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方法論記事

加水分解性架橋剤を介してアデノウイルスベクターテザーを使用した金属ステント表面からの血管の遺伝子導入

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DOI:

10.3791/51653

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2014年8月12日

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1Department of Pediatrics, Division of Cardiology, The Children's Hospital of Philadelphia, University of Pennsylvania

この記事について

サマリー

これらの研究は、アデノウイルス遺伝子ベクターのステントおよびモデルメッシュディスクのコートレス金属表面への可逆的な付着について報告しています。ベクター固定化に使用される架橋剤の加水分解を条件として、形質導入にコンピテントなウイルス粒子が持続的に放出されるため、血管細胞やステント留置動脈において、部位特異的な導入遺伝子の持続的な発現が得られます。

要約

ステント内再狭窄は、広く冠動脈および末梢動脈の批判的に狭めセグメントを通じて再確立血流に使用されるステントベースの血管再生手順の主要な合併症を提示します。抗再狭窄性の活性を有する遺伝子の調節可能な放出が可能な血管内ステントは、現在、薬剤溶出ステントを使用するための代替戦略を提示することができる。典型的には、ベクターの物理的捕捉のために使用されるポリマーコーティングに関連付けられた過剰な炎症性応答を回避しながら、臨床翻訳を達成するために、遺伝子溶出ステントは、ステント固定化遺伝子ベクターの放出及び血管系の部位特異的な形質導入の予測可能な速度論を示さなければならない。本論文では、ビスフォスフォネート（PABT）が加水分解性架橋剤（HC）を介してステンレス鋼表面 - 修飾ポリアリルアミンするアデノウイルス粒子の可逆的結合に基づくステントとアデノウイルス遺伝子ベクターのコートレステザリングするための詳細な方法論を説明しています。の家族5〜50日の範囲内の鎖エステル加水分解の平均のt 1/2と二官能性（アミンおよびチオール反応性）HCは、ステントとベクターを連結するために使用した。ベクトル固定化手順は、一般的に9時間以内に行われ、いくつかのステップで構成されています。PABTの水溶液中の金属試料の1）インキュベーション（4時間）;トリス（2 - カルボキシエチル）ホスフィン（20分）でPABTに設置チオール基の2）の脱保護;ピリジルジチオ（PDT）グループ（2時間）で誘導体化ポリエチレンの試料を反応させて金属表面のチオール反応容量の3）拡張;ジチオスレイトール（10分）とのチオールへのPDT群の4）変換; HC（1時間）とアデノウイルスの5）の修正;サイズ排除カラムクロマトグラフィー（15分）、チオール化鋼表面上のチオール反応性アデノウイルス粒子（1時間）の7）の固定化によって修飾されたアデノウイルス粒子の6）精製。この技術は、ステントを越えて広い適用可能性を有している注入された異物をインターフェース細胞に対する基質媒介遺伝子送達を通じてそれらの生体適合性を強化するために、生体プロテーゼデバイスの表面工学を促進することによって。

概要

治療法として、遺伝子治療の有効性は、遺伝子治療ベクター1,2の乏しいターゲティング能力によって妨げられる。標的位置におけるトランスジーン発現の準治療レベルの適切なターゲティングの結果の欠如とは、ベクトルおよび符号化された治療用生成物4の両方に対する免疫応答をマウントするための担当者を含む非標的器官3へのベクターの広範な普及につながる5。一つの可能​​性は、形質導入の混乱を相殺し、標的化血液やリンパ液を介してそれらの自由普及を妨げる形で所望の位置に遺伝子ベクターを導入することで促進することを意味する。典型的には、このような努力は、物理的に目を捕捉することによって注射部位に一過性に維持遺伝子ベクターが可能であるフィブリン、コラーゲンまたはヒアルロン酸ハイドロゲルマトリックス6-10と混合したウイルスまたは非ウイルスベクターのいずれかを含む、局所的に注射可能な送達システムに依存しているポリマーネットワーク内のem。

ローカライズされた遺伝子治療のための別の一般的に受け入れられているパラダイムは、移植された補綴装置11,12の表面に遺伝子ベクターの固定化を利用する。常設医療用インプラント（血管、気管支、泌尿器及び胃腸ステント、ペースメーカー、人工関節、外科や婦人科のメッシュなどが 。）の患者13数千万で毎年使用されている。一般的に有効であるが、これらのデバイスは、不十分な現在の医療行為のために14〜17によって制御される合併症を起こしやすい。移植可能な人工デバイスは、ローカライズされた遺伝子治療の治療のためのプロキシ·プラットフォームとして機能するユニークな機会を提示する。薬物動態学的見地、インプラント/組織界面に遺伝子ベクターの高い局所濃度を両立し、theiの動態を遅らせる遺伝子ベクターの結果、比較的低い入力用量の医療用インプラントの表面誘導体からこの場所からのR撤廃する。長引く住宅目標とされた細胞集団による強化された取り込みの結果として、ベクトル·固定化は、遺伝子ベクターの拡散を最小限に抑えることができます。したがって非標的組織の不慮の接種が低減される。

（また、基板を介した遺伝子送達または固相遺伝子送達と呼ぶ）移植可能な生体材料上の遺伝子ベクターの表面テザリングは、両方の特定の（抗原-抗体18-20、アビジン-ビオチン21,22）を用いた細胞培養や動物実験で実装されました非特異的な23〜26（電荷、ファンデルワールス）相互作用。表面に過度に強い結合が標的細胞によりベクター内在化を排除するので、移植された装置の表面へのベクターの共有結合は、以前に非機能として考えられてきた。最近、この制限は、tetオペレーターとして使用自発的に加水分解性架橋剤の使用によって克服することができることが実証されたアデノウイルスベクター27,28のステントおよびキャプシドタンパク質の修飾された金属表面との間に彼女。さらに、 インビトロおよびインビボでの導入遺伝子発現のベクター放出速度および時間経過は、加水分解28の異なる動態を示す加水分解性架橋剤を用いて調節することができる。

本研究は、活性化金属表面にアデノウイルスベクターの可逆的共有結合のための詳細なプロトコルを提供し、ステント血管形成のラット頸動脈モデルにおいて培養平滑筋細胞および内皮細胞およびin vivoでのin vitroでのその後の伝達事象を研究するための有用な実験設定を導入。

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プロトコル

放出実験のためのCy3標識アデノウイルスの調製

  1. （; pHは9.3 CBB）炭酸塩/重炭酸塩緩衝液の650μlの空の Adの2×10 12粒子（約2×10 11感染単位）を中断します。
  2. 0.2ミリグラム/ mlの最終濃度になるように（2のCy3（NHS））を1mlのCBB中のアミン反応性蛍光色素の1バイアル（0.2ミリグラム）の含有量を溶解する。
  3. 5秒間ウイルス懸濁液、渦に対する染料溶液100μlを加え、（100〜200 rpm）し、振とうしながら28℃で1時間インキュベートする。
  4. PBSで20ミリリットルロース6Bカラムを平衡化する。 Cy3標識広告サスペンションを滴下ゲル床の中心に750μlのを追加します。
  5. ウイルス懸濁液を樹脂に浸透した後、5mlのPBSを加える。溶出液は捨ててください。
  6. 0.5mlのPBSを追加し、ラベルされたガラス容器に溶出液を収集します。 10 0.5mlの画分の合計を収集し、このステップの10倍を繰り返します。
  7. アッセイ番目eは、ウイルスDNA含有量について分光光度計（260および280nm）によって画分を集めた。
  8. 260nmでの合計（F10を通じてF1の合計）の光学密度（OD）の10％以上を含有する画分をプールする。注：典型的な画分F3、F4、F5およびF6をプールし、混合する。
  9. 再検定ウイルスDNA含量およびCy3用の蛍光測定（550 元 / 570 全角 nm）を分光光度法による（260および280nm）、およびアッセイによって混合プールされた画分を、それぞれ、キャプシドタンパク質を標識した。注：Cy3標識（NHS）2の検量線を10 -9 -10 -13モル/ Lの範囲を調製し、蛍光定量プールした画分を同じプレート上でアッセイされるカバーする。
  10. ラベルされたウイルス収量と標識密度を計算します。 1.19×10 12ウイルス粒子/ mlでは、1cmの経路長29 1 OD単位に相当すると仮定する。収率= [（外径260nmの /1.19)*10 12 * V /入力広告量] * 100、外径260nmの光デは、：式を使用します。260nmでのプールされた製剤のn​​sity及びVは、Ad回収率（％）を算出するプールされた処方物（溶液）の体積である。式を使用します。ラベリング密度= C * 6.02 * 10 23 /（OD Cがプールされた製剤のCy3の濃度（モル/ ml）をし、外径260nmのである260nmの /1.19)*10 12は 、プールされた製剤の光学濃度である260nmでの平均のCy3標識密度を算出する。注：標識されたウイルスの典型的な回復は、入力量の> 70％である。ラベリング密度は単一のウイルス粒子当たり600〜800発蛍光分子である。
  11. 個別の放出実験に適したより小さな部分（典型的には5×10 11粒子）に空の分注しCy3標識広告。注：現在のプロトコルは単に放出実験におけるCy3標識Adの使用を指定します。すべての形質導入の研究は、非標識のベクターを用いて行われる。

金属試料の2の活性化

  1. ステンレス秒を洗うゴマは、イソプロパノール中で連続してディスクまたはステンレス鋼ステントメッシュ（5分×2）、クロロホルム、振盪（100 rpm）で55℃で（5分×2）。溶剤を除去します。
  2. 200℃で30分間、試料を加熱する。
  3. （100 rpm）し、振とうしながら72℃で（w / vの1〜2％）を水にインストールされた潜在的チオール基（PABT 27,28,30）とポリアリルビスホスホネートに溶解する。 KHCO 3で4.5〜5にpHを調整する。
  4. （100〜200 rpm）し、振とうしながら72℃で2〜4時間、PABT溶液中で金属試料をインキュベートする。注：手順は、この時点で一時停止してもよい。サンプルを4℃で3日間安定である。
  5. 再蒸留水（DDW）で3回のサンプルを洗浄します。
  6. トリス（2 - カルボキシエチル）ホスフィンにサンプルをさらす（TCEP; 0.1 M酢酸緩衝液中の15 mg / mlで）を28℃で15分間（100〜200 rpm）し、振とうしながら。
  7. 脱気したDDWで5回すすいでください。
  8. インストールされたピリジルジチオ基で2％のポリエチレンイミンにサンプルを公開（PEI PDT 27,28,30）。注：手順は、この時点で一時停止してもよい。サンプルを4℃で2週間安定である。
  9. DDWでサンプルを3回洗浄します。
  10. チオールにピリジルジチオ基を変換するために10 mg / mlのジチオスレイトール/ DDWにサンプルをさらす。
  11. 脱気したDDWで再び5回洗浄します。

3アデノウイルスの活性化および金属表面の固定化

  1. 炭酸塩/重炭酸塩緩衝液（; pHは9.3 CBB）の487.5から495μlの広告のeGFPまたはAd リュックどちらの5×10 11粒子（約5×10 10感染単位）を中断します。注：Cy3標識がAd 空の粒子をラベルの放出研究のために、5×10 11を使用します（CBBで487.5から495μlに音量を調整）。
  2. 変動する加水分解速度28でHCを溶解[（急速に（T 1/2 = 5日）、中間（T 1 /20 mMのでCBBにおける図1]または非加水分解性架橋剤（NHC）、スルホ-LC-SPDP;ゆっくり= 12 d）および（T 1/2 = 50 d）のHC、 すなわち RHC、IHCまたはSHC 2。
  3. すぐに、500μlの（架橋剤の200〜500μMの最終濃度）の合計ボリュームに対してウイルス懸濁液に架橋剤溶液の5から12.5μLを加え、ボルテックスし、振盪しながら28℃で1時間インキュベート（100〜 200回転）。
  4. 脱気した5mMのEDTA / PBS（EPBS）と20ミリリットルロース6Bカラムを平衡化する。樹脂床の中央にクロスリンカー修飾広告懸濁液500μLを滴下添加する。
  5. 脱気したEPBSを5ml追加します。溶出液は捨ててください。
  6. 脱気したEPBSの0.5ミリリットルを追加し、ラベルされたガラス容器に溶出液を収集します。 10 0.5mlの画分の合計を集める10回にこの手順を繰り返します。
  7. 260および280nmで分光光度法を用いて収集した画分のODを決定し、ウイルス力価（1.19×10 12 / mlのCORREにODを変換する1 OD）〜29 sponds。
  8. 溶出されたウイルスの> 10％を含有する画分をプール（注：通常、画分F3-F6）。プールされたサスペンションのための分光光度価アッセイを繰り返します。
  9. 活性化された金属サンプル（2.11に従って）でバイアルにウイルス懸濁液を転送します。 （100〜200 rpm）し、振とうしながら28℃で1時間、アルゴン雰囲気中でインキュベートする。注：この工程で得られたのAd-テザー金属試料はさらに、プロトコルのセクション5-7で説明し、その後のリリースおよび形質導入実験に使用されている。

PCRによる表面結合Adベクターの4。定量

  1. セクション2および3に記載されるように準備する表面固定広告eGFPを用いて製剤化メッシュ（タイプごとにn = 3）のNHC、SHC、IHC及びRHCを介して係留。
  2. ウイルスDNAを単離するのQIAamp DNAマイクロキットを使用してください。 ATL bの180μlのからなる混合物を200μlを含む1.5 mlのプラスチックチューブに個別にメッシュを配置しますufferおよびプロテアーゼK（共にキットから）20μlの。同じ混合物を含む別のチューブに（検量線用標準規格のような）広告のeGFP粒子の既知量を追加します。一晩振とうせずに56℃でインキュベートする。
  3. （キットから）AL緩衝液200μlを追加し、ボルテックスで混和100％エタノールを200μlを追加し、5分間室温でインキュベートする。
  4. （キットから）個別のMinEliteカラムに、各チューブから混合物を移し、1分間8,000 rpmでスピン。 1分間8,000 rpmでそれぞれのカラムとスピンに加え、新鮮なALTバッファー180μlのメッシュ含むチューブを洗浄します。溶出液を捨てる。
  5. 1分間8,000 rpmでのカラムとスピンに（キットから）AW1の緩衝液500μlを追加します。溶出液を捨てる。
  6. 1分間8,000 rpmでのカラムとスピンに（キットから）AW2バッファーを500μlを追加します。
  7. 溶出液を捨てる。
  8. さらに3分間14000 rpmでスピンuntilの列は、完全に乾燥している。溶出液を捨てる。
  9. 列にミリQグレードの水50μlを加える。 5分間14000rpmでスピン。 （キットから）個人のコレクションチューブに各カラムからの溶出液50μlのを収集します。
  10. 以下の乗算を組み合わせることにより、PCRマスターミックス溶液を調製する（パワーSYBRグリーンPCRマスターミックス12.5μlの、10μMのeGFPのセンスプライマーの0.63μlの[5'-ACG TAA ACG GCC ACA AGT TC -3 ']、10の0.63μlのμMのeGFPアンチセンスプライマー[5'-AAG TCG TGC TGC TTC ATG TG -3 ']、ミリQグレードの水を6.3μl）を。 「無DNA」コントロールを含む計画された反応の数によってこれらのボリュームを掛けます。
  11. ロードおよびマイクロアンプ光学96ウェル反応プレートの三重ウェルにPCRマスターミックスを20μl（ステップ4.8）、広告のeGFPのDNAを5μl。マイクロアンプ光学接着フィルムでプレートを密封。気泡を除去するために1分間1000rpmでプレートをスピン。
  12. 7500リアルタイムPCRエンジンのレセプタクルにプレートを置きます。 7500システムSDSソフトウェア（V1.4以降）のメインメニューで「新しいテストを作成」を選択します。 「次へ」をクリックします。 「新しい実験ウィザード」画面で、スクロールダウンメニューからSYBRグリーンを選択し、「追加」をクリックします。プレートのレイアウトを取得するには「次へ」をクリックします。分析しようとする全てのウェルをハイライト表示し、SYBRグリーンを選択します。連続しないDNA対照ウェル、広告のeGFP DNAスタンダードと未知を強調表示しておらず、スクロールダウンメニューから、それぞれの名称を使用してそれらをマークします。
  13. 計器タブに切り替えます。 「解離フェーズを追加」を選択し、25μlにデフォルトの50μlの見事なボリュームを変更します。 [開始]をクリックします。
  14. 外れ値および他の不規則性のためのQCサマリーを確認してから使用してPCRの結果を分析します。

モデルスチールメッシュから加水分解性クロスリンカー - つながベクター粒子の放出動態5。

  1. （100〜200 rpm）し、振とうしながら1％のBSA / PBS（1時間×3）において（3.9に従って）RHC、IHC、SHCおよびNHCを経由してCy3標識広告で誘導体化メッシュサンプルを洗ってください。
  2. 無菌微細なピンセットを用いて、溶出緩衝液200μl（0.1％BSA / 0.1％のTween-20 / PBS）を予め充填し、96ウェルプレートの各ウェルにメッシュを配置する。
  3. 各メッシュの中心部分の蛍光画像を取る。顕微鏡と画像取得のために使用されるCCDカメラの設定を記録します。
  4. 最大の減少とよくスキャンモードで蛍光定量プレート（550 元 / 570 全角 ）アッセイ。バックグラウンドコントロールなどの非誘導体化メッシュでウェルを使用してください。
  5. （50 rpm）しながら37℃でプレートをインキュベートする。
  6. 所定回数（1〜30日の範囲）で、メッシュを乱すことなく、溶出緩衝液を吸引し、新鮮な溶出緩衝液200μlを加える。繰り返してバッファを交換した後に4.3から4.5を繰り返します。

養殖セル画の6形質導入メッシュ固定化AdベクターによるLS

  1. 広告のeGFPを洗う-またはAd リュックは （100 rpm）し、振盪しながら5分間滅菌PBSで3回メッシュを誘導体化。
  2. 微細な滅菌ピンセットを使用して、メッシュディスクを一つずつ削除し、個別に対数増殖期における目的の細胞型に、96ウェルプレートのウェルに入れます。
  3. 5％CO 2中、37℃で24時間、細胞をインキュベートする。
  4. 程度およびウェル中の遺伝子発現の空間的分布を決定する（eGFPのまたはルシフェラーゼの生物発光イメージングのための蛍光顕微鏡法、蛍光光度法）それぞれ非末端終点アッセイを使用する。
  5. 任意に、PBSの代わり培地は、低eGFP発現が予想される場合蛍光アッセイ（535分の485 nm）での感度を増加させる。注：蛍光光度計は、よくスキャン機能を装備している場合、ウェル中のeGFP発現細胞の空間分布を評価するために、よくスキャンモードでプレートを読んだ。為替PB蛍光測定を完了した後の媒体に対するS。
  6. イメージFITCフィルターセットを使用して（基本的な及び離島メッシュの両方）広告のeGFP -elutingメッシュとウェル中の形質導入細胞。 40-200X倍率での代表的な画像を取る。蛍光顕微鏡画像の取得のために使用されるCCDカメラの正確な設定を記録します。
  7. 直接広告リュック -elutingでウェルにPBSにルシフェリン株式の5μlを添加した（10mg / ml）を前に生物発光イメージングに10分間37℃、5％CO 2でインキュベート/ mlおよび500μgのの最終濃度に噛み合う。培地を吸引し、画像化した後、ルシフェリン非含有培地と交換してください。
  8. 基板媒介遺伝子導入、次のレポーター遺伝子発現の動態を研究するために、所定の時間（2週間まで）でのエンドポイントアッセイを繰り返します。

ディレイド時点でプリザーブド伝達能力の7の検証

  1. 広告のeGFPドを準備BAEC（（2.1から2.11と3.1から3.9に従って）、ベクターテザリング用のRHC、IHC、SHCとNHCを使用してメッシュをrivati​​zed、個別に60〜80％コンフルエントのウシ大動脈内皮細胞を96ウェルプレートのウェルにメッシュを配置）。
  2. （6.4から6.5に従って）蛍光顕微鏡や蛍光光度を使用して1と2日後にメッシュの配置でメッシュを固定化した広告eGFPを用いて培養したBAECの形質導入を分析します。
  3. 形質導入開始後48時間は、PBSで二回メッシュを含むウェルを洗う。
  4. 各ウェルに0.25％トリプシン/ EDTAを200μlを加え、（100 rpm）しながら37℃で15分間インキュベートする。 PBSで洗浄する3倍。
  5. メッシュに関連付けられているすべてのEGFP陽性細胞の完全な除去を確認するために、蛍光顕微鏡や蛍光光度法を使用してください。
  6. （2から2.7×10 4細胞/ウェル）60〜80％の初期播種密度で部分的に放出されたメッシュとウェル内に新鮮に継代したBAECをシード。
  7. 37℃、5％CO 2でプレートをインキュベートするの前に、蛍光顕微鏡や蛍光法による「新しい」伝達事象の評価に一定の期間（1-10日）のための2。

ステント血管形成術のラット頚動脈モデルにおける8広告溶出型ステントの展開

  1. このプロトコルで説明されているすべての動物の手順は、実験動物の使用に関する連邦の規制に適合し、フィラデルフィア小児病院のIACUCによって承認された。無菌外科の条件を遵守するために、すべての商品は、オートクレーブ滅菌する。ビーズ滅菌器は、最大5つの連続した​​動物では器具の使用の間に採用されている継続的な無菌性を保証するため。
  2. 広告リュックが 2.1から2.11と3.1から3.9に従ったステントを-eluting準備します。使用前にはもはや24よりも時間、4℃で滅菌PBS中のウイルス誘導体化ステントを保管してください。
  3. ケタミンのIP注入（100mg / kgの）、およびキシラジン（5ミリグラム/ kg）での雄性Sprague-Dawleyラット（400〜450グラム）を麻酔。デ足のピンチ応答と筋緊張による麻酔深度termine。角膜と強膜の乾燥を防ぐために、眼科獣医軟膏を適用します。注：4％吸入麻酔及び麻酔を誘導し、維持するための2％のイソフルラン（1 L /分）、可能であるが、動物の頸部への無料アクセスを妨げるため、経験の浅いユーザーにはお勧めしません。
  4. つま先のピンチによって麻酔の深さを再評価。剃ると無菌的に準備ネックと上胸部。抗生物質（セファゾリンを、20mg / kgの; IM）投与し、鎮痛剤（メロキシカム; 0.5ミリグラム/ kgを、SC）および食塩水（10ミリリットル/ kgで、SC）を。 24 Gカテーテルを尾静脈にカテーテルを挿入し、ヘパリン投与（200 IU / kgで、IV）。注：10mg / kgの（IM）、エンロフロキサシン（バ​​イトリル）の用量は、代わりにセファゾリンを用いることもできる。グラム陽性菌に対して有意な活性を欠いている抗生物質の使用は避けてください。 10-15ミリグラム/ kgのカルプロフェン（リマダイル）が先制鎮痛薬としてではなく、メロキシカムを用いてもよい。麻薬性鎮痛薬（ 電子.G。、モルヒネ、ブプレノルフィン）は、それらの呼吸の押下特性のために避けるべきである。
  5. 皮膚や首の筋膜を通して正中切開を行います。左外頸動脈を分離するために鈍い切開技術を使用してください。ネクタイオフ外頸動脈を最も遠位親しみサイトで。内頸動脈の原点にスライド一時合字を適用します。
  6. 左外頸動脈内2mmの動脈切開切開を加えます。
  7. 外頸動脈の切開部を介して共通頚動脈に2 - フレンチフォガティカテーテルを挿入します。生理食塩水でカテーテルの先端を膨らませると、内皮をはぎ取るために、頸動脈分岐部に大動脈弓から3倍を渡します。
  8. フォガティカテーテルの上と総頸動脈への配管の一部（1.04ミリメートル外径、0.99ミリメートルID）をスライドさせます。フォガティカテーテルを撤回。
  9. マウントおよびAd リュッククリンプは、1.5のバルーンの上にステントを誘導体化直径血管形成術用カテーテル。テフロンチューブを通してステントを挿入し、総頸動脈の中央部分にそれを進める。管または血管壁に対してステントをこすることは避けてください。
  10. 30秒間12気圧でステントを配備し、血管形成術用カテーテルを引き抜く。
  11. 動脈切開部位への外頸動脈の近位をオフにネクタイと内頸動脈の一時合字をリリース。
  12. 肌を4.0ビクリル縫合糸を実行し、主食で層における手術創を修復します。
  13. 外来まで加温パッドの上に動物を回復し、その分離されたケージに戻す。痛みや不快感の徴候は通常、手続き後の最初の12時間を超えて、術後の動物が展示されていないが、72時間メロキシカム療法（0.5ミリグラム/ kgで、毎日SC）の拡張を検討してください。

動脈遺伝子発現の9生物発光イメージング

  1. 所定の時点（1日目 - 3総頸動脈における遺伝子溶出ステント展開後数週間の範囲）は、イソフルラン吸入麻酔（酸素中の2〜4％イソフルラン）を用いてラットを麻酔。
  2. サイトを準備し、手術創を再度開く無菌的に、外科用ステープルを外します。左総頸動脈に鈍的切開、再ゲインへのアクセスを使用し、迷走神経および隣接する結合組織から分離。
  3. PBS中50 mg / mlのルシフェリン、PBS中の25％プルロニックF-127の混合物を準備します（1：4 v / v）で、氷上に保管してください。注：この製剤は、4℃での粘性溶液として存在し、すぐに37℃で組織との接触時にゲル化させる。
  4. 総頸動脈の露出セグメントに直接冷やしルシフェリン/プルロニック混合物を200μlを適用し、ゲル堅さを確認します。
  5. IVISスペクトラム装置の撮像チャンバー内の仰臥位で動物を置き、フェイスマスクでイソフルラン麻酔を維持している。
  6. での買収では、コントロールパネルウィンドウ上で（距離をobjectに6.6センチメートルカメラ）の位置「B」を選択します（画像、バージョン4.2以降を生きる）および、「視野」と「ビニング」と題されたドロップダウンメニューから係数「中」ビニング。対象の高さ]ボックスに「2.5センチ」入力します。 「露出時間」ボックスに、時間の単位として「分」を選択し、「2」の数値を選択します。
  7. 三分ルシフェリン/プルロニックゲルを塗布した後、画面上の「取得」ボタンをクリックして画像取得を開始します。注記：画像取得時間、予想される信号強度に応じて、1〜6分で変えることができる。
  8. 画像を取得した後、生理食塩水でゲルを洗浄し、滅菌ガーゼ、コットンアプリケーターで動脈周囲のスペースを軽くたたく。
  9. ビクリル縫合糸とステープル皮膚に傷を閉じます。
  10. 動物を回復し、そのケージに戻す。後でtで繰り返しイメージングステントを固定化したAdベクターによってもたらされる動脈発現の時間経過を研究するためのIMEを指しています。
  11. 代わりに、ルシフェリンの全身投与後撮像を行う。 9.1から9.2に従って動物を麻酔し、分取。 24 Gカテーテルおよびサージカルテープとの安全なカテーテルを尾静脈カテーテルを挿入。
  12. PBSでルシフェリン溶液を調製（50 mg / ml）を10秒間隔でカテーテルを通して溶液1mlを注入する。注射後1分間は9.7から9.8に従って画像取得を開始します。注：より速い注入速度（<10秒）発作活動や呼吸停止を引き起こすことができます。発作や呼吸停止が撮像中に発生した場合、動物を安楽死させなければなりません。
  13. ステップ9.10に従ってください。

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結果

ベクター放出実験

そのような血管内ステントなどの介入装置を含む、インプラントの表面へのアデノウイルスベクターのテザリングは、部分的にベクトル '物理的なターゲティングの欠如をなくす、疾患部位へのベクトルを近似する。しかし、標的組織の形質導入を介して治療効果を達成することができるように、ベクターは、（ 図2）表面から放出されなければならない。加水分解性架橋剤の使用は、架橋剤の加水分解によって媒介さ1のベクトルの有効な付着は変性polybisphosphonateする）、チオール設置金属インプラントと、2）持続放出を可能にするために仮定された。

誘導体化手順の終わりまでに、メッシュディスクに関連付けられた広告のeGFPベクターのゲノムコピー数のeGFP特異的プライマー（ 図3）でウイルスDNAのPCRにより決定される。に応じて、具体的な架橋剤に用い、結合したAdベクターの量は、9 10×9...

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ディスカッション

提示されたプロトコルは、ステンレス鋼表面をコートレスするアデノウイルスベクターの可逆的結合によって達成基板を介した遺伝子送達のための運用方法について説明します。血管再狭窄のステントベースの遺伝子治療の特定の目的のために開発されているが、この技術は、生体材料、生物医学的インプラントおよび遺伝子治療の領域ではるかに広い用途を有する。

提示の研究はもっぱら原型金属基材としてステンレス鋼を利用しているが、PABTは、同等の親和性を有するコバルト/クロムおよびニチノールなどの他の金属合金と結合する（公開されていない）。金属とPABTの無差別相互作用が大きく、この技術31の可能性の生物医学アプリケーションの数を拡大する。また、HC-テザー遺伝子ベクターの使用は、材料表面上にチオールインストールする他の方法を必要とするにもかかわらず、生体材料の他のタイプの実行可能である。

ontent広告遺伝子ベクターは、多くのヒト細胞型および組織中で堅牢な伝達を実現する一方で">、その臨床的意義は、 アデノウイルス 4

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開示事項

この論文で提示されたプロトコルの開発と研究は、米国心臓協会の科学者開発助成金(IF 0735110NおよびMC 10SDG4020003)、米国国立心肺血液研究所の助成金HL 72108(RJL)、および米国国立心肺血液研究所T32 007915(SPF)によって部分的に支援されました。血管形成術カテーテルは、NuMED (ニューヨーク州ホプキントン) から寄贈されました。著者らは、スーザン・カーンズ女史の秘書支援に感謝したいと思います。

謝辞

著者は開示すべき競合する金銭的利益を持っていません。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
316ステンレス鋼メッシュディスクElecton Microscopy SciencesE200-SS
汎用 304グレードのステンレス鋼ステントレーザーカスタムオーダー
AdeGFPUniversity of Pennsylvania ベクターコアAD-5-PV0504
AdLucUniversity of Pennsylvania ベクターコアAD-5-PV1028
広告<サブ>EMPTYペンシルベニア大学ベクターコアA858
Cy3(NHS)2GEヘルスケアPA23000
セファロース6Bシグマアルドリッチ6B100-500ML
UV96ウェルプレートCostar3635
蛍光測定96ウェルプレートCostar3915
細胞培養 96ウェルプレートFalcon353072
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)Pierce Thermo Scientific20490
Dithiothreitol (DTT)Pierce Thermo Scientific20290
sulfo-LC-SPDPPierce Thermo Scientific21650
SpectrophotometerMolecular Devices SpectraMax 190
分光蛍光光度計分子デバイスSpectraMax Gemini EM
オービタルシェーカーインキュベーターVWR1575R
水平エアフローオーブンシェルラボ1350 FM
Centra-CL2 遠心分離機 International Equipment Company426
デジタルボルテックスミキサーFisher Thermo Scientific02-215-370
Eclipse TE300 蛍光顕微鏡ニコン TE300
DC 500 CCDカメラライカDC-500
7500 リアルタイムPCRシステム応用バイオシステム利用不可
IVIS Spectrum生物発光ステーションパーキンス・エルマー利用不可
EDTA二カリウム塩シグマ・アルドリッチED2P
ウシ血清アルブミン画分V (BSA)Fisher Thermo ScientificBP1600-100
Tween-20Sigma-AldrichP1379
デュモン鉗子Fine Science Tools11255-20
A10細胞株 ATCCCRL-1476
ウシ大動脈内皮細胞ロンザBW-6002
ルシフェリン、カリウム塩ゴールドバイオテクノロジーLUCK-1Ge
プルロニック F-127シグマ-アルドリッチP2443-250G
PBS カルシウムとマグネシウムなしGibco14190-136
ウシ胎児血清ジェミニバイオプロダクツ100-106
ペニシリン/ストレプトマイシン溶液Gibco11540-122
DMEM、高グルコースCorning cellgro10-013-CV
0.25% トリプシン/EDTAGibco25200-056
QIAamp DNA マイクロキットQiagen56304
Power Sybr Green PCR Master MixApplied Biosystems4367659
MicroAmp Optical 96-well Reaction PlateApplied BiosystemsN8010560
MicroAmp Optical Adhesive FilmApplied Biosystems4360954
Cephazolin アポテックスが利用できない
ロキシコム(メロキシカム)ノーブルックが利用
ヘパリンナトリウム APP医薬品が利用できない
ケタベット(ケタミン)VEDCOが利用できない
アナセド(キシラジン) Lloid利用不可
Forane (Isoflurane) バクスターは利用できません
湾曲したモリア虹彩鉗子ファインサイエンスツール11370-31
湾曲した超微細グレーフ鉗子ファインサイエンスツール11152-10
デュモン #5 鉗子ファインサイエンスツール11252-20
バンナス スプリングハサミファインサイエンスツール15018-10
ファインハサミ - ToughCutファインサイエンスツール14058-09
外科用ハサミファインサイエンスツール14101-14
ビクリル縫合糸(5-0)エチコンJ385
縫合糸(4/0シルク) ファインサイエンスツール18020-40
ミシェル縫合糸クリップファインサイエンスツール12040-02
創傷拡張器(ランカスターアイスペキュラ)KLS マーティン34-149-07
ホットビーズ滅菌器ファインサイエンスツール18000-45
ミシェル縫合糸クリップアプリケーターファインサイエンスツール112028-12
インサイトオートガード 24 G IVカテーテルベックトン・ディキンソン381412
2F フォガティカテーテルエドワーズライフサイエンス120602F
テフロンチューブベンション041100BST
PTAカテーテルNuMed カスタムオーダー
ガーゼパッドケンドールヘルスケア9024
コットンアプリケーターソロン マニュファクチャリングWOD1003
生理食塩水バクスター281321
10mlシリンジ(ルアーロック)ベクトン・ディキンソン309604
1mlシリンジ(ルアーロック)ベクトン・ディキンソン309628
クリッパーズ#40ブレードオスター 78005-314
Transpore surgical tape3MMM 15271
Puralube 獣医軟膏Pharmaderm利用不可
できない

参考文献

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