マウス骨髄からの破骨細胞の導出

Summary

破骨細胞は、体内の主要な骨吸収細胞である。大量に破骨細胞を単離する能力は、破骨細胞の生物学の理解における大きな進歩をもたらした。このプロトコルでは、培養し、インビトロで破骨細胞活性を定量化する、単離するための方法を記載する。

Abstract

破骨細胞は骨髄の単球/マクロファージ系統から誘導された高度に特殊化した細胞である。骨の有機および無機マトリックスの両方を再吸収する独自の能力は、それらが骨リモデリングの調節において重要な役割を果たしていることを意味する。一緒に、骨芽細胞および破骨細胞は骨吸収と健康と病気の間、正常な骨格を維持するために一緒に働く骨形成の両方を伴う動的結合プロセスに関与している。

体内の主要な骨吸収細胞としては、破骨細胞の分化または機能の変化は、体内で顕著な効果をもたらすことができる。改変された破骨細胞の機能に関連する疾患は、より一般的に過剰な破骨細胞骨吸収が形成を破砕するために罹りやすくする骨粗鬆症などの病態を観察することにより、造血のための骨髄空間を形成する失敗に致死性新生児疾患の重症度の範囲とすることができる。 ENT "> in vitroで高い数字で破骨細胞を単離する能力は、骨リモデリングサイクルを理解する上で大きな進歩を可能にしたこれらの疾患と闘う新たな治療戦略の発見のための道を開いてきた。

ここでは、隔離し、破骨細​​胞の多数が得られるマウス骨髄からの破骨細胞を育成するためのプロトコルを記述します。

Introduction

骨リモデリングは動的であり、骨吸収の¹骨形成のカップリングを含む。この緊密に調節されたプロセスは、通常の恒常性の間に、そして怪我や病気に応じて骨格を維持する責任がある。

破骨細胞は、骨の有機および無機マトリックスの両方を再吸収することができるユニークな多核細胞である。破骨細胞は、骨髄^2-5の単球/マクロファージ系統に由来するものである。破骨細胞の機能または形成の異常は、骨粗しょう症のような一般的な条件を含む臨床病理、さまざまな可能性があります。

in vitroで破骨細胞を生成する能力は、骨の生物学⁶の我々の理解における大きな進歩を可能にした。その結果、新たな治療薬は、かなりの罹患率および死亡率の原因である破骨細胞関連疾患を治療するために出現している⁷ まで。骨量および強度の恒常性維持は、骨形成骨芽細胞と骨吸収破骨細胞^8,9の協調行動が必要です。骨ホメオスタシス、骨質量および密度¹⁰の病原性の喪失をもたらす破骨細胞活性を増加させた閉経後骨粗鬆症を含む多くの疾患、変更される。ヒト疾患のトランスジェニックマウスモデルの利用の増加に伴い、人間の骨疾患^11-13における破骨細胞の役割を解読するためのより多くの機会がある。

Protocol

注：倫理声明：脊椎動物に関わるすべての研究は実験動物管理（APLAC）にスタンフォード紛争処理パネルにより承認に従ってプロトコルで実施した。

1.準備

1. （1.077グラム/ mlの密度に調整したポリスクロースおよびジアトリゾ酸ナトリウムを含んでいる）市販の密度勾配細胞分離培地10mlを50mlコニカルチューブにRTに来ることを可能にする。
2. フローサイトメトリー（FACS）は、1×リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、2％ウシ胎児血清（FCS）を用いて緩衝液を準備。の50mlアリコートを取り、密度勾配細胞分離培地工程の間に使用するために、RTで、このアリコートを維持する。
3. 単離手順の間に単離された組織や細胞を維持する準備ができた氷のバケツを持っている。

2.文化メディアを準備します

1. 基礎培地を準備します。MEM（最小必須培地）、フェノールレッド（500ミリリットル）、グルタミン酸（1×）、FCS（10倍）、10,000単位/ mlのpenicilliなしn個（1×）。
2. 0.22μmのフィルターで基本培地をフィルタリングします。
3. 骨髄マクロファージ誘導培地を準備します。
   1. ステップ2.1で調製した基礎培地の50ミリリットルを取る。
   2. 10 ^-7 Mの最終濃度....

Results

この方法の目的は、容易に、典型的には1週間で、in vitroで破骨細胞の多数を単離することであった。破骨細胞の多数の正常な分離は、酒石酸抵抗性酸性ホスファターゼ染色（ 図1A）を用いて確認した。大破骨細胞は、複数の核（通常は≥3核）を持つ大規模な紫色の細胞として可視化される。このプロトコルを使用して、破骨細胞あたり最大30核（ 図1B）で破骨細胞を単離することが一般的である。

鉱化表面を使用することで、in vitroで破骨細胞吸収活性を評価するゴールドの標準的な方法と考えられている。この方法では、鉱化表面の割合、または形成されている「再吸収ピット」を使用して破骨細胞骨吸収容量（ 図2）の決定を可能にする。

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Discussion

簡単にin vitroで破骨細胞の多数を隔離し、育成する能力は、骨の生物学および破骨細胞媒介性疾患の理解を進めるために支援を担当してきました。それが最近、破骨細胞の形成、分化および生存^16-18の主要な調節因子として同定されたときには、これにつながるRANKLの同定だった。

それは、骨髄からの破骨細胞のin vitro栽培は播種密度に大きく依存している私たちの経験をされています。我々は、骨髄由来の細胞をプレーティング時に破骨細胞を得るためのこのプロトコルの障害は、典型的には、次善の播種密度によるものであることを観察した。したがって、このプロトコルでは、24ウェルプレート当たり200,000細胞をシードすることをお勧めします。さらに、この技術では、最大の成功を達成するためには、上記のsでメディアを変更するように正確に破骨細胞誘導培地を準備することが推奨されるAME時間は毎日は、最初の3日後のいずれかの培養プレートを妨害する必要がないとき。これは破骨細胞誘導培地因子の一定濃度を可能にすることができる。さらに、我々は、特定の試薬の.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEM、グルタミン不使用、フェノールレッド不	Gibco	51200-038
M-CSF、組換えマウス	Gibco	PMC2044
Recombinant Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 (E. coli expressed)	R&D Systems	462-TEC-010
Prostaglandin E2	Sigma-Aldrich
Histopaque-1077	Sigma-Aldrich	10771
酸性ホスファターゼ、Lekocyte(TRAP)キット	Sigma-Aldrich	387A
オステオアッセイ骨吸収プレート、24ウェルプレート	Corning Life Sciences	3987