方法論記事

ATP依存性クロマチンリモデリング酵素の活性を分析するための生化学的アッセイ

DOI：

10.3791/51721

⸱

2014年10月25日

 ,  ,  , 
1Stowers Institute for Medical Research, 2Department of Biochemistry & Molecular Biology, Kansas University Medical Center

この記事について

サマリー

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ここでは、ATP依存性クロマチンリモデリング酵素の能力を特徴づけるために使用できる生化学的アッセイについて説明し、1)ATP依存性のヌクレオソームのスライドを触媒し、2)ヌクレオソーム基質と関与し、3)ATPをヌクレオソームまたはDNA依存的に加水分解します。

要約

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ATPaseのSNF2ファミリーのメンバーは、ATP依存性ヌクレオソームリモデリングを触媒することにより、ヌクレオソームダイナミクスとDNAアクセシビリティを調節するマルチサブユニットクロマチンリモデリング複合体の構成要素として機能することがよくあります。このような複合体の個々のサブユニットのマルチステップATP依存性クロマチンリモデリング反応への寄与を生化学的に分析するには、反応生成物の産生をモニターし、反応中間体の形成を測定するアッセイを使用する必要があります。このJOVEプロトコルは、クロマチンリモデリング複合体またはサブユニットの様々な組み合わせを含むサブ複合体の生化学的活性を測定できるアッセイを説明しています。 クロマチンリモデリングは、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)ベースの方法を使用してDNA分子上のヌクレオソームの動きをモニターするATP依存性ヌクレオソームスライディングアッセイを使用して測定されます。 ヌクレオソーム結合活性は、同様のEMSAベースの方法を使用してリモデリング複合体結合モノヌクレオソームの形成をモニタリングすることによって測定され、DNAまたはヌクレオソーム依存性ATPアーゼ活性は、DNAまたはヌクレオソームの存在下でのATPからADPおよびリン酸塩への変換速度を測定するために薄層クロマトグラフィー(TLC)を使用してアッセイされます。 これらのアッセイを使用すると、クロマチンリモデリング複合体のサブユニットの機能を調べるために、完全な複合体の活性を1つ以上のサブユニットを欠くものと比較することができます。例として、ヒトINO80クロマチンリモデリング複合体が使用されます。しかし、ここで述べる方法は、他のクロマチンリモデリング複合体の研究にも適用できる。

概要

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SNF2家族のクロマチンリモデリング複合体は、中央SNF2様ATPアーゼサブユニット1,2を含む。単一のサブユニットの酵素など、一部SNF2様ATPアーゼ機能、他の人がより大きなマルチサブユニット複合体の触媒サブユニットとして機能している。クロマチンリモデリング複合体のサブユニットのそれぞれが自分の活動に貢献する分子メカニズムを解明することリモデリングプロセスを分析生化学的アッセイを行う能力が必要です。

人間INO80複合体および他のクロマチンリモデリング酵素によるATP依存ヌクレオソームのリモデリングは、その、DNAおよび/またはヌクレオソーム依存ATPaseの活性化に続いて、ヌクレオソームのリモデリング酵素の結合で始まる多段階のプロセスとして考えることができるヌクレオソームDNA上のリモデリング酵素の転座、およびヌクレオソーム1,2の最終的な再配置。 ATP依存性クロマチンリモデリングプロセスrの分子の詳細を理解するその個別のステップや反応の各ステップにクロマチンリモデリング複合体の各サブユニットの寄与の定義にリモデリング反応の解剖をequires。このような分析は、 インビトロで規定された分子基質を用いてヌクレオソームのリモデリングおよび他の活動を分析する能力を必要とする。

以前JOVEプロトコルでは、定義されたサブユニット組成物3とINO80クロマチンリモデリング複合体とsubcomplexesを生成するために使用される手順を説明した。ここでは、3ヌクレオソーム結合、DNAおよびヌクレオソーム活性化ATPアーゼの定量分析を可能にする生化学的アッセイ、およびこのような複合体に関連したヌクレオソームのリモデリング活動を紹介します。

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プロトコル

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1 ATP依存性ヌクレオソームリフォームアッセイ

ATP依存性ヌクレオソームのリモデリング活性を測定するために、INO80またはINO80のsubcomplexesは、ATPおよび216塩基対、32 P-標識DNA断片の一端に配置された単一のヌクレオソームが含まmononucleosomal基質と共にインキュベートされる免疫精製。反応生成物は、ネイティブポリアクリルアミドゲルでの電気泳動に供される。

  1. 32 P-標識された、「601」DNA断片を生成すること、などのオリゴヌクレオチド5'-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGGおよび5'-AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAGを使用して、をpGEM-3Z-601 4から末端に位置する601ヌクレオソームの位置配列を含む216 bpのDNA断片を増幅フォワードおよびリバースプライマー。
    1. 表1に記載したように100μlのPCR反応をセットアップします。
    2. 以下のプログラムを使用して、サーマルサイクラー中でPCR反応を実行します。1分96℃、followeで94°C、57°Cで30秒、30サイクル、72℃で60秒で45秒間によってD; 72℃で7分で終わる。
    3. PCR反応が完了した後、ヌクレアーゼフリースピンカラムを二度反応生成物を通過させることによって、取り込まれなかったヌクレオチドを​​除去する。
    4. PCR反応は、所望の〜216 bpのDNA断片を生成したことを確認するために、1.2％アガロースゲル中で精製されたPCR産物5μlを実行する。
    5. 精製したPCR産物5μlの20倍に希釈し、UV分光光度計を用いてDNA濃度を測定する。平均収量は約40 ngの/μlです。
    6. シンチレーションカウンターでの精製したPCR産物1μlの放射能を測定します。 CPM / NGを算出することにより、標識効率を推定します。成功した標識反応は、601 DNA断片の〜15000のcpm / ngのをもたらすことが期待される。
  2. 連続希釈法5を用いて標識601のDNA上にHeLa細胞ヌクレオソームを転送します。
    1. の2ピコモルを混ぜる1.0 MのNaCl、10 mMトリス塩酸、pH 8.0、1 mMのEDTA、0.1mMのPMSF、及び1mMを含有する緩衝液50μl中のHelaヌクレオソーム（後述5のように調製した）6μgの32 P-標識された601のDNA断片DTTおよび30分間30℃でインキュベートする。
    2. 順次10mMトリス塩酸（pH8.0）を12.5μlの20.8μlを、および41.6μlを、、、1mMのEDTA、0.1mMのPMSFで希釈して0.8 M、0.6 M、0.4 MのNaClの混合物を希釈し、そして1mMのDTT、各希釈後、30℃で30分間のインキュベーションである。
    3. さらに0.2 Mに混合物を希釈した後、0.1MのNaClを125μlに添加することによって、その後、0.1％のNonidet P-40、30分のインキュベーションで20％グリセロール、および200μg/ mlのBSAを含有する同じ緩衝液を250μl最後の二つの希釈液は30℃で。最大3ヶ月間4℃でモノヌクレオソーム基質を保管してください。
  3. 総容量10μlでの反応をスライドATP依存性ヌクレオソームを実行します。レアINO80ヌクレオソームのリモデリング活性のための最適なNaCl濃度であるためctionコンポーネントは、〜50mMのNaCl（未発表の結果） 表2に記載されている、考慮中に含まれる食塩の量を考慮して、50 mMの各反応中のNaClの総濃度を調整するヌクレオソームと酵素の調製。
    1. アッセイをセットアップするために開始する前に、ネイティブのポリアクリルアミドゲル（18×16 cm）のキャスト。 5％のアクリルアミドを含む単一のゲルを調製するために（アクリルアミド：37.5ビスアクリルアミド：1）、0.5×TBE（45 mMトリス、ホウ酸、1mMのEDTA）、0.01％の過硫酸アンモニウム（APS）、および0.001％N、N、N'、 N'の -tetramethylethylenediamine（TEMED）、 表3に列挙した成分を混合する。ゲルは、室温で少なくとも2時間重合することができるようにします。
    2. EB100バッファの量がまた、各反応を実行するために、予備冷却シリコン処理1.5mlのマイクロチューブに組み合わせる〜20 nMのINO80またはINO80のサブコンプレックス（3記載のように調製した）（ 十分表4）4.75μlの容量を得た。すぐに粉末ドライアイスや液体窒素中で残っているINO80含有画分を再凍結する。
    3. 'X'（ここで、X =反応3の合計数）倍にスケールアップ、食材の残りの部分とマスターカクテルを設定します。 1つの10μlの反応に必要な各成分の量を表5に記載されている。レシピは、実行される反応の数に応じてスケールアップされるべきである。チューブをタップして、またはピペッティングでよく混合し、ダウンピペットマンとし、卓上型微量数秒間チューブをスピン。
    4. ステップ1.3.2で設定反応管のそれぞれにマスターカクテルの5.25μLを分注する。ピペッティングでよく混ぜる。 30℃のヒートブロックまたはウォーターバスに反応管を転送することにより反応を開始し、2時間インキュベートする。
    5. 一方、競合DNAを含むカクテル」のミックスを削除する」の準備とX（X =反応+ 4の合計数）倍にスケールアップヌクレオソーム、。単一の反応用混合物を除去する1.5μlの準備に必要な各成分の量を表6に記載されている。レシピは、実行されるアッセイの数に応じてスケールアップされるべきである。
    6. 取り外しミックス1.5を添加することにより反応を終了します。よく混合し、スピンダウンし、そしてさらに30分間30℃でインキュベートする。
    7. 一方、定数バッファの循環を維持するために、下部チャンバー内の磁気攪拌棒をランニング緩衝液として0.5×TBEを使用して、4℃で30分間、100Vで垂直電気泳動装置におけるネイティブポリアクリルアミドゲルを予め実行します。
    8. サンプルをロードするには、3倍のTBE、30％グリセロール、0.25％ブロモフェノールブルー、0.25％キシレンシアノールFFを含むローディング色素の2.5μlを添加する。簡単にサンプルをスピン、よく混ぜ、ロードのヒントを使用してゲルにロードします。
    9. バッファーの循環で、4℃で4.5時間、200Vでゲルを実行します。
    10. 信号を検出するために、濾紙の二枚のスタックにゲルを移す。透明なプラスチックのラップを使用して、上にゲルをろ紙をラップしてから、所望の時間、4℃で貯蔵燐光体スクリーンに公開。
    11. 同位体イメージングスキャナシステムで画面をスキャンし、適切なソフトウェアを用いてデータを分析する。

2モノヌクレオソーム結合アッセイ

モノヌクレオソームの指定されたINO80複合体の結合親和性をアッセイするために、ステップ1.2で生成されたmononucleosomal基板を用いた電気泳動移動度シフトアッセイ（EMSA）を行う。

  1. セットアップ反応はヌクレオソームのリモデリングアッセイのために説明したが、ATPを省略して、反応からミックスを削除するなどの結合アッセイのためのミックス。 30分間30℃でインキュベートする。
  2. 各反応混合物にローディング色素の2.5μlを加えて、3.5％のアクリルアミド（アクリルアミドを含む未変性ポリアクリルアミドゲルに適用されます。3ビス7.5：1）、1％グリセロール、0.5×TBE、0.01％APS、および0.001％TEMED。
  3. ランニング緩衝液として0.5×TBEを使用して、バッファの循環で、4℃で2.5時間、200Vでゲルを実行し、ストレージ蛍光スクリーンに公開。

3 DNA-とヌクレオソーム依存ATPアーゼアッセイ

20mMトリス塩酸（pH7.5）、60mMのNaClを、6.6のMgCl 2、0.8mMのEDTA、0.015％のNonidet P-40、2.5％グリセロール、0.1 mg / mlのBSA、1を含む5μlの反応混合物中でATPアーゼアッセイを行うのDTT、0.1mMのPMSF、2mMのATP、[α-32 P] ATP（3,000 Ciを/ミリモル）の2μCiの。 INO80複合体の各INO80複合体または量は、3つの並列反応、DNA-またはヌクレオソームに依存しないATPアーゼを測定するための1を含むEB100バッファー、測定するために閉環状プラスミドDNA（5000塩基対、約30 nM）を含有するものを設定してアッセイするために、DNA依存ATPアーゼ、およびヌクレオソーム依存ATPアーゼを測定するために、ヒーラオリゴヌクレオソーム（〜185 nM）を含有するもの。全ての反応は氷上でセットアップします。

  1. 各反応について、予備冷却潤滑1.5mlのマイクロチューブに2.2μlの容量を与えるのに十分なEB100バッファーの量と免疫精製INO80またはINO80 subcomplexesの10-50 nMのを兼ね備えています。すぐに粉末ドライアイスや液体窒素の任意のINO80含有画分を再凍結する。
  2. マスターカクテルを設定します。単一反応のために必要な各成分の量を表7にリストされている。XはINO80の準備の数がアッセイされる= 3（X + 2）1、倍にスケールアップすることによりレシピをスケールアップ。
  3. 「サブカクテル」を含むバッファを準備するためにのみ、DNA、またはヌクレオソームは、3つの個別のチューブにマスターカクテルの2.5（X + 2）μLを分注する。 0.3どちらEB100の（X + 2）μlを、閉じた環状プラスミドDNA（1.5μgの/μl）を、またはヒーラオリゴヌクレオソーム（1.5μgの/μl）を加え、よく混ぜる。
  4. STに設定された酵素を含む反応チューブに適切なサブカクテルの2.8μlを分注EP 3.1。穏やかにピペッティングしてミックスダウンする。気泡を導入することを避ける。
  5. 反応を開始するには、30℃のヒートブロックに反応チューブを移す。
  6. 5後に、15分、30分、インキュベーションの60分、1.5センチ以上の距離下端から直線セルロース、ポリエチレンイミン、薄層クロマトグラフィー（TLC）プレート（20×10cm）に上に各反応混合物0.5μlのスポット。直ちにので、複数の時間点は、単一のチューブから取り出すことができる30℃のヒートブロックに反応管を返す。スポッティングの後、ブロードライヤーを使用してTLCプレートを乾燥する。
  7. TLCプレートの底0.5センチメートルを溶液中に浸漬されるように十分に0.375 Mリン酸カリウム（pHは3.5）を含有するガラスチャンバーにTLCプレートに移す。
  8. チャンバを覆い、かつ、液相の前面がTLCプレートの最上部に達するまで発達する。即時徹底的にブロードライヤーを使用して、プレートを乾燥させる。
  9. RTで貯蔵燐光体スクリーンになるまで乾燥したTLCプレートを公開します。同位体イメージングスキャナシステムで画面をスキャンし、放射性のATP基質とADP生成物の量を決定する。
  10. 加水分解されたATPの量を計算するには、次の式を使用して、出発反応混合物中に存在するATPの量により加水分解％のATPを掛け：ピコモルATP加水分解= 10ピコモルATPを反応xを開始する際に、[ADP /（ATP + ADP）]

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結果

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図面は、ヌクレオソームスライド（ 図1）との結合（ 図2）アッセイおよびDNA-またはヌクレオソーム依存性ATPアーゼアッセイ（ 図3）を含むINO80活動を特徴付けるために使用される生化学アッセイの代表的結果を示す。

図1に示されている実験は、完全なINO80複合体の能力は、FLAG-Ies2またはFLAG-INO80Eを通して精製し、INO80が216塩基対、放射性標識されたDNA断片上に組み立てモノヌクレオソームのリモデリングを触媒するために、FLAG-Ino80ΔNまたはIno80ΔNΔHSAいずれかを介して精製しsubcomplexesで比較します。 DNA断片上のヌクレオソームの位置は、電気泳動移動度に影響を与えます。横方向に配置さヌクレオソームはより速く、より中央に位置するヌクレオソームよりもゲル中に実行。 INO80クロマチンリモデリング複合体を優先的にDNA 6,7,8の一片の中心に向かってモノヌクレオソー...

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ディスカッション

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確実にするために私たちはアッセイで観察することがヌクレオソームのリモデリングおよびATPアーゼ活性はINO80複合体の触媒活性にではなく、中で精製INO80複合体の触媒的に不活性なバージョンの改造を汚染し、および/またはATPアーゼの酵素、私たちは日常的にアッセイヌクレオソームのリモデリングとATPase活性に依存同じ手順を使用して、野生型INO80と平行である。 INO80複合体またはsubcomplexesの異なる調製物の活性を比較した実験の解釈を複雑にし得るATPおよび/またはATP非依存性リモデリング活性を汚染の存在について試験するためにヌクレオソームのリモデリング活性をアッセイする際にATPを欠いたネガティブコントロール反応もまた実行されるべきである。 INO80またはINO80のsubcomplexesの触媒的に不活性なバージョンは、ヌクレオソームのリモデリングまたはATPアーゼ活性を示すべきではない。また、DNA-またはヌクレオソーム非依存ATPase活性の検出はenzymにATPアーゼ（単数または複数）を、混入の存在を示すE分画。活動はまだ触媒的に不活性INO80の存在下で検出された場合、実質的な、DNAまたはヌクレオソ...

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開示事項

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著者らは、競合する金銭的利益はないと宣言している。

謝辞

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著者の研究室での作業は、国立総合医科学研究所（GM41628）からの助成金と、グレーターカンザスシティコミュニティ財団のヘレンネルソン医学研究基金からのストワーズ医学研究所への助成金によって支えられています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
プロテアーゼ阻害剤カクテルSigmaP8340
10x PCR反応バッファー ロシュ・アプライド・サイエンス 
Roche Taq DNAポリメラーゼRoche Applied Science 
NucAwayヌクレアーゼフリースピンカラム AmbionCat. # AM10070
ultrapure ATP USB/Affymetrix77241 25 UM
ウシ血清アルブミン シグマA9418 
40%アクリルアミド/Bis 37.5:1Amresco0254-500ML
超音波処理されたサケの精子DNAs GE Healthcare27-4565-01
10% 過硫酸アンモニウム (APS)Thermo Scientific17874
ベンゾナーゼ ノヴァゲンネコNo. 70664
dCTP, [α-32P]- 6,000 Ci/mmolPerkinElmerBLU013Z250UC
PCR サーマルサイクラー PTC 200MJ ResearchPTC 200
Hoefer 縦型電気泳動装置HoeferSE600X-15-1.5
潤滑 1.5 ml 微量遠心チューブ Costar3207
ストレージ蛍光体スクリーン 分子動力学63-0034-79
3MM濾紙Whatman 28458-005VWR
台風フォスファー GE Healthcare8600
ImageQuantソフトウェアGE Healthcarever2003.02
TLC ガラスプレート、PEI-セルロース Fミリポア5725-7
Immobilon-FL トランスファーメンブレン 7 x 8.4ミリポアIPFL07810
エンドウィンドウまたはパンケーキ付き汎用サーベイメーター GM(ガイガーミューラー)プローブBiodexModel 14C
1143509400111435094001

参考文献

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EMSA ATPase INO80

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