回腸切除術は、いくつかのヒトの疾患で一般的に行われていますが、腸切除術が外科的疾患に与える影響についてはほとんど知られていません。この記事では、マウスで手順を高い成功を収めて実行するための手順を説明し、疾患のモデルにおける回結腸切除の効果を研究する手段を提供します。
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この記事について
サマリー
要約
腸切除は、クローン病と結腸癌の2つの一般的な例で、消化管が関与する疾患の治療に頻繁に必要とされます。これらの処置の頻度にもかかわらず、宿主の生理学および疾患の病態生理学に対する腸切除の固有の影響を説明する際には、大きな知識のギャップが残っています。この記事では、マウスの一次端部吻合を伴う回腸切除術の詳細な手順と、術後の成功を最大化するための周術期ケアの重要な側面について説明します。 この手順を綿密に実行すると、95% の長期生存率が得られ、成長の失敗はなく、腸閉塞や吻合部漏出の術後合併症が最小限に抑えられます。マウスでこの手順を実行する際の技術的な課題は、研究での広範な使用に対する障壁となっています。この記事で説明されているスキルは、以前の外科手術の経験がなくても習得できます。習得すると、マウス回腸切除術は、ヒト疾患のモデルにおける腸切除の影響を研究するための再現可能なツールを提供します。
概要
回腸切除術(ICR)は、さまざまな病気に対して緊急および選択的の両方の状況で行われる一般的な手順です。クローン病と結腸がんは、ICRの2つの最も一般的な適応症です。どちらの病気でも、手術部位の腸の再発は主要な臨床的問題を表しています。結腸がんの局所再発率は、最も積極的な切除でも依然として問題です1。クローン病におけるICRの後、この疾患は最も頻繁に(最大80%)手術後1年で新末端回腸に再発します2。これら2つの疾患の影響と手術後の再発を考えると、ICR後の局所的な腸因子を理解することが重要です。これは、これらの疾患の自然史に内在的な影響を与える可能性があります。さらに、ICR後の吻合治癒を考慮することも重要です。術後早期に、吻合部の漏出は患者に壊滅的な結果をもたらし、その結果、手術の繰り返し、ストーマの作成、重大な罹患率、さらには死亡率につながる可能性があります3。このトピックの重要性にもかかわらず、吻合治癒に関する私たちの現在の理解は、研究対象としてはまだ初期段階にあります。ICRの動物モデル、特にマウスは、手術後の腸および吻合部の治癒を研究するための優れたプラットフォームです。
ICRのマウスモデルは、当初、ヘルムラートらによって短腸症候群4のモデルとして使用するために開発されました。著者たちは、ICR後の動物の生存を最適化するために、さまざまな食事療法と縫合糸のサイズを実験した。彼らは、周術期に流動食を摂食し、9-0モノフィラメント縫合糸を使用した結果、88%の最適な術後生存率が得られると結論付けました。この最初の発表以来、小腸の50%を切除したマウスのICRは、短腸症候群の新たな治療法を開発する試みとして、大規模な小腸切除の動態と適応成長反応を調査するためにいくつかの研究で使用されてきました5,6。
>jove_content<クローン病に対するICRマウスモデルの最初の適用は、IL-10-/-マウスモデルを使用しました。これは自然に大腸炎を発症します7。その結果、ICR後、これらの動物は術後のクローン病患者に見られるのと同様の炎症を新末端回腸に発症し、この炎症は細菌の存在に依存していることが明らかになった7。最近では、このモデルを使用して、ICRによって誘発される細菌の変化を調査しました。クローン病では、抗炎症特性を持つことが知られている細菌の相対的な減少と細菌の侵入種の増加を伴う関連した腸内細菌叢症があります8,9。この関連性は、術後再発の場合にも当てはまります10。2件の研究では、ICRに起因する微生物の変化を特定しようとしました。最初に、IL-10ヌルマウスを使用し、変性ゲル電気泳動を行って、ICR11後の小腸と結腸の間の細菌の類似性を比較しました。この研究は、ICR後の小腸と結腸の細菌集団が類似していることを示しました。その後の研究では、野生型マウスと 16s パイロシークエンシングを使用して、術後の細菌種の系統分類を行いました。この研究では、手術のみに起因する細菌種の顕著な変化が示され、クロストリジウム種が優勢になり、Υ-プロテオバクテリアが増加しました。また、この結果は、ICR12後の小腸と結腸に同様の集団が見つかった以前の研究の結果も確認しました。ICRは、盲腸および上行結腸が関与する結腸癌の患者によく見られる手順であり、手術に対する宿主の反応が局所および遠隔腫瘍の再発に寄与する可能性が高いことがますます認識されつつあります13。この観察にもかかわらず、ICRのモデルは、結腸直腸癌および術後再発の研究には利用されていません。ICRに起因する全身および局所の免疫学的変化を理解することは、将来の治療法を研究する上で重要です。ICR後のがん再発に関与する可能性のある経路には、細胞をアポトーシスから救い、増殖を刺激する可能性のある成長因子のアップレギュレーション、細胞排出による機械的腫瘍破壊、および術後の免疫抑制による免疫サーベイランスの喪失が含まれます13,14。
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プロトコル
動物使用プロトコルはアルバータ大学の健康科学動物管理使用委員会によって承認された。
楽器、動物および手術のセットアップの調製
- 手続きの前に、すべての固形食24 hrの新しい、クリーンなケージ不在に動物を転送します。彼らは、手続きの時間になるまで水に自由にアクセスし、液体ダイエットアドリブを持っている場合があります。
- 手続きに必要なすべての楽器をオートクレーブ。クリーン操作面、70％エタノールで麻酔ノーズコーン。
- 執刀医のための快適な方法で手術用顕微鏡、麻酔器や電源で操作面を設定します。外科医の肘、手と用具を遮るもののない腕で、手術台の上で快適休ませなければならない。楽器、縫合糸、綿棒、および10ミリリットルの注射器は、手順の間に簡単にアクセスを許可した場所に配置する必要があります。
- セットアップオーバーヘッド加熱ランプは、操作面の手順と光の間の動物のための暖かさの両方を提供する。
- 0.9％食塩水で50ml円錐管、および操作面の近くにワセリンと場所との1.5mlチューブを埋める。
注：すべての楽器や外科用品を滅菌する。腸が離断されているので、手続き自体は無菌ではありません。これは、クリーンで汚染されたと考えられている。感染の外因性源の導入を回避するための措置をとる。
吻合2.回結腸切除術
- 動物の呼吸数が約30〜40回/分に減速するまで、イソフルラン気化器からノーズコーンを介して、2リットル/分の酸素流量で4％イソフルランを投与することにより麻酔を誘導する。手順を開始する前に、痛みの応答がないことを確認するには、マウスの後肢足に適度な圧力を適用します。この時点で、0.5L /分に2％イソフルランと酸素の流れを下げてください。断続的に処置中に痛みの応答を確認し、それに応じて、イソフルラン流量を調節。
- 手術中の乾燥を防止し、透明テープを用いて固定手足と仰臥位でマウスを固定化するために眼にワセリンを適用する。
- povodine /ヨウ素溶液で腹部をきれいにし、新しい滅菌手袋に着替える。
- 筋膜と腹膜を露出するためにハサミを解剖鋭いポイントを使用して腹部の上部正中1.5センチの皮膚切開を行います。腹膜内容を公開する白線を通して同様の方法で筋膜/腹膜層を開きます。
- ヒトとは対照的に、マウスの盲腸は、典型的には、腹部の左上腹部に見られる。特定されたら、優しく鉗子で盲腸を把握し、切開を通してそれを実現します。腹部の表面にドレープ滅菌ガーゼ（ 図1A）上で盲腸から延びるファンアウトに回腸末端の約3cmを湿らせた綿棒を使用してください。暴露腸がプロシージャの全体の間に0.9％生理食塩水で湿った保たれていることを確認。
- 手術用顕微鏡を用いて、コロン（ 図1A）に沿って上腸間膜動脈から分岐回盲動脈を識別します。回盲動脈に隣接する無血管組織を切開、5-0絹のネクタイで動脈を包囲し、連結する。次に、回腸末端に地域の血液供給を見つけ、回盲部に離断点1.5-2センチ近位の順に選択します。上記のように回腸のこのセクションに枝を結紮。はさみを解剖ミクロと動脈を分割します。
- 離断終了する（ 図1B）に十分な血液供給があるの確保回腸および結腸の虚血性部分を分ける。それはより密接にコロンと一致するように内腔の直径を増加させるために30度の角度で分割して回腸をへらすることがしばしば有用である。腸の回盲部が除去されて、一度、整列各腸間膜の国境を確保ガーゼ上の回腸および結腸の離断端は、整列している。
- 8-0ポリプロピレン縫合糸（ 図1C）を使用して中断し、コロンの離断最後に回腸の離断終わりを近似することにより吻合を構築します。最初のステッチは、回結腸吻合水密になるまで、すべての0.5ミリメートルを置いその後の縫合糸で、腸間膜の国境に配置されます。回腸および結腸を通して縫合針を渡すとき、切り口がロールバックされていないことを確認し、針に刺されは、腸の切断端から0.5ミリメートルである。典型的な吻合は14から16に中断縫合が必要になります。吻合を通じて内容を強制的に回腸遠位の上、綿棒の近位を圧延することにより完了時に吻合の整合性と開存性をテストします。小腸の内容は自由に吻合漏れなく結腸に渡す必要があります。
- 10ミリリットルの注射器から0.9％食塩水3〜4 mlの暴露腸をすすぐ腸の表面から糞便を洗い流し、および腹腔内に戻って腸を提供します。 0.9％生理食塩水2 mlを用いて、腹膜腔を洗浄し、次いで横方向に腹壁に穏やかな圧力を適用することによって、この流体を排出する。
- 3-0絹ランニング縫合糸で切開を閉じ、イソフルランの流れを中止してください。術後疼痛管理のために-buprenorphine-皮下に長時間作用性アヘン剤の0.1 mg / kgをを管理します。
- 彼らがモバイルになるまで継続的に温めてケージに転送した後、熱ランプの下で動物を観察します。
3.術後ケアとモニタリング
- その日の残りのための苦痛の徴候のために継続的に温めケージに動物を監視します。背中流動食と水アドリブへのアクセス権を持つ新たな無菌ケージ内の動物飼育施設に動物を転送します。動物は3-4の群で収容することができる。
- 翌朝術後動物のチェックを実行し、動物は苦痛には表示されないように。唯一の流動食を供給。彼らは不快に表示された場合（ すなわち、猫背の姿勢、または最小活性）皮下ブプレノルフィンの追加の用量を投与。術後1日目の午後に一回より多くの動物に確認してください。
- 術後2日目の朝に動物が完全に回復し表示されるはずです。食料消費とstoolingの証拠は回復の明るい兆しである。さて、動物用固形飼料食を再開します。
注：苦痛の徴候は猫背の姿勢、貧しいグルーミング、および最小限のアクティビティが含まれます。苦痛の徴候が顕著である場合には、動物を安楽死させなければならない。 - 動物が足圧に反応しないようになるまで2 L / minのO 2流量で4％イソフルランで深く麻酔を誘発することによって動物を安楽死させる。頸椎脱臼を行い、適切な安楽死の兆候を観察する。
- ガイドラインは異なりますので、適応症に関する機関の勧告を参照してください。用とマウスでの安楽死の適切な方法。
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結果
死亡率と体重変化術後。
129S1野生型マウスをICRに続く死亡率は〜5％、一般的である。道徳の最も一般的な原因は、吻合で腸閉塞である。死亡率の他の原因は、吻合部の漏れや閉塞を腸につながる内部ヘルニアが含まれています。
体重減少は術後14日まで見られるが、一般的に非有意であることができます。マウスが完全に術後28日目（ 図2）によって術前体重を回復する傾向がある。
技術の転写
新しい大学院生（BM）は、以前の外科的訓練を受けたオペレータはテクニックを学ぶことができるかどうかを判断するためのICR手順を実行するために教えられた。訓練は、8-0ナイロン縫合糸を使用して吻合に使用されるものと類似の単一結節縫合を実行する方法を学ぶことから始まりました。縫合糸は、ラテックスGLOまたがっ切開を閉じるために行われたVEの。 BMは効率的に裂けることなく手袋を通して縫合糸を配置することができた後、彼らはいずれかを試みる前に、3つの完全な手順を観察...
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ディスカッション
ICRマウスは、腸疾患における手術の効果を研究するために使用できる強力なモデルである。この記事では、95％の成功率と28日後の手順まで安定重みによって反映されるように成長障害と問題なくマウスではICRを行う方法を説明しています。成功したICRへの最も重大な課題は、吻合と吻合リークで腸閉塞を避けることが含まれる。
閉塞を防ぐための手術への技術要素は吻合で内腔の直径の最大化を目的としている。離断点における回腸のスパチュラは、 図1Aに示すように30度の角度で腸を分割して管腔直径を増大させる。縫合針と腸組織の咬傷をとる場合には、腸の端部にアンロールし、約0.5mmの切断端から針を通過させることが不可欠である。組織の過大刺さは、内腔を狭めます。 AVするオプション吻合を構築するキールナンら 15によって記載されるように消化性ステントの使用を採用することであるoidは管腔狭窄。障害物を回避するための非技術的な側面が十分に小さい縫合糸4を選択し、手術前と手術後2日以内に1日、動物に流動食を供給する...
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開示事項
著者は開示するものは何もありません
謝辞
>jove_content<私たちは、アルバータ・イノベーツからの助成金を通じて、カナダ外科研究基金、エドモントン市民従業員研究支援基金、およびアルバータIBDコンソーシアムからの資金提供に感謝したいと思います。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| LD101液体げっ歯類ダイエット | testdiet.com | ||
| 0.9%NaCl | バクスター | FKE1324 | 注射品質の生理食塩水 |
| 手術顕微鏡 | Ziess | ||
| イソフルラン麻酔気化器 | ハーバード装置 | 34-0483 | |
| イソフルラン | アボット | 05260-05 | |
| ガラス板 | 手術面用 | ||
| 綿棒 | |||
| マイクロ Castroviejo ニードルホルダー、湾曲 | した 世界の精密機器 | 503377 | |
| Castroviejo ストレートはさみ | 世界の精密機器 | 555530S | |
| 解剖はさみ | 世界の精密機器 | 15922 | |
| ドレッシング鉗子×2 | ワールド精密機器 | 500363 | |
| 5-0 シルクプレカット縫合糸 | エチコン | A182H | 血管結紮用 |
| 8-0 BV130-5針のプロレン | エチコン | 8732H | 吻合用 |
| 3-0 FS-2針のシルク | エチコン | 8665G | 腹壁閉鎖用 |
| ワセリン ワセ | リン | ||
| 10 mlシリンジ | BDバイオサイエンスポ | ||
| ビドンヨード7.5%外科用スクラブ | betadine.com | ||
| ヒートランプ | |||
| ブプレノルフィン0.3 mg / ml | レキットベンキーザーヘルスケア株式会社 | 0006 |
参考文献
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