タンパク質の削除の誘導を介して子宮内でエレクトロポレーションは、トランスジェニックモデルにおいて神経細胞の移動の欠損を定義する

サマリー

ニューロンの移動は、多数の細胞自律的および非細胞自律的要因によって調節されています。 このプロトコルは、トランスジェニックマウスの表現型が細胞内因性メカニズムの破壊によるものか、ニューロンとその環境との間の相互作用の障害によるものかを判断するために、子宮内エレクトロポレーションをどのように使用できるかを示しています。

要約

トランスジェニックマウス系統でのCre-Lox系を用いた遺伝子欠失がタンパク質の機能を研究するために使用される強力なツールである。しかし、非常に特異的にCreモデルを除いて、組織または細胞集団全体のタンパク質の欠失は、しばしば複数の相互作用のメカニズムに起因する複雑な表現型をもたらす。問題になっている、またはそのセルの環境の障害から生じる非細胞自律的なメカニズム、から細胞に固有のものである細胞自律的な機構の混乱から表現型の結果は、識別することは困難であるかどうかを決定する。 in vivoでのコンテキストでタンパク質機能への洞察を得るために、 子宮内エレクトロポレーション（IUE） で開発皮質またはいくつかの他の選択された脳領域内の細胞の小さなサブセットで遺伝子欠失を可能にします。 IUE背側終脳、内側終脳、海馬、または神経節隆起を含む、特定の脳領域を標的とするために使用することができる。これは、観察oをを容易に健全な環境の文脈における細胞自律的な遺伝子欠失の結果、F。このプロトコルの目的は、IUEが細胞自律的タンパク質欠失の非細胞自律的効果とを区別するに重点を置いて、フロックスジェニックマウス系統におけるラジアル移行の欠陥を分析するために使用することができる方法を示すことである。制限された細胞集団におけるIUE媒介遺伝子欠失に対する全体皮質内の遺伝子欠失から生じる表現型と比較することにより、脳の発達におけるタンパク質機能へのより深い洞察は、分離のいずれかの技術を使用しても得ることができる。

概要

ラジアル移行が早い皮質の開発の中心的なプロセスです。このような正確な有糸分裂の終了と神経分化、細胞極性、細胞骨格の動態および膜貫通受容体の発現の調節、ならびにそのような放射状グリア足場の形成のような非細胞自律的因子などの細胞自律的な様々な要因に依存し渡り鳥ガイダンス分子^1-3の分泌。これらのメカニズムのいずれかの破壊がトランスジェニックマウスモデル^4-8にニューロン移動を損なうことができるので、マイグレーションの欠陥の根本原因を決定することは、複雑で困難なプロセスであることができる。 子宮内エレクトロポレーション（IUE） で補完し、簡素化するために使用することができるそれによって、遺伝子ノックアウトモデルの表現型との解釈は、放射状の移行^7,9-11に必要な重要なメカニズムを解明。

子宮内エレクトロポレーションでは （IUE）はによるプラスミドcarryiプロセスであり、目的の遺伝子およびレポーターの両方をngのは、マウスまたはラット胚の脳内脳室に注入した後、電流^12〜14の使用を介して心室の内側を覆う細胞に引き込まれる。これは研究者がアップまたは電気穿孔ニューロンの発生または機能の目的の遺伝子のダウンレギュレーションの効果を分析することができます。 IUE後、脳を免疫組織化学^7,9-11、電気生理学¹⁵または細胞培養物^16,17のために処理することができる。 IUEの主な利点は、遺伝子発現の高度に特異的な操作が可能である。さらに、IUE有向電流（ 図2）を介して発達中の脳の特定の領域を標的化するために使用することができる。 IUEも^10,18-21（テトラサイクリン誘導性遺伝子発現が一例である）は、種々のプロモーターまたはプラスミド活性化システムの制御下で遺伝子を担持するプラスミドの注入を介して特定の細胞型を標的化するために使用することができる。

jove_contentは"> IUEのCreのLox仲介遺伝子の切り出しシステム^7-9,11,22と組み合わせて使用することができる。Creタンパク質のためのメッセージをコードする遺伝子を含むプラスミド（フロックス対立遺伝子についてホモ接合性の胚にエレクトロポレーションすることができる遺伝子または特異的なDNA領域）のCre媒介DNA組換えのための2つのloxP部位によって隣接される。Creがその後のフロックスallele.The効果のノックアウトを生成する、特にエレクトロポ神経前駆細胞に目的の遺伝子の組換えを誘導する神経遊走および個々のニューロン内の開発にノックダウンタンパク質は、次に検討することができる。Creリコンビナーゼのエレクトロポレーション、無傷の支援環境を残して、影響を受けた細胞のわずかな集団において組換えを誘導する。これとは対照的に、特定の細胞型の制御下のCreの組織特異的発現プロモーターは、全体の組織全体で発生した両方の移行神経芽細胞と周囲の環境が影響を受ける可能性があること。したがって、JUXので、これらの2つのアプローチのtapositionは、与えられた移行欠陥が自律的または細胞非自律的なメカニズムをセルに起因しているかどうかを判断できます。実験的なシステムの両方の不良移行は細胞自律的メカニズムから観察された表現型の結果を示唆している。組織特異的Creリコンビナーゼモデルにおける欠陥の移行とのCreのエレクトロポレーション後の通常の移行は、目的の遺伝子は、非細胞自律的な機構を介して作用していることを示している。

IUEもノックアウト動物を^7,9,10に潜在的に相互作用する遺伝子をエレクトロポレーションによって、レスキュー実験を行うために使用することができる。例えば、研究者は下流のターゲットを電気穿孔すると、移行欠陥が電気穿孔ニューロンで修正されているかどうかを決定することによってトランスジェニックモデルにおける移行の表現型を救出しようとする可能性があり。これが成功したレスキューが通常移行がSPEの中でタンパク質の発現を操作することによって復元することができることを示している付加的な利点を有しているcificニューロン、周囲の環境は依然として標的遺伝子を欠損であっても。再び、このアプローチは、欠陥のあるメカニズムは、細胞自律的であるかどうかを決定するという利点を、トランスジェニック系統を交配または生成するより効果的な、より多くの時間とコストである。

IUEはノックアウト胚（ 図4C）にレポータープラスミドの電気穿孔を通って移動するニューロンを追跡するために使用することができる。手術時に心室の内側を覆うだけのニューロンが¹⁷エレクトロポレーションされると、IUEは、 インビボでのそれらの形態の視覚化の利点を有する特定の時間に生まれたニューロンを追跡するために使用することができる。

最後に、このような内側または背側終脳、海馬または神経節隆起（ 図2）のような脳の領域を標的とするIUEを使用することが可能である。これは、研究者の合併症の結果の特定の領域とは独立に遺伝子機能を調査するために力を与える近隣の構造にノックダウンタンパク質からる。

網膜芽細胞腫タンパク質（pR​​bの）のp107およびp130のポケットタンパク質ファミリーを含んでよく、細胞周期の出口のレギュレータを設置している。しかしながら、これらのタンパク質はまた、神経発生の細胞周期の独立した側面を調節するという証拠が増えている。我々は以前に示したように、pRbのとP107は、接線^4,23とラジアル移行⁶の両方で重要な役割を果たしている。ここでは、トランスジェニックモデルでのCreの子宮内エレクトロポレーションでの使用を例示するために、神経遊走⁶にポケットタンパク質ファミリーのメンバーのpRbおよびp107の役割を実証する。要約すると、IUEは遺伝子欠失（または過剰発現）の細胞自律的な効果を分析する強力な方法を提供します。モデルをノックアウト特定の組織と組み合わせると、IUEは、神経移行を制御するメカニズムに関する追加情報を提供することができます。

プロトコル

注：全ての実験は、動物管理上のカナダ人評議会のガイドラインに付着し、オタワの動物ケアの倫理委員会の大学によって承認された。

1.手術前の準備と材料

1. プラスミド準備：
   1. 製造業者のプロトコルに従ってキアゲンMegaPrepを使用してプラスミドを準備します。高いDNA収量を確保し、一晩インキュベートする形質転換された細菌をLBブロスの少なくとも400ミリリットルを接種する。
   2. 少なくとも5μgの/μlの最終濃度に100〜200μlのTEに再懸濁プラスミド。 -20℃でアリコートのDNAとストア。濃度が低すぎると、析出しないと、これは不純物を追加できるように再懸濁する。新しい準備をやり直す。
   3. 手術の前に、0.1％希釈されたプラスミド溶液の10または20μLあたり（w / v）のファストグリーン色素の1μlの滅菌水にを2μg/μlに単一のプラスミド（例えばCreを-GFP）を希釈する。 GFPの場合目的の遺伝子をする別個のプラスミド上に同時エレクトロポレーションし、1の比率でGFPプラスミドを、目的の遺伝子を有するプラスミドを注入：GFPでマークされたすべてのセルの両方で同時エレクトロポレーションされる可能性を最大化するために4プラスミド。
2. ガラスマイクロキャピラリーチューブを引っ張る - 62℃での一段階のプルを使用して、標準的な針プラー上の（1の外径を以下の針と呼ばれる）。
3. ニードルホルダー、巻かリトラクター、鉗子、手術のためにはさみ、針、ホッチキス、ステープル、ガーゼ、創傷カバー、外科用ドレープ（; 材料表図1A、B）用のはさみ：以下を含む外科パックをオートクレーブ。
4. 他の必要なツールを収集します。·エレクトロ、Femtojet Microinjecter、Tweezertrodes（5または7ミリメートル）、生理食塩水、縫合糸、5ミリリットルのシリンジ（ 材料表 ）。

2.手術のためにマウスを準備

1. 疼痛管理のために、時限-Pを注入1時間の手術の前にブプレノルフィン（0.05 mg / kg体重）とregnantマウス。 E17.5の胚の12.5日（E12.5）から任意の場所になりましマウスに、このプロトコルを適用します。
2. バックロードをするmicroloaderピペットチップを使用して、プラスミド溶液で針を引っ張った。これは針が詰まるようになりますように、まだ針の先端に完全に記入しないでください。
3. 1 L /分のO ₂で2~5％イソフルランガスを用いてマウスを麻酔し。一度不動、フェイスマスクに配置し、乾燥を防ぐために、目に軟膏を適用する。後ろに1ミリリットルの生理食塩水（0.9％NaCl）を皮下に注入する。
   注：イソフルランガスで作業する場合、過剰なガスを奪還し、部屋の中に逃げるのを防ぐためにガススカベンジャーを使用しています。
4. 腹部を剃る。 、Chlorohexadineスクラブで腹部を洗って水で洗い流し、そしてchlorohexadine、70％エタノールの最終前処理溶液を適用する。毛皮をカバーするが、腹部曝露（ 図1C、D）を残すために、滅菌ドレープやガーゼでマウスをカバーしています。

3。 子宮内エレクトロポレーションでは、

1. 下の乳首の間に腹部の皮膚の切開を行います。白線に沿って腹腔内に腹膜を切った後、結合組織を引き裂くことによって離れて下層の筋層から肌を引き出します。離れて傷の端を引っ張るために開創器を挿入します。
2. 腹腔から子宮を取り出し、（ 図1E）に示すように、それをレイアウト。
   1. 別の子犬（例えば、目的の遺伝子とGFP 対 GFPなど）の異なるプラスミドを注射する場合、それぞれの側に仔をカウントし、各プラスミドに何を注入するためにどれと決める。バック暖かく、潤滑胚を維持するために腹部に子宮の片側を交換してください。すぐに（好ましくは、体温に温め）生理食塩水でさらさ子宮を湿ら。
   2. （このようなトランスジェニック胚にCreを-GFPを注入する場合など）同じプラスミドを持つすべての仔を注入する場合はONLyが一度に子宮の1ホーンを取り除く。
3. 注入ワンドのグリップの頭の中でロードされた針を入れて、慎重に小さな外科用ハサミや細かいピンセットで先端をカット。まだ流体が（ 図1Ji-IV）を通過させながら、針はできるだけ長くとどまるように先端をカットします。
   1. 足のパドルが押されたときに、0.1〜0.2μLの小さなまだ見えやすい滴が針の先端に表示されるように、マイクロインジェクターで注入（秒）と射出圧力の長さを調整します。別の針の間、可能な限り一貫性のあるこの液滴の体積にしてください。
      注：このステップは（議論を参照）胚の生存のために重要である。
   2. Femtojetについては、次の注入パラメータを使用します。圧力を注入する（PI）= 250〜300ヘクトパスカル。噴射時間（TI）= 0.8〜1.2秒。補償圧力= 10〜50ヘクトパスカル。必要に応じて、針の間の変動に対応するために、これらのパラメータを調整する。
4. S胚を選出し、そっとその背中、（ 図1F）上向きに傾いた頭の上にそれを配置する。
   注：これは胚を回すか、シフトが必要な場合があり、あまりにも多くの圧力を適用し、胚を操作しながら羊膜嚢の破裂を避けるためにしないように注意してください。
5. 胚が配置されると、矢状洞に三日月形の影のパラレルとして提示心室を、見つける。少し角度心室上記子宮に針の先端をタッチし、子宮壁に針をガイド。必要な圧力の量は、ニードルの鋭さに依存する。心室に皮質に針を押してください。
   注：追加の検出可能な抵抗はめったにありませんが、胚の頭は、多くの場合、わずかに押され、その後針が心室に皮質を通過する際に、反跳。
6. プラスミド溶液を注入するために足のパドルポンプ。緑のエリアが表示され、に準拠するまでポンプを継続する心室（ 図1G）の円弧形状。若い胚（E14.5にE12.5）の色素は、多くの場合、対側脳室に拡散する。
   注：ポンプの数は、針の先端の直径に依存する胚の年齢（心室の大きさに起因する）、所望の注入量を。胚の間でできるだけ一貫として注入量を保管してください。
7. 3つまたは​​4つの胚を注入する。作業中は生理食塩水で湿ったすべての露出胚を保管してください。
8. バック注入された最初の胚に移動し、正電極は、脳（ 図1H）の所望の領域にプラスミドを描くようにパドルを置く。角度が負極になるよう、電極間の最短経路は、エレクトロポレーションの対象となる構造（ 図2）を介して直接通過する。
9. パドルが所定の位置に入ると、ショックを適用します。胚の年齢およびサイズに応じて、35〜50 Vの5つのパルスを使用する（Tを参照できる1）。 950ミリ秒のパルス間隔で5ミリ秒のパルス長：以下のエレクトロポレーション·パラメータを使用してください。すべての注入された胚を繰り返します。
10. 最後の針おそらく乾燥させ、ステップ3.9の間に詰まったとしてステップ3.3のように、新しい事前ロードされた針の先端をカットします。同じプラスミドまたは異なるプラスミドのいずれかで3つまたは​​4つの胚の次のセットを注入した後、ステップ3.9のように衝撃を与え。子宮の片側にあるすべての仔が注入されると、女性の腹部から子宮の第2の面を削除してから、それを暖かく保つために完成した側を交換してください。
11. 羊水嚢に外傷を防ぐために、あまりにも多くの圧力を適用するために生理食塩水ではなく、湿った表面を保つように注意して、女性に子宮の両側を返します。単純な連続ステッチで閉じ筋肉層を縫合。ステープル皮膚が閉じ。ステープルが使用できない場合は、簡単な中断されたステッチで皮膚を縫合。 （ 図1I）
12. suturiながらNG、徐々に軽減する妊娠中の女性の麻酔を許可するようにイソフルランを断る。
    注：手術が完了した後でこれはダムの覚醒を促進します。胚の生存率を改善することが可能な限り短時間麻酔女性を保ち。総手術時間は、女性が最初に麻酔をしたときから開始し、約30分でなければなりません。

4.アフターケア

1. インキュベーター内または麻酔から回復するための加熱パッド上に縫合し、女性を配置します。清潔な寝具に彼女をベッドと水分補給を維持するケージに標準回復ゲルを配置。術後疼痛管理のために、その後、手術後8時間間隔でブプレノルフィンの雌の3用量（0.05 mg / kg体重）、12時間間隔で4つの追加の用量を与える。

5.収穫ブレインズ

注：脳は成人期にあらゆる年齢投入時に収穫することができる。以下が適用されます出産前に脳を収集するため。子犬が生まれた後、子宮内の順序はリターのすべての子犬のいずれかが同じプラスミドを注射されなければならないので、失われた、またはコントロールおよび実験動物とを区別する別の方法が考案されなければならないことに注意してください。

1. 冷（4℃）を調製し、前の女性安楽死させ、4％パラホルムアルデヒド（PFA）で濾過した。
2. ペントバルビタールナトリウムの致死量（100 mg / kg体重）の腹腔内注射を使用して女性を安楽死させるオープン腹部を切った。子宮の両側を引き出し、子犬が最初に注入したときのようにレイアウトします。
   1. すべての仔がそのようなトランスジェニックごみへのCreを注入する時と同じプラスミドを、受け取った場合には、胚の順序は、したがって、PBS中の女性と場違い子宮をカット、重要ではありません。
   2. 子犬が異なるプラスミドを注射した場合は、すべての死者子犬に注意して、それぞれの子犬を見つけてください、そしてコントロールとexperimenを注射されたものかを決定女性から子宮を取り出す前に、TALのプラスミド。子犬が子宮をPBS中にいるグループの後に所属を追跡するために注意してください。
3. 、個別に各子犬を削除する鋭いハサミやカミソリの刃で首を切る、PBSに頭を置く。トランスジェニックマウスの場合には、遺伝子型決定のための組織サンプルを収集し、そのような12ウェルプレートのように、個別の各ヘッドを維持する。
4. 解剖スコープの下では、頭蓋骨から脳を削除皮質ませニックに注意しながら、または正中線を引き裂く。蛍光顕微鏡を使用して、彼らが正常にエレクトロポレーションしたことを示す、脳がGFP +パッチを持っているかどうかを確認してください。
5. 4℃で一晩PFAに浸漬することにより脳を固定してください。
   注：PFAは、多くの場合、信号を消光するので、固定前にGFPを発現させるための頭脳を確認してください。
6. 凍結前に、少なくとも3日間、20％スクロース中に浸漬を通してCryoprotect脳。 10％、15％および20％のショ糖勾配（各溶液中で24時間）トンを使用O浸透圧に起因する組織損傷を防ぐ。 -80℃で凍結した脳を格納し、10〜14ミクロンの厚さの切片でクリオスタットでカット。

6.抗GFPとの同時染色

NOTE：抗原回復抗GFPと染色を共同するために必要である場合には、GFPシグナルを損なわない穏やかな抗原回復プロトコルを使用することが重要である。いくつかの抗原回復プロトコルは（さえGFPに対する抗体を用いて）GFP染色と組み合わせて使用​​するにはあまりにも過酷である。前の一次抗体の適用基本クエン酸前処理は、ほとんどのエピトープ²⁴成功した。

1. のddH ₂ O中のクエン酸の0.01 M溶液を作る較正されたpHメーターを用いてpH 6。
2. クエン酸になるまで電子レンジや水浴中でも染色チャンバ内の熱クエン酸75〜80℃に達する。 10〜15分間染色チャンバー内にスライドを入れてください。できるだけ安定した温度を維持する。
3. PBSにスライドを洗う室温で3分間3倍。一次抗体を適用し、標準プロトコルに従って免疫染色を進める。
4. （ 図3A）ノックダウンを確認するために、GFPのための同時標識と、目的の遺伝子によってCreを介在切除を検証します。

結果

胚の頭部におけるパドル電極の向きを変えることで、脳の異なる領域をエレクトロポレーションの標的にすることができます（Figure 2）。前脳のすべての部位において、プラスミドは側脳室に注入します（後脳を標的にする場合は第四脳室に注入します）。一般的に、2つの電極を結ぶ直線が目的の領域を通り、DNAが陽極に向かって引き寄せられるように電極を配置します。外側皮質を標的にする場合（Figure 2A）、陽極を緑色の三日月状の部分の上に、わずかに吻側へ角度をつけて配置します。内側皮質の場合（Figure 2B）は、向きを切り替えて陽極を対側の非注入側脳室の上に配置し、今回はさらに大きな前方角度をつけます。海馬を標的にする場合（Figure 2C）は、陽極を対側の上に配置しますが、代わりに陽極を尾側へ角度をつけます（エレクトロポレーションは、神経前駆細胞が海馬の最終的な位置に移動する前で、まだ皮質ヘムの一部である時期に行う必要があります）。神経節隆起を標的にする場合（Figure 2D

ディスカッション

子宮内エレクトロポレーションで行う際の主要な課題の二つは胚致死性および2）エレクトロ間の変動を減少させることを防止）1である。鈍い針が胚にダメージを与えるような致死性を防止する上で最も重要な要因の一つは、針の品質である。針を切断する場合、まだ足のパドル（図1J）のポンプ以下の表示される流体の0.1〜0.2μlと見える小滴を可能にしながら、できるだけ長く先端を保つ。針があまりにも鈍いですまたはシャフト短すぎる場合は、結果として組織の損傷は、胚を殺すことができる。針の先端が細かすぎる場合は逆に、十分なプラスミド量を注入するために時間がかかりすぎる。研究者の手の避けられない振動や胚のわずかな回転のために長すぎるの原因の損傷のための脳内に針を残す。さらに、若いに注射を可能にするために、鋭い、面取りヒント針を作るためにmicrobevelerを使用、より脆弱な胚、これは胚のE13.5及び高齢のために必要であってはならないが。

妊娠中の女性のストレスレベルは、胚の生存に影響を与える別の重要な要因である。ダムのストレスレベル...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ECM 830 矩形波エレクトロポレーター	BTX ハーバード装置	45-0052	エレクトロポレーターのみ – 別途ケーブルを購入 (45-0204)
1250FS ECM 830	BTX ハーバード装置	45-0211	ハンズフリー エレクトロポレーションにはフットパドルが必要です
Tweezertrodes	BTX ハーバード装置	45-0489 (5mm)        45-0488 (7mm)	プラチナ鉗子型電極
Femtojet	Eppendorf	920010504	マイクロインジェクター
グリップヘッド 0	Eppendorf	920007414	引っ張られた針を保持
ユニバーサルキャピラリーホルダー	Eppendorf	920007392	グリップヘッドをチューブに接続
インジェクションチューブ	Eppendorf	920007431	キャピラリーホルダーをFemtojetに接続
フットコントロール	エッペンドルフ	920005098	ハンズフリー注射用フットパドル
マイクロローダーのヒント	エッペンドルフ	930001007	引っ張られたキャピラリーチューブをロードするためのヒント
プラスミドメガキット	Qiagen	12181	5 QIAGEN-tip 2500、試薬、バッファー
ファストグリーン FCF	Sigma-Aldrich	F7252-5G	無毒染料
エクストラファインボンハサミ	ファインサイエンスツール	14084-08	針をトリミングするため
ボン斜視はさみ	ファインサイエンスツール	14084-09
グレーフ鉗子	ファインサイエンスツール	11050-10	ストレート
コリブリリトラクター	ファインサイエンスツール	17000-03
ホッチキス	ファインサイエンスツール	12031-07	7mmクリップ用
Castroviejoニードルホルダー	医療ツール	SNH-6737	ストレート、ロック付き
ニードルプー	ラーNarishige	PC-10	キャピラリーを引っ張るため
キャピラリー	ドラモンド	1-000-800	0.4mm内径ガラス毛細管

用フットスイッチ マイクロマイクロ