA転写産物を視覚化するために多様な技術が開発された。最近記載されている一つの有望な技術は、3 '非翻訳領域におけるRBMB標的配列の少なくとも4つのタンデムリピートを含むように操作されたRNA転写産物を検出するためのオリゴヌクレオチドベースの光プローブ、レシオメトリック二分子ビーコン（RBMB）を利用する。 RBMBsを具体的に相補的なRNAへのハイブリダイゼーションの際に、明るい蛍光シグナルを発するように設計されているが、それ以外は急冷されたままになります。この方法で合成プローブの使用は、赤方偏移し、光安定性を可能にし、高度に発光性有機染料は、画像形成に使用される。広視野蛍光顕微鏡下で見たときの離散蛍光スポットにおける工学的RNA転写産物の結果を複数のRBMBsの結合。したがって、個別のRNA転写物の移動が容易に蛍光画像の時系列を取ることによって、リアルタイムで可視化することができる。ここでは、マイクロポと単一のRNA転写物の生細胞イメージングによる細胞への送達、RBMBsの調製および精製を記載している。

概要

RNA転写物の発現および調節は、細胞の挙動と運命を制御するための主な原因であり、複雑で動的なプロセスである。細胞機能を口述におけるRNAの重要性は以前から知​​られているが、ほとんどのRNAの解析ツールは、このような転写破裂、RNAなどの重要な調節事象を捕捉するために必要な空間および時間分解能を欠いているので、両者の間に明確な接続を描画することはしばしば困難である人身売買、およびローカライズされたRNAプロセシング。これは、個別のRNA転写物がリアルタイム¹に生細胞内で可視化することを可能にするいくつかの技術の出現につながっている。おそらく、これらの技術の最も顕著な3'-UTR ^2,3にMS2結合部位の縦列反復を含むように操作されたRNAを標的とGFP-MS2融合タンパク質を利用する。近接さ、複数のGFP分子をもたらすことで、個別のRNA転写物は、明るい蛍光スポットとして表示され蛍光顕微鏡を経由。 GFP-MS2システムは、直接可視化および転写の測定値^4,5破裂 、ユニークな細胞内局在および処理^6-9の検出、およびRNA輸送¹⁰のリアルタイムイメージングを含む、RNAの挙動に前例のない洞察を、提供してきました。しかし、GFP-MS2システムの大きな可能性にもかかわらず、結合していないGFP-MS2融合タンパク質は汎用性とこの技術のダイナミックレンジを制限する高いバックグラウンド蛍光信号を生成することができる。いくつかのアプローチは、タンパク質断片相補^11、及び代替RNA結合タンパク質と^12を標的^に結合していないGFP-MS2 ¹⁰の細胞内区画化を含む、このバックグラウンド信号を制限するために開発されてきた。しかしながら、これらのアプローチの全ては、RNA標的とGFP-MS2融合タンパク質の相対的な総発現に対して感受性のままである。

AとしてGFP-MS2システムにlternative、分子ビーコンはまた、3'-UTR ^13,14における相補的な結合部位の縦列反復して操作されたRNA転写物を検出するために使用されてきた。分子ビーコンは、クエンチャーで、蛍光レポーターと他方の端部に一端で標識されているヘアピン形成オリゴヌクレオチドプローブである。標的RNAに結合されていない場合には蛍光レポーターとクエンチャーは、低蛍光状態になり、すぐ近くに残っています。ハイブリダイゼーションの際、蛍光レポーターとクエンチャーが離れて強制されると蛍光が復元されます。 GFP-MS2システムと同様、蛍光顕微鏡によって同定することができる明るい蛍光スポットにおける単一のRNA転写産物をもたらす上に複数の分子ビーコンの結合;しかしながら、バックグラウンド蛍光は、未結合の分子ビーコンの急冷構成に起因はるかに低いことが期待される。残念なことに、m個に組み込まれる巧妙な活性化メカニズムにもかかわらずolecularビーコンデザイン、生きている細胞に導入された場合にハイブリダイズしていない分子ビーコンは、ヘアピンコンフォメーションに残っていないことを成長している証拠がある。したがって、それらは有意にシグナル対バックグラウンドを低減する偽陽性シグナルを生成する。 ^15,16;この欠点を克服するために、私たちは最近、生きている細胞、レシオメトリック二分子ビーコン（ 図1A RBMBs）で画像化RNAのための新しい合成プローブを開発しました。 RBMBsは、短いヘアピンRNA（shRNA）、および分子ビーコンの両方から特徴を有するハイブリッド構造を形成する2つの2'-O-メチルオリゴヌクレオチド鎖から構成されている。 3'-UUオーバーハングの長い二本鎖ドメインはshRNAのより特徴的である間ループし、蛍光活性化機構は、分子ビーコンに似ています。 shRNAの機能は、核輸出を駆動するように設計されている私たちは> 24時間に増加した細胞内寿命を見つけている、最小限の観察劣化し、ループの非特異的な開口を防止する。結果RBMBsは、分子ビーコンよりも有意に高いシグナル対バックグラウンドを示した。

これは、DNAベースのプローブは、RNAベースのプローブと同じ核外輸送機能を有していないのでRBMBsは、DNAオリゴヌクレオチドを​​用いて調製することができないことに留意すべきである。構造的に、RBMBループは、典型的には、RNAのハイブリダイゼーションの際の特異性および選択性の間のバランスを作成するために、長い15と21塩基の間であるように設計されている。 2つの自己相補的なドメインから構成する短いステムは、通常、4塩基であるように設計されている。長いステムが選択されている場合、RBMBループと標的RNAとのハイブリダイゼーションの速度は著しく^17,18を減速される。より短いステム配列が選択されたとき、逆に溶融温度が高いバックグラウンドシグナルをもたらす、37℃でステムループ構造を維持するために頻繁に低すぎる。 RBMBの特異性も赤です茎長が短くなるようにuced。 RBMBステム-ループの配列はまた、RBMB性能に影響を与えることができるので^、19を慎重に選択しなければならない。具体的には、理想的なループ配列は、最小の二次構造を有するべきである最小の二次構造を有するRNA配列にハイブリダイズし、タンパク質結合部位を回避し、および結合オフターゲットを回避する。 RBMBおよびRNA二次構造の両方の予測は、MFOLD ²⁰などのソフトウェアを使用して得ることができる。コンプリメンタリオフターゲット部位は、ヌクレオチドの基本的なローカル割り付け検索ツール（BLAST）を使用して識別することができます。しかし、モデル予測およびタンパク質入札機関部位を同定することが困難に不整合により、すべてのRBMBsの特異性は、最終的には実験的に検証する必要があります。

望ましい場合には、ハイブリダイゼーション状態の影響を受けない非消光参照色素はRBMB ¹⁵に加えることができる。参照色素の添加は、PRができるプローブの配信のためにマーカーをovide全細胞蛍光のより正確な測定が必要な場合は、レシオメトリックイメージングに使用される。リファレンス色素は測定が送達細胞間のばらつきに起因バックグラウンドの差を調整することができる。しかし、個別のRNAを撮像する際は、参照色素を必要としない転写産物。注目すべきことに、いくつかの基準色素は核内でわずかに高いバックグラウンドシグナルをもたらし、核からRBMBsの輸出を妨害する可能性がある。

適切に設計されたときに、標的RNAは、少なくとも4つのRBMB結合部位（ 図^{1B）16 を}含むように操作された場合、RBMBsは、単一の生細胞内の画像個別のRNA転写物に使用することができる。 RBMBsを効率的に細胞生存率²¹全く影響がほとんどで、マイクロポレーションを介して細胞タイプの広い範囲内に送達することができ、遺伝子発現の定量的測定であることができる30分以内に取得しました。結合していないRBMBsからの蛍光を効率的に消光されるので、方法論は、RBMB濃度と標的RNAのレベルにかなり鈍感である。ここでは、マイクロポリアルタイムで単一のRNA転写物の画像化を介して生細胞へRBMBsを準備し、精製するために使用される方法の詳細な説明、ならびにRBMBsの送達のための一般的な手順を提供する。

プロトコル

このプロトコルでは、一つのオリゴヌクレオチド（RBMB1）はCF640Rレポーター色素とその5 '末端で標識され、配列：5'mCmUmUmC mGmUmC mCmAmC mAmAmA mCmAmC mAmAmC mUmCmC mUのmGmAmAmG mGmAmC mGmGmC mAmGmC mGmUmG mCmAmG mCmUmC MUMU-3'。ヘアピン構造の形成を推進自己相補的ドメインは、太字で示しています。第二のオリゴヌクレオチド（RBMB2）はアイオワブラックRQ-Spをクエンチャーとの3 '末端で標識され、配列を有した：5'-mGmAmG mCmUmG mCmAmC mGmCmU mGmCmC mGmUmC-3'。

RBMBsの調製

1. RBMB1とRBMB2オリゴヌクレオチドを​​含有するチューブの迅速なスピンを行って、乾燥したオリゴヌクレオチドは、100μMの最終濃度までDNaseおよびRNaseフリー水中のチューブの底、再懸濁にあることを確認します。例えば、オリゴヌクレオチドの10ナノモルサンプルは100μlの水に再懸濁されるべきである。
2. [測定URE紫外可視分光法によるRBMB1とRBMB2株式サンプルの正確な濃度。
   1. マイクロチューブ117μlのDPBS（カルシウム及びマグネシウムを含まない）でRBMBサンプル3μlのを混ぜる。
   2. DPBSでブランク分光光度計とは、200〜800 nmの吸光度から測定します。注：ピークは260nmでの吸光度から650nmが見えるはずです。
   3. の式を用いて、260nmの（またはRBMB1 650 nm）における吸光度に基づいてRBMB試料のストック濃度を計算する：
      ストック濃度（M）は_260で 260 nmでの吸光度と希釈係数が40である₂₆₀ *希釈係数/吸光係数=。
      注：RBMBの吸光係数は、オリゴヌクレオチドの製造元が提供する仕様書に記載されています。 650nmにおけるCF640Rの吸光係数は103,000である。
3. 100μMのRBMB120μlの100μMのRBMB230μlの、6μlの10倍を混ぜる;リン酸緩衝液（10×リン酸緩衝液：480mMのK ₂ HPO _4、45mMのKH ₂ PO _4、140mMのNaH ₂ PO _4、pH7.2）で4μlのDNaseおよびRNaseフリー水。 30分間室温で混合物をインキュベートする。注：これは、典型的には、約50の研究のために十分である。
4. いずれのハイブリダイズしていないRBMB2オリゴヌクレオチドを​​除去するために75調製グレードスーパーデックスを用いた液体クロマトグラフィーカラムを準備します。混合プローブの小さな体積を精製する〜4ミリリットルの総容積で8mLの（0.7×20cm）に、液体クロマトグラフィーカラムを使用してください。
5. 洗浄を、0.6 ml /分の流速でフローで動作するシリンジポンプを用いて〜1×リン酸緩衝液の50ミリリットルを平衡化したSuperdex。流体のすべてがベッドボリュームに入る前に、それを外し、シリンジポンプを停止し、残りの液体は、重力によってカラムを通過してみましょう。
6. クロマトグラフィーカラムにRBMB混合物（60μl）をロードします。
   1. RBMBサンプルは完全にした後にゆっくりと試料全体が完全にカラムに入ったことを確認するために、ベッドの上部に1×リン酸緩衝液の別の250μlのを追加し、ベッドに入った。
   2. 1×リン酸緩衝液でリムに列を入力します。上部を閉じて、シリンジポンプを起動 - シリンジ〜50ミリリットル1×PBSを充填した0.6 ml /分の流速で実行されるべきである。
   3. RBMBたら塔の底部に近づく - RBMBサンプルは一般的に容易に起因するプローブに組み込まれた染料の色に可視化することができる - フロースルー微量遠心チューブあたり2滴（1.5ミリリットル）で収集します。マイクロチューブ内の色が明らかになった時点で、サンプルの収集を停止。
7. 通常は5-6チューブ - - 色のRBMBサンプルを含むチューブを組み合わせ、遠心フィルター装置（10,000 MWカットオフ）にロードする。 20分間または所望の体積になるまで万RCFでサンプルを遠心。注：これらの速度と時間は、一般的になります〜30μlの最終容量が得られる。
8. 紫外可視分光法により、精製RBMBサンプルの正確な濃度を測定する。
   1. 濃厚RBMBサンプル3μLを取り、マイクロチューブに117μlのDPBSで混ぜる。
   2. DPBSでブランク分光光度計とは、200〜800 nmの吸光度から測定します。注：ピークは260nmでの吸光度から650nmが見えるはずです。
   3. の式を用いて、650nmでの吸光度に基づいて、ハイブリダイズしたRBMBのストック濃度を計算する：
      ストック濃度（M）は_650で 650 nmの吸光度で₆₅₀ *希釈係数/絶滅係数=、希釈係数は40である。
      注：650nmの時CF640Rの吸光係数は103,000であり、アイオワ州ブラックRQの吸光係数は〜20,000。吸光係数は、添加剤であり、ハイブリダイゼーションは区別されません。したがって、在庫RBMBサンプルはapproximatelの組み合わせ吸光係数を有する650nmでのy 123000。
9. 将来の使用のために-20℃での名前と濃度とストアに適切にチューブにラベルを付けます。

8ウェルチェンカバーガラスコーティングされたポリ-D-リジンの調製

1. 無菌環境に滅菌水25ml中のポリ-D-リジン（凍結乾燥粉末、g線照射）5mgを溶解することによって、ポリ-D-リジン0.2 mg / mlの溶液を調製する。
2. 無菌環境で、8ウェルチャンバーカバーガラスの各ウェルに0.2 mg / mlのポリ-D-リジン溶液200μlを追加します。
3. 細胞培養フード内で16〜18時間、室温でインキュベートする。
4. ポリ-D-リジンを吸引し、滅菌蒸留水でウェルを3回洗浄する。注：コーティングされたチャンバースライドを4℃で保存することができる。

3プローブ配信

注：使用した細胞系は、少なくとも4順次結合してRNAを発現する統合された遺伝子構築物を含むべきで3 '非翻訳領域（UTR）にRBMBのための部位をる。標的配列はRBMBのループに相補的であるべきである。これは、陰性対照として、同じ細胞株が、タンデムリピートなしで、同じ遺伝子構築物を発現するように操作されることをお勧めします。このプロトコルでは、ヒト線維肉腫細胞株HT1080は、3'-UTRにおけるRBMB標的配列の96タンデムリピートを有するGFPの RNAを発現するように操作した。コントロール細胞株は、野生型GFPの RNAを発現するように操作した。

1. 一日のプローブ配達の前40〜50％の集密度でT25フラスコ中で細胞をプレート。培養DMEM培地で細胞を1％のペニシリン/ストレプトマイシンおよび10％ウシ胎児血清（FBS）を補充し、そして5％CO _2、37℃でインキュベートする_。
2. 次の日は、microporatorをオンにし、950 V、2パルス、25ミリ秒に微小穿孔のパラメータを設定してください。注：これらのパラメータは、HT1080細胞のために最適化されてきたが、それらは、細胞型に依存しており、adjusことができます製造業者の取扱説明書に記載されるような他の細胞型のためテッド。
3. 4ミリリットルの電解液とのマイクロポチューブを記入し、マイクロポ·ステーションの上に置きます。
4. 精製されたRBMBの在庫サンプルを取り出して、それを解凍。 1×リン酸緩衝液で12μMの最終濃度になるように、いくつかのマイクロリットルに希釈する。 1μlを各微小穿孔のために必要とされる。
5. ピペットFBSを有するがマイクロ遠心チューブに抗生物質を含まない培養液1ミリリットル。注：これは当分の間、マイクロポ機器の近くで、マイクロポ直後に細胞を懸濁するために使用され、取っておくことができます。培養培地中の抗生物質を含めることは、マイクロポレーション後の細胞生存率を減少させる。
6. 一回1ミリリットルのCa ^{2 +}およびMg ^{2 +}を含まないDPBSで細胞を洗浄、操作されたHT1080細胞（60〜80％コンフルエント）から細胞培養培地を取り出し、1〜2分間1ミリリットルトリプシンでインキュベートする。
7. trypsinizatioを停止します抗生物質およびフェノールレッドを含まない10％ウシ胎児血清を補充した1ミリリットルDMEM培地を添加すること、および2つの1.5mlのマイクロチューブに細胞を移すことによりn。
8. 5分間200×gで遠心チューブ中で細胞をスピンダウン。上清を除去し、再懸濁し、1mlのDPBSの最終体積で細胞ペレットを兼ね備えています。
9. よく混合細胞懸濁液から10μLを取り、細胞をカウントします。
10. 必ず彼らはよく分散されていることを確認し、新しい1.5 mlのマイクロチューブにDPBSで300,000細胞を転送し、5分間200×gでスピンダウンするには、上下に数回の細胞をピペット。
11. 細胞ペレットを乱さないように注意しながら、上清を除去します。細胞を十分に分散されることを保証するために11μlの再懸濁緩衝液とピペット最大で数回上下ペレットを再懸濁する。気泡を発生しないように注意してください。注意：空気の泡がマイクロポ中に火花が発生し、貧しいRBMB配信や細胞死をもたらすであろう。
12. 希釈されたRBMB（12μM）を1μlを加え、ピペッティングにより数回上下よく混ぜる。ここでも気泡を生成しないように注意してください。
13. 吸引除去RBMB細胞液10μl、マイクロポピペットを用いて、マイクロポチューブにピペットを挿入します。マイクロポを開始するには、スタートボタンを押してください。注意：先端には目に見える気泡があってはならない。
14. microporatorの画面が完了したことを示している場合には、FBSを1ミリリットルの培養液ではなく、抗生物質を含まない、先に作製したマイクロ遠心チューブに10μlの混合物を排出する、駅からピペットを取り外します。チューブ左右に数回揺動により穏やかに混合します。
15. 5分間200×gで細胞をスピンし、細胞内に送達されなかったRBMBsを除去するために、FBSを1ミリリットルのフェノールレッドを含まない培養液ではなく、抗生物質を含まない、細胞をさらに2回洗浄する。 FBSを除いた全ての400μlのフェノールレッドを含まない培養培地で再懸濁抗生物質。
16. ポリ-D-リジンへのプレートmicroporated細胞はウェルあたり200μlので、又は所望の密集度で8ウェルチャンバーカバーガラスをコーティングした。
17. オプション：それは核イメージすることが望ましい場合、0.01ミリグラム/ mlの最終濃度で細胞にヘキスト33342を追加する。
18. 細胞培養インキュベーターにチャンバーカバーガラスを配置します。細胞がカバーガラス表面に落ち着くのに十分な時間を持つように、撮像前に1〜2時間、細胞をインキュベートする。注：イメージングは​​、30分後にマイクロポとすぐに行うことができる。

4。画像取得

1. 生細胞期トップのインキュベーションシステムの電源を入れ、37℃、5％のCO _2、および75％の湿度に達するまで平衡化。
2. 顕微鏡と蛍光光源をオンにして、をMetaMorphソフトウェアを開きます。注：顕微鏡制御と画像取得のための他の同様のソフトウェア·パッケージを使用することもできる。
3. にImmersolオイルを塗布する目的。
4. 生細胞期トップインキュベーションシステムにmicroporated細胞とチャンバーカバーガラスを転送します。温度までステージ天システムをインキュベートし、CO ₂レベルが安定化される。
5. をMetamorphソフトウェアで、[取得]タブを開きます。 、フィールドを見つけるためにショーのライブボタンをクリックして、白色光の下で焦点を調整し、[停止ライブ]ボタンをクリックします。
6. [取得]タブで、クリックして、ストリーム取得ポップアップボタンを開き、目的の映画の収集パラメータを設定します。のCy5 / CF640Rフィルターを使用して150フレームを取得し、ハードドライブに画像を保存します。

結果

広視野蛍光顕微鏡で画像化する際まもなくRBMBsの存在下で、HT1080細胞のマイクロポ以下、それらの3'-UTR内の複数RBMB結合部位を含むように操作された個別のRNA転写物（ 図2）のように明るい蛍光スポットとして表示されます。わずか4つのRBMB結合部位を有する個別のRNA転写物は、生細胞内で画像化することができるが、3'-UTRにおける結合部位よりRBMB、強い蛍光シグナル。信号は光退色に失われる前にまた、より長い各転写産物に結合しているより多くのRBMBsは、RNAを可視化することができる。このプロトコルでは、RNAは、3'-UTRにおけるRBMB標的配列の96タンデムリピートを含有するように構築された。ストリーミング画像の取得は、個別のRNA転写産物は、リアルタイム（ 動画1）で結像されることを可能にする。個別のRNA転写物は、容易に細胞質および核O内で移​​動することがわかる細胞F。スポットのほとんどはブラウンまたはサブ拡散運動を受けるように見えるが、まれに向け輸送を受けているRNAは、（ 動画2）観察される。論文のRN...

ディスカッション

従来の広視野顕微鏡を用いて、生きた細胞内の画像の単一設計されたRNA転写する能力は、各RNA転写物と結合していない蛍光プローブから発せられる低蛍光バックグラウンドに関連付けられる、明るく光安定蛍光シグナルを必要とします。この方法では、明るい蛍光シグナルは、各RNA転写物の上に、（96まで）の複数のオリゴヌクレオチドに基づく蛍光プローブ、 すなわち RBMBsをハイブリダイズさせることによって達成される。しかし、わずか4つのバインディングサイトは¹⁶で十分です。集団的信号をリアルタイムで追跡することができ、明るい蛍光スポットになる。集合的信号が失われる前に、蛍光色素の実質的な部分を光退色されなければならないので、複数のプローブの存在はまた、より長いイメージング時間を可能にする。なお、この技術は、RNA生物にユニークな洞察を提供し、目の測定範囲のRNAの挙動の広範囲の研究を可能にすることが想定されるさまざまな外部刺激へのRNA輸送の電子応答、RNAの運命と寿命に勉強し、そしてRNA規制への洞察を提供する、標的RNAのユニークな細胞内局在パターンを観察する。それに加えて、RNA発現の変化（ すな...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ヌクレアーゼフリー水	ライフテクノロジー	AM9932	DEPC処理なし
DPBS	ライフテクノロジー	ズ 14190-144	Ca2+およびMg2+
>Cary 100 UV-Vis分光光度計	アジレント・テクノロジー
リン酸二塩基性カリウム	フィッシャー・サイエンティフィック	P290-500
リン酸カリウム一塩基性	フィッシャーサイエンティフィック	P284-500
ナトリウム一塩基性	フィッシャーサイエンティフィック	S381-500
マイクロ遠心チューブ	エッペンドルフ	22364111	1.5 ml
クロマトグラフィーカラム	キンブルチェイスライフサイエンス	420400-0720	0.7 x 20 cm
Superdex 75 プレップグレード	GEヘルスケア	17-1044-01
シリンジポンプ	Braintree Scientific	BS-300
シリンジ	BD	301035	60 ml、ルアーロックチップ
遠心フィルターユニット	ミリポア	UFC501096	MW 10,000 カットオフ
遠心分離機 5418	エッペンドルフ
ポリ-D-リジン	Sigma-Aldrich	P7280-5MG	凍結乾燥粉末、g-照射済み
8ウェルチャンバーカバーグラス	フィッシャーサイエンティフィック	155409	作業量 0.2-0.5 ml
HT1080	ATCC	CCL-121	ヒト線維肉腫細胞株
細胞培養フラスコ	コーニング	430639	25 cm2
DMEM	Life Technologies	11965084
フェノールレッドを含まない	Life Technologies	21063029	グルコース
シ胎児血清	Sigma-Aldrich	F2442-500ML
ペネシリン/ストレプトマイシン	ライフテクノロジー	ズ
トリプシン	ライフテクノロジー	ズ 25300054	0.05% トリプシン-EDTA
ネオントランスフェクションシステム	ライフテクノロジー	ズ MPK5000
ネオントランスフェクションシステムキット	ライフテクノロジー	MPK1096
血球計算盤	フィッシャーサイエンティフィック	02-671-10
ヘシュト 33342	ライフテクノロジー	ズ H1399
IX-81 倒立蛍光顕微鏡	オリンパス
SOLAライトエンジン	ルーメンコール
メタモル	フィカルデバイス		ソフトウェア制御顕微鏡
Immersol oil 518F	Fisher Scientific	12-624-66B