方法論記事

トラブルシューティングの方法と現代の定量的蛍光ウェスタンブロッティングへのガイド

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DOI：

10.3791/52099

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2014年11月20日

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1Division of Neurobiology, The Roslin Institute and Royal (Dick) School of Veterinary Studies, University of Edinburgh, 2Division of Developmental Biology, The Roslin Institute and Royal (Dick) School of Veterinary Studies, University of Edinburgh, 3Centre for Integrative Physiology, University of Edinburgh, 4Euan MacDonald Centre for Motor Neurone Disease Research, University of Edinburgh

この記事について

サマリー

蛍光を用いたウェスタンブロッティングの進歩により、タンパク質発現の微妙な変化の検出が可能になり、定量分析が可能になりました。ここでは、さまざまな種や組織タイプにわたるさまざまなタンパク質を検出するための堅牢な分析法について説明します。一般的な技術的問題を克服するための戦略も提供されます。

要約

1970年代後半には、ウェスタンブロット、存在感、複雑な生物学的サンプル中の特定のタンパク質の相対存在量を評価するための技術の最初公に報告された使用を見た。それ以来、ウエスタンブロッティング法は、分子生物学実験的レパートリーの共通成分となっています。用語「ウェスタンブロット」を使用してのPubMedのざっと検索が22万公表原稿を超えて重要な年2014年までにこの技術を利用してきたことを示唆して、最後の10年間は​​、開発と相まってテクニカルイメージングの進歩を見てきました感度を改善し、線形検出のより大きな範囲が得られている敏感な蛍光標識。その結果、生物学者はこれまで以上に高い感度と精度を比較発現解析を行うことを可能にするウェスタンブロット（QFWB）ベースの今、真に定量化蛍光である。多くの "最適化"ウェスタンブロッティング方法論が存在し、異なる研究室で利用されている。これらは、しばしば微妙ですが、文書化されていない手続きの改正の要件に実施することは困難証明する。このプロトコルは、トラブルシューティングの戦略と完全に確立され、堅牢なQFWB方法の包括的な説明を提供します。

概要

ウェスタンブロット（WB）は、本来、組織ホモジネート1として、複雑な生物学的サンプル中の目的のタンパク質の存在または非存在を決定するために、1970年代後半に開発された分析技術である。一般的に起因するキーの抗体 - 抗原相互作用のために、タンパク質イムノブロットと呼ばれる、方法論は、5つの別個のステップで構成されます。それらの等電点によるタンパク質の1）電気泳動分離。 2）ニトロセルロースまたはポリビニリデンジフルオリド（PVDF）膜への転移; 3）目的のタンパク質に特異的な一次抗体を用いて標識する。 4）一次抗体に対する二次抗体とのインキュベーション。 5）可視化。

可視化手法は、安全性および感度を改善するための時間と進化してきた。第WBsをのいくつかは、より多くの広く使用されている化学発光（ECL）法、次に比色とに進行放射標識タグを用いて行った。 Radioactivi比色およびECL方法論は、例えばアルカリホスファターゼまたはストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）2のような酵素レポーターとの間接標識技術を使用し、一方、tyが直接特定の抗原のためのプローブに標識した。色素原または発光生成物の標識化の強度は、強いまたは弱い信号強度は、サンプル中の目的のタンパク質の多かれ少なかれ存在を示すことにより、デンシトメトリーを用いて測定される。 ECLは、最初に、続いて3を設置し、より洗練されたデジタル画像化技術を用いてX線フィルム上で開発された、より敏感なので好ま方法2が、すべての3つの方法である。 WBのデジタル画像の進歩のみならず、興味のあるタンパク質の存在または非存在を決定するために研究を可能にしたが、他のサンプルと比較したとき、選択されたタンパク質の発現レベルの推定を可能にし、したがって、と呼ぶことができる「半定量的＆＃8221 ;.測定された蛍​​光のレベルを直接サンプル内の数量と単一のタンパク質の発現に関連させる最近、真に定量的かつより高感度のウェスタンブロッティング技術が開発された：定量（QFWB）ウェスタンブロッティング蛍光。

ECL標識とQFWBを比較した場合、蛍光二次抗体の使用は、線形検出プロファイル4を生成する。これは、信号の直線性は、一般に、遍在的に発現されるハウスキーピング遺伝子5,6と、すなわち 、直接タンパク質の発現に関連した5μgの信号飽和以下の低いタンパク質負荷で発生するECL技術とは対照的である。この格差は、最も可能性の高い潜在的な信号飽和の可能性が高く、その結果、ビオチン化二次的に結合するアビジンECL基質についての利用可能な結合部位より多くによって引き起こされる。これは、ONLと呼ばれているのECLベースイムノブロット法の主な理由の一つですyは「半定量的」7。信号の飽和点は、発現レベルの微妙な差を測定する際に非常に重要であると不正確な測定をもたらすことができる。近年、増え続ける感度と微妙な表情差の識別を詳述広範なプロテオミクス技術の出現は、検証実験8,9のために真に定量的なウェスタンブロッティング上で増え続けるの依存度をもたらした。 、敏感な堅牢かつ真に定量的な方法論の適用が故に重要である。

多くの "最適化"ウェスタンブロッティングの方法論は、頻繁に設定したり、原因の正式な文書化されたプロトコルでは明らかではないかもしれません微妙な方法論的な調整に複製することは困難証明する独立した研究所によって利用されてきた。これはQFWBための確立された堅牢なプロトコルであり、さらに一般的な問題のthaのトラブルシューティングに貴重な戦略を提供していますtは実装時に発生する可能性がある。

このプロトコルは、もともとマウス脳ホモジネートの使用に最適化されたが、その後、組織サンプルおよび種4,9,10の広い範囲にわたって効果的に使用されてきた。特定の問題のトラブルシューティングに必要な潜在的なプロトコルのバリエーションが含まれています。

プロトコル

このプロトコルは、ばらつきを低減し、一貫性を改善するために商業的に生産され、緩衝液、ゲル、転写スタックを使用して最適化されている。必要な消耗品の完全なリストについては、物質一覧を参照してください。

I-ブロット高速転送およびLI-CORオデッセイイメージングシステムを用いた蛍光WBプロトコル

サンプルの調製

  1. バッファ選択/作成
    1. サンプル均質化のための適切な抽出バッファーを選択し、バッファが採用されるすべてのダウンストリーム技術と互換性があることを確認。 RIPA緩衝液（25mMのトリス-HCl（pH7.6）中、150mMのNaCl、1％NP-40、1％デオキシコール酸ナトリウム、0.1％SDS）分離をサンプリングする前に、5％プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む：抽出緩衝液を準備する。
      NOTE：そこ抽出バッファのさまざまな種類が利用可能であり、細胞内の目的タンパク質の位置に応じて選択される。これらにはありませんRIPA緩衝液（全細胞、ミトコンドリアおよび核成分）、NP-40溶解緩衝液（全細胞または膜結合）、およびトリス - トリトンに制限（細胞質バウンド骨格）。しかし、抽出緩衝液中でいくつかの化学洗浄剤可溶化、あるいはタンパク質を失活するのに役立ち得るが、特定のタンパク質測定アッセイを使用した場合、タンパク質定量を妨害し得る、 すなわち、ビシンコニン酸（BCA）アッセイ。アッセイと化学的適合性に関するメーカーのガイドラインを確認してください。
  2. タンパク質抽出/可溶化
    1. 手動まで調製し、抽出緩衝液中のポリプロピレンチップでダウンスまたは手持ち式ホモジナイザーで約1：10重量/体積（組織重量/バッファ量）のいずれかを使用して均質化し、続いてハサミ、および/または外科用メスを用いて組織サンプルを浸軟スムーズ/一貫性のホモジネートが生成される。
      注：小さい、貴重な/難しいサンプルを得るためには、洗剤ベースの抽出CA5：nはまだ1まで効果がある。
    2. 4℃で20分間20,000×gで、遠心分離機のサンプルを均質化を掲示。可溶化されたタンパク質を含む上清を除去し、必要になるまで-80℃で保存してください。後で必要に応じて、さらにより厳しい抽出を可能にするために、不溶性のペレットを保持している。タンパク質判定ステップ1.3に進みます。
  3. タンパク質定量
    1. BCA、ブラッドフォードまたは同様のアッセイのいずれかを使用して抽出された各サンプル内のタンパク質の濃度を測定する。標準曲線を計算する場合、判定比、R二乗値の係数は、サンプル15内のタンパク質の存在量の最も正確な決定を反映している150以上であることを保証する。
      注：QFWBによって比較されているすべてのサンプルは、同じ標準曲線に対してアッセイしなければなりません。
  4. サンプルの調製
    1. 計画し、2つの同一gのためのはしごやサンプルのロード順序を記録ELS：ローディングコントロールとして転送し、ゲル2用ゲル1。貧しいまたは明確な移転で発生する可能性の偏りを避けるために、順次制御及び「治療」のサンプルをロードします。
    2. 各サンプルに必要なタンパク質の量を計算する。神経細胞の分離株中のタンパク質を検出するための標準的なタンパク質負荷が15μgのです。をdH 2 Oで10μlのボリュームに各サンプルを作る2分間98℃でローディングバッファー、渦と熱の5μlを添加する。
    3. そのような関心の正しいバンドの識別を支援するための組換えタンパク質として陽性対照試料が含まれています。しかし間違ったバンドの選択を回避するために、製造元のガイドラインに従って正しく陽性対照試料を準備します。 図1を参照してください。

figure-protocol-1
図1. Positive制御選択。実験のポジティブコントロールの追加は、検出された標識が本物であることを確認。ただし、注意があなたのコントロールは前実験サンプルを使用して正しく動作しているように注意する必要があります。A）融合タンパク質TREM 2は1μgの/ mlのメーカーのガイドラインにロードされたが、データシートで110 kDaの競合で観察標識は、分子の予測60-70 kDaの。B）還元剤と添加およびインキュベーション後の重量は、融合タンパク質の標識化は、予想される分子量で検出された。しかし、これは、還元プロセスは、タンパク質のシグナルの減少として、より大きなタンパク質の負荷が必要とされた意味する。

タンパク質の電気泳動2.分離

  1. 4~12％ビス/トリスゲル（1.0 mm）での調製
    NOTE：勾配ゲルは、広い分子量範囲にわたってより大きなタンパク質の分離を生成するために使用される。
    1. MESを選択し、準備するをdH 2 Oで希釈することにより、バッファ（タンクあたり1 L）を実行しているか、MOPS MOPSランニングバッファーは、200 kDaの上記高分子量のタンパク質を検出することが好ましいのに対し、MES緩衝液は3.5から160 kDaのタンパク質内の良好な分解能を生成するが15kDaの下の低分子量蛋白質の劣る解像度を有することになる。
    2. ゲルの足をカバーコームとテープのストリップを削除します。静かに1ミリリットルピペットを用いてランニング緩衝液でウェルを洗い流す。ランニング緩衝液でウェルを満たし、気泡がゲル中に残っていないことを確認してください。
  2. ゲル調製及びローディング
    1. タンクにゲルを挿入して、全てのシールが効果的に働いていることを確認するためのバッファを実行しているとの間のゲルコンパートメントを埋める。
    2. その後のウェルにゲル1及びゲル2負荷の最初のウェルに10μlの各サンプルを分子量標準の3を添加する。
      注：はしごを除き、ゲル1＆ゲル2は同一でなければなりません。それが不可欠番目ですオデッセイイメージャ700チャンネルで見えるようにするために、全タンパク質染色を使用した場合のゲル2に使用される事前に染色された分子量標準で青色と見える。
    3. 両方のゲルがロードされたら、残りのランニングバッファーでタンクを満たし、ふたを固定します。
  3. 電気泳動
    1. 「ファイル名を指定して実行 "で4分間80 Vでのゲルのサンプルを確保するためには、均一な形でのポリアクリルアミドゲルマトリックスに入る。その後、それぞれまたはサンプル色素がゲルのふもとに見ることができるようになるまで、50分間180 Vまで電圧と時間を増やす。
      注：より高い電圧は、短い実行時間を達成するために適用することができる。しかし、これはゲルの中央サンプルが速く、温度14の増加による外レーン試料よりも実行する「スマイリー」ゲルを生じ得る。

ローディング対照ゲル3.全タンパク質染色

  1. 使用したカセットからリリースゲル2ゲルナイフ。井戸やゲルの足を外します。マークの向きを補助するためのゲル。
  2. 正方形のペトリ皿（おおよそのサイズ12×12センチ）にタンパク質染色の約30ミリリットルをデカント。解を確実にタンパク質染色に置きゲル2は、ゲル全体をカバーし、染色し、室温で1時間の最低ゲルを攪拌する。
  3. タンパク質染色をデカントし、前の可視化に蒸留水にゲル3回洗う。可視化するために6.3に進みます。

4. I-ブロットセミドライ高速タンパク質転送

注：I-ブロット機を用いて、タンパク質転送に必要な全ての試薬は、特に、I-ブロット法のために設計された市販製品であり、物質一覧に記載されています。

  1. 「下」転写スタックを準備します。ゲルタンクから直接ランニング緩衝液でホイルカバーを取り外し、プリウェット。蒸留水で予め湿らろ紙。
  2. 手順を繰り返し3.1と場所ゲル1へ準備された「ボトム」転写スタック。
  3. ゲル上のプリウェットろ紙を置きます。気泡が層の間に閉じ込められていないことを確認するためにろ紙、ゲルをロール。
  4. トップ転写スタックから箔の蓋を外し、ろ紙とボトムスタックの一番上にある一番上のスタックを置く。気泡を除去するために転写スタック「サンドイッチ」を振る。
  5. I-ブロットマシンの蓋の上に転写スタックキットからスポンジを挿入します。その後開閉蓋しっかりとI-ブロットマシン上の専用空間に転写スタックサンドイッチを置きます。 I-ブロットを起動し、プログラム3で8.5分間移す。
  6. 低タンパク質シグナルや凹凸高がある場合：低分子量タンパク質比は、半乾式「高速」転送方法を使用する場合、製造業者の転送時間をテストする。 図2に示すような理想的な転写電圧/時間の組み合わせを決定するために、同一の負荷のサンプルの反復を使用して簡単な最適化プロトコルを実行 。

figure-protocol-2
図2. I-ブロット。Aを用いた転送 ）はしごを搭載し、単一のゲルの最適化と3タンデムリピートにおけるマウス全脳ホモジネートの15μgの3つのセクションに切断した。一つのセクションは、転送されていなかったものが、（パーメーカーの指針として）7.5分間移し、8.5分間1。ゲル切片を、その後680チャネル、赤外線イメージャーでスキャンして定量した。B）各ゲルの残留タンパク質含有量の差を示す定量値のグラフィカルな表現が0、7.5、8.5分以下の、インスタントブルータンパク質染色で染色した移転の。転送時間の追加分は、約45パーセントの追加のタンパク質が移動しましたことに注意してください。e.com/files/ftp_upload/52099/52099fig2large.jpg "ターゲット=" _ブランク」>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

タンパク質の5。抗体の検出

  1. 膜調製物およびブロッキング
    1. I-ブロットマシンから転写スタックを削除します。底部搬送スタック上にゲルをさらす上部とろ紙層を除去する。
    2. メスでゲルの周りにカットし、オリエンテーションの目的のために三角カットが膜上に表現されていることを確認。膜トリミングの後、タンパク質は、転写効率を確認し、および/または破棄するゲルを染色する。
    3. 迅速1X 5mlのPBSを含むクリーン50mlチューブ（または同等のレセプタクル）にメンブレンを移動し、一定の撹拌のための機械ローラー（または軌道プラットフォーム）の上に置きます。
      注：メンブレンが出て乾燥させていないことが重要です。セミドライ転送中に膜が高温になります。このように転写スタックを開く前に、2分待って、私はできるようになりますスタック解体中に冷却し、ゆっくりと乾燥時間Tから。洗浄およびインキュベーション中の撹拌のためのローラーチューブの使用は、必要な溶液の量の大幅な低減を可能にする。
    4. 1×PBSにおける膜3×5分洗浄する。 1×PBSを廃棄し、室温で最低30分間​​非希釈ブロッキング緩衝液で膜をブロックする。
  2. 一次抗体製剤。
    1. 0.1％Tween20でブロッキング緩衝液5ml中、製造元のガイドラインに従って一次抗体を準備します。一定に撹拌しながら4℃で一晩準備一次抗体とメンブレンをインキュベートする。
      注：バッファをブロックすると、一般的に希釈せずに使用されますが、1まで希釈することができる：一次抗体が十分に高い特異性を持っている場合、PBSで4。
    2. 一次抗体を捨て、1×PBSで5分間ずつ膜を6回洗う。
  3. 二次抗体選択＆準備
    1. セコ用ndaryだけ上記のステップ5.2.1と5.2.2を省略して、サンプル特異的な二次バンドパターンを決定するために、5.3に進み、制御目的のためにアセスメントを標識化する。 図3を参照してください。

figure-protocol-3
二次抗体の図3.最適化。A）ネズミ15μgの（M）に対する二次のみ非特異的な標識の多種の比較は、ヒツジ（O）と蛍光の様々な馬の（E）神経組織ホモジネートは、二次抗体をタグ付け。 Lは、分子量ラダーである。ヒツジ組織ホモジネートは、ロバ抗ヤギ800抗体を使用する場合に二次標識と交差反応する唯一の試料であった。B）それが別の組織サンプルを使用する場合、非特異的標識化が発生したかどうかを確認することも重要である、 すなわち 、マウス腓腹筋（15 _6; gの負荷）。このサンプルクロスマウス脳ホモジネートを使用した場合が、これは発生しなかった、ロバ抗マウス680二次抗体と反応する。

  1. 蛍光が0.1％Tween20でブロッキング緩衝液中濃度を推奨されるメーカー以下の二次抗体680または800（赤または緑チャネル）をタグ付け準備します。一定に撹拌しながら室温で90分間調製した二次抗体と共に暗所で膜をインキュベートする。
  2. 二次抗体を捨て、1×PBSで洗浄あたり5分間、膜を6回洗う。可視化 - 6に進みます。
    1. マーカーの可視化は、適切な追加のステップとして二次抗体の範囲と予想される、試験はしごとして機能していない場合。すべてではない二次抗体が市販されているすべてのはしご内のすべてのマーカーバンドの可視化を可能にする。
    2. 期待のバンドが表示されていない場合、 すなわち 、代替セカンダリホストを使用し、ドンクヤギ抗ウサギ対EY抗ウサギは適切なプロトコルの変更を表します。 図4を参照してください。二次抗体を調達するために用いられる宿主種は時折起因する特異的な一次抗体のための特異性の欠如に可視化の問題を引き起こす可能性があります。

figure-protocol-4
骨、脂肪、筋肉、肝臓および- - ERK一次抗体と共にインキュベートし、三つの異なる二次抗体と共にインキュベートし、図4のトラブル二次抗体の特異性組織サンプルの範囲のウェスタンブロット（レーン当たり15μgのタンパク質）。上部パネル：LI-CORヤギ抗ウサギ680二次抗体で標識されたWBが脂肪と骨の弱いラベリングを生産しない信号が肝臓および筋肉試料では検出されなかった。中央のパネル：メンブレン（上のパネルから）を剥奪されたとのrepr二次リンクECL方法論とヤギ抗ウサギHRPを使用してオベデ。バンドは、筋肉や肝臓のサンプルで表示可能になり、ラベリングは脂肪と骨のサンプルにおいてより強い表示されます。底板：膜（上部と中央のパネルから）が剥離し、LI-CORドンキーERK一次抗体に対してより高い親和性を示している抗ウサギ680二次抗体を用いて再プローブした。筋肉や肝臓のためのラベリングは脂肪や骨試料の両方から増加した信号強度で表示されるようになりました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

6.可視化

注：すべての画像は、LI-CORオデッセイクラシックイメージャと関連するイメージProの分析ソフトウェア（バージョン3.1.4）を使用して取得される。

  1. 電源を入れて、コンピュータとイメージャにログオンします。イメージングソフトウェアを開き、新しいファイルを作成します。 図5を参照してください。


ウェスタンブロットの図5.可視化と定量化。ネズミ腓腹筋（30μgの負荷）を示すウエスタンブロットのスキャンがアネキシンV一次抗体（36 kDa）のヤギ抗ウサギ800二次抗体でプローブした。この膜を800チャンネルでスキャンし、可視化した。タンパク質（アネキシンV）を定量化するために、長方形のボックスはこれは、同じ面積の測定を確実にするために、残りのサンプルのレーンの上にコピーされ、貼り付けられた試料1から目的のバンドを中心に描かれている。背景は自動的に描画図形の周りを占めているが、これは正確に定義されているバックグラウンド測定を確実にするために変更することができる。下の表は、減算背景を持つ背景や信号、得られた全信号を含む描かれた各形状の定量化された測定値を表示します。この情報は、その後にエクスポートすることができますスプレッドシートプログラムは（相対蛍光強度によって決定される）発現比を計算し、その後の統計分析を行うことができるようになります。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
  1. イメージャの蓋を開きます。左下隅にガラス上に1×PBSを少量を注ぎ、その後、PBSの上に膜を置く。膜は、膜とグリッド軸の間に残されているイメージャ上の軸と1cmのギャップの正方形であることを確認してください。
    1. 気泡がガラスと膜との間に閉じ込められていないことを確認するために膜をロール。
    2. 膜は、x軸とy軸上で占める正方形の数を数える。イメージャの蓋を閉じます。膜はコンピュータ·ソフトウェア上で占める正方形の数を入力します。
    3. 蛍光タグに依存した膜をスキャンするために適切なチャネルを選択します二次抗体、 すなわち、700チャンネルまたは680または800の蛍光タグ付き抗体がそれぞれ使用されてきた800チャンネル。二重標識を行う場合には、両方のチャネルをスキャン。
      注：前に二重標識を行う単一タンパク質標識を最適化します。
    4. 高豊富タンパク質が低強度スキャンを使用する場合、膜をスキャンするために、強度を選択します。一次抗体は、目的のタンパク質がより高い強度スキャンを選択するための貧弱な親和性を有している場合には別の方法として、 すなわち、レベル5を押して、スキャンを開始するために開始します。 6.4に進みます。
  2. ローディング対照ゲルの視覚化（ 図6）。
    figure-protocol-5
    図6.レーンあたり馬子宮頸神経節ホモジネート20μgのを含む総タンパク質の標識ゲルの全タンパク質標識および分析。A）の写真。パネルAからB）ゲル680チャンネルでスキャン全タンパク質染色ゲルから定量化された測定値。C）のグラフは、イメージングソフトウェアを使用して得られる。分子量マーカーによって決定される測定値の範囲、 すなわち、30〜110 kDaのは、標準誤差を保証するために測定値のヒストグラムを提供するために取られる（SEM）は、各サンプル中の総タンパク質濃度が均一であることを示している（グループ化されたサンプルの）低いゲル全体に。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
    1. フォローは6.1と6.2を繰り返します。
    2. グリッド軸が始まるイメージャの底の隅にガラス上に蒸留水を注ぐ。
    3. 水の上にゲルを置き、レーンはxまたはグリッドのY軸のいずれかに垂直であるので、操縦する。グリッドのyとx軸とゲルの間に1cmの隙間を残して、ゲルは、グリッド軸上で占める正方形の数を数える。クローズイメージャの蓋。
    4. ゲルはコンピュータ·ソフトウェア上で占める正方形の数を入力します。
    5. 総タンパク質染色ゲルをスキャンする700チャンネルを選択します。
      注：ブルー700チャンネルで蛍光を発する。
    6. 5を押してスタートに強度を設定してください。
  3. スキャンした画像の定量
    1. 最高の画質を生成するために明るさとコントラストボタンを調節してください。高いバックグラウンドノイズがあるように表示された場合は、より低い強度で膜を再スキャンし、高品質なスキャン設定を使用します。
      注：任意の調整がスキャンするときに取得蛍光データが変更されることはありません。
    2. 取得したデータへの無改変で所望の向きに表示するために、画像を90°、180°、270°回転させます。 「自由回転」で向きの微調整を行う場合しかし、より大きい3度、ピクシレーション値で取得したデータは歪むので、定量結果に影響を与えることができる。
    3. ほとんどの場合、長方形を使用する - - 図形メニューから形状を選択し、サンプルレーン1で目的のバンド（WB）または全体のレーン（総タンパク質ゲル）を中心に描く。
    4. コピーとサンプルレーン2目的のバンドまたは全体の車線にまたがった形状を貼り付けます。全てのサンプルのための目的のそれぞれの個々のバンドおよび総タンパク質ゲルのための各レーンを横切って繰り返します。
    5. バックグラウンド測定は、次のレーンに信号が組み込まれていないことを確認してください。背景はソフトウェアによって自動的に差し引かと描かれた、またはそれが図形の上/下または左と右のように指定することができる形状の周りにエッジ全体を包含することができます。代わりに、ユーザ定義の背景ボックスを指定する。
    6. 任意の蛍光単位で描かれた各形状のためのシェイプテーブルのための信号を表示します。背景は自動的に信号から差し引かれます。
    7. 異なるソフトウェアで表示するTIFファイルとして画像をエクスポートします。画像をエクスポートし、USIを操作しないでくださいこのようngの非画像proソフトウェアは、偽データを生成する撮像装置によって取得された元のデータが変更されます。
    8. 手順を繰り返します6.4.3-6.4.7二重標識を定量化または標準エラーデータを生成し、照合するローディングコントロールゲルで複数の測定を行う場合。

7.ポストの可視化

  1. 1×PBS中の膜を維持するか、将来の再プロービングや関心のある他のタンパク質のための膜の剥離のための長期保存のために完全に乾く。
  2. ストリッピング、膜の再プロービング。 図7を参照してください。
    figure-protocol-6
    図7.メンブレンのストリッピングとリプロービング。赤外イメージングシステムでスキャンし、各種のストリッピング手順以下の膜の代表的な例。A。最初の免疫は、CSP一次抗体（ウサギ）を用いて実施し、7でスキャンした00チャンネル。B。最初のリッピングおよび800チャネルとROCK2（ウサギ）で再プローブ。オレンジ色の矢印は、ストリップと再プローブした後に存在する残りのCSPの一次抗体を示している。バンドは、より高い分子量（白矢印）。Cに存在するので、これはROCK2の測定に影響を与えません。第二のストリッピングおよびβスペクトリン抗体（ヤギ）で再プローブし、800チャンネルで可視化した。Dは 。第三のリッピングおよびαシヌクレイン抗体（ウサギ）。Eで再プローブ。第四のリッピングおよび800チャンネルを持つユビキチン抗体（マウス）を用いて再プローブ。最後の抗体（αシヌクレイン。オレンジの矢印）。Fからの残りの信号が依然として存在する。フィフスリッピングおよび700チャンネルで撮像されCALB2抗体（ウサギ）で再プローブ。使用される二次抗体は以下の通りであった：ヤギ抗マウス800CWヤギ抗ウサギ680rd、ヤギ抗ウサギ800CW、ロバ抗ヤギ800CW（物質一覧を参照）。レーンラベル：L - はしご、1/260; -サンプル1/2。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
    1. Revitablotストリッピング緩衝液を約30 mlで含有し、一定に撹拌しながら室温で5-20分の間インキュベートする正方形ペトリ皿内の場所膜（複数可）。
    2. PBS中で3回、その後、蛍光の完全な除去が発生していることを確認するためにイメージャに再スキャン（S）膜を洗う - このステップは、すべてのストリップ後に繰り返されるべきである。
    3. 蛍光が残っている場合、より長い期間にわたって膜（複数可）をインキュベートする。残りの二次信号がないことを確認するために、各ストリップ後に膜を再スキャンします。
      NOTE：膜（複数可）のみを剥離し、膜の完全性比を通知するために、望ましくない高いバックグラウンドをもたらす危険にさらされていないことを保証するために、3回まで再プローブされるべきである。

結果

QFWB感度および検出の直線範囲は、従来のECL検出よりも大きいように、実効的な解釈を助ける正確なデータが収集されることを保証するために重要である制御手段の数は、存在する。まず、ポジティブ対照試料を含めることは、 図1に示すように第二に、転送の最適化は、膜にゲルから高および低分子量タンパク質の同等の動作を保証するために、図2に示したように、第三に、抗体の最適化は、特に、二次その最適化はしばしば見落とされているが、抗体は、関心対象のタンパク質の正しい解釈を妨害することができるバンディング非特異的生成することができる。 図3を参照してください。第四に、それはまた、タンパク質が検出不能に見えるが存在することが予想される場合、これは単に二RAISを用いて補正することができる二次抗体の問題であってもよい場合もある異なる種の宿主中で編図4を参照してください。第五に、総タンパク質標識および分析は、遍在内部参照標準3のために表されている伝統的な単一のタンパク質（群）の使用と比較してはるかに堅牢かつ定量化可能な方法である。これらの単一のタンパク質の多くは、示差的に神経変性疾患のモデルとの間、異なる組織サンプルにおいて発現されることが見出されており、発現の均一性は、同じ組織3内に変更することができる。標準誤差を示すために比較し、各サンプルに対して測定し、種々の分子量の範囲において、各レーンにおけるタンパク質負荷を定量化することによって、総タンパク質分析と組み合わされた場合、図6に示されているように、したがって、ローディング対照ゲルの製造は、サンプル負荷の均一性を確認する。重要なことに、これらのトラブルシューティングの手法とコントロールの全てが分析さtの感度および一貫性のみに有効であるオペレータ（ 図5）によって適用ools。最後に、この技術は、ストリッピング及び要因を含むが、長期貯蔵条件下での感受性の増大、減少、背景、デュアルカラー検出および膜安定性に限定されずにECLよりも柔軟性を有する膜の再プロービングに向いている。 図7を参照してください。

ディスカッション

配慮と計画は、あらゆる実験に先立って不可欠であり、最終的に使用されるテクニックの成功を決定することができます。使用するために適切な抗体、転送および可視化方法を選択しようとすると、WBを使用したタンパク質検出の進歩は、潜在的な障害ブロックの過多を提示することができます。幸いなことに、タンパク質の存在とサンプル間ますます微妙な発現差を決定するために日常的に使用することができるQFWB注意深くチェックし、適切な対策を使用する。このプロトコルは、回避し、および/またはそれに関連する多くの一般的な落とし穴のいくつかを克服するために、蛍光定量的ウェスタンブロッティングと同様に、いくつかのトラブルシューティングの戦略の包括的なガイドを提供します。

感度を維持し、真の定量化と比較可能な測定値を得るために用いられる重要なステップは次のとおり組織サンプルから1）堅牢なタンパク質抽出する。 2）試料調製。 3）正確なタンパク質Loadinのgの全タンパク質分析によって決定。 4）I-ブロットを使用して、タンパク質の最適な転送を、赤外線イメージャと関連ソフトウェアを使用して、0.1％のTween20を含むブロッキング緩衝液中で一次および二次抗体の5）準備、および6）が正しいの可視化と分析。

赤外蛍光検出本当に定量的であり、より伝統的なECL検出技術3,11に比べてより高い感度を提供する。この検出システムは、多面的であり、そのようなものとしてQFWBに限定されるものではない。このシステムは、全体の組織切片12の可視化および定量化を可能にする、低電力での免疫組織学的標識イメージングが可能である。これは定量的評価の点で従来の顕微鏡では、従来の免疫蛍光の取り込みに匹敵する遠赤色イメージングを見ることができ、解像度の点で潜在的な将来の発展の一つの領域である。

しかし、Pの微妙な変化に対してより大きな感度を有するそれは可変性を確保するために重要であるrotein式が最小に維持され、制御措置が強固なプロトコルに厳しい。検出は実数および転送する点で、製造業者のガイドラインをテストする場合、これは決定するために、サンプル負荷が均一であることの保証、一次および二次抗体の最適化を提供するために全タンパク質染色ゲルの生成に続いて、組織サンプルからの厳密なタンパク質の抽出から始まる時間効率的なタンパク質伝達を得る。

それにもかかわらず、WBのための条件が最適化されている場合でも、まだ問題は完全にここで検討されていない可能性が西部劇を実行しているとそこに関連することがあります。これらには、タンパク質の可溶化および抽出緩衝液の選択などの要因に限定されるものではない。いくつかのバッファは、タンパク質濃度アッセイに干渉する可能性があり、いくつかの組織は、このような自動化されたmaceraの使用などのより堅牢な技術を必要とする、可溶化することが特に困難であるティンは、マックの解離とともに、Mチューブなどの容器を密封した。加えて、-80℃で抽出し、抽出されない材料の保存のための簡単​​な対策は直ちに抽出した後、最適な標識を取得し、悪い結果を週後の差を有することができる。

現代のQFWBの方法は、タンパク質発現の微妙な違いをキャプチャするためのより高感度であることが証明されており、そのようなECLなどの従来の技術と比較すると、より汎用性の同時二重標識3を許可している。これは、ウェスタンブロッティングプロトコルは、堅牢かつ正確な定量、統計分析のために容易に再現可能であることが不可欠です。このプロトコルは、高感度で、異なる組織サンプルおよび種3、様々横切っタンパク質の検出のために日常的に使用されるのに十分に堅牢であり、同じQFWB内の低および高存在量タンパク質の定量化を可能にする、従って消耗使用量を削減するだけでなく、実験の1時間あたりの1また、この技術の感度の増大は、ますます人気の検証ができます- 。OMICの研究9,14をただし精度が重要であり、適切な管理措置を含めることは、それによって誤ったデータ収集を回避するために付着されなければならない。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

私たちは、財政支援のために、次の感謝したいと思います：BBSRC研究所戦略計画の資金調達 - CF＆TMW。 BBSRC東バイオDTP資金 - LG。エジンバラのダーウィン·トラスト - MLH。我々はまた、この原稿にTREM2最適化を含めるための許可を博士バリーMcCollに感謝したいと思います。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
RIPAバッファー、フィッシャーサイエンティフィックUKリミテッド10230544
Mチューブミルテニーバイオテック株式会社130-093-236
iBlot Transfer Stack, PVDF RegularLife Technologies, UKIB401001
MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa)Life Technologies, UKLC5602ウェスタンブロッティング用ゲル1での使用
SeeBlue Pre-stained protein standardLife Technologies, UKLC5625 ゲル2で使用 総タンパク質染色ゲル
NuPAge LDS サンプルバッファー 4xLife Technologies, UKNP0007
NuPAGE MES SDS Running buffer (for Bis-Tris Gels only) (20x)Life Technologies, UKNP0002
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 wellLife Technologies, UKNP0322BOX
Phosphate buffered saline tabletSigma-Aldrich, UKP4417-100TAB
Micro BCA,タンパク質アッセイキットFisher Scientific UK Ltd10249133
Odyssey blocking bufferLi-Cor BiosciencesP/N 927-40000
IRDye 680RD ヤギ抗ウサギIgG (H+L), 0.5 mgLi-Cor Biosciences926-68071
IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg Li-Cor Biosciences926-68072
IRDye 800CW ヤギ抗ウサギIgG (H + L)、0.5 mgLi-Cor Biosciences926-32211
IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L)、0.5 mgLi-Cor Biosciences926-32214
ODYSSEY CL 赤外線イメージャーLi-Cor Biosciences見積り募集
iBlot 7-Minute Blotting SystemLife technologies, UKこのモデルは現在生産されていません
InstantBlue Protein stainExpedeon, UKISB1L
Revitablot western blot stripping buffer ロックランド・イムノケミカルズ・インクMB-085-0050

参考文献

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