強化された骨形成のためのヒト脂肪由来間質細胞の単離および濃縮

サマリー

ヒト脂肪由来の間質細胞内の転写の不均一性は、細胞表面マーカーと骨形成遺伝子を使用して単一細胞レベルで定義することができます。 骨形成能力が増加した細胞亜集団の単離にフローサイトメトリーを利用したプロトコルについて説明し、これは頭蓋顔面骨格再建を強化するために使用できます。

要約

骨髄由来間葉系間質細胞(BM-MSC)は、幹細胞ベースの組織工学アプリケーションのゴールドスタンダードと考えられています。ただし、それらを収穫しなければならないプロセスは、ドナーサイトの重大な罹患率と関連している可能性があります。対照的に、脂肪由来の間質細胞(ASC)は、より豊富に存在し、より簡単に採取できるため、BM-MSCの魅力的な代替品となっています。BM-MSCと同様に、ASCは骨形成系譜細胞に分化することができ、頭蓋顔面骨格欠損に使用するための足場への播種などの組織工学用途に使用できます。ASCは、ASC、血管内皮細胞および壁細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、線維芽細胞、および循環細胞の不均一な混合物である消化脂肪組織の間質血管画分(SVF)から得られます。フローサイトメトリー解析により、ASCの表面マーカープロファイルはBM-MSCと類似していることが示されています。ASC表現型のマーカーを確立するいくつかの発表された報告にもかかわらず、この不均一な集団の骨前駆細胞を特定するプロファイルについては、まだコンセンサスが不足しています。このプロトコルでは、骨形成能力が強化されたASCの亜集団を分離して使用し、臨界サイズの頭蓋骨欠損を修復する方法について説明します。

概要

幹細胞集団の不均一な性質はまだ完全には理解されておらず、臨床的に効果的な幹細胞ベースの治療アプリケーションの開発に対する主要な障害となっています。幹細胞の不均一な集団を特徴付ける最も一般的な方法の1つは、蛍光活性化セルソーティング(FACS)などの細胞ソーティング法を採用して、表面マーカー発現プロファイルに基づいて細胞を分離することです。ソーティング方法が複雑になるにつれて、細胞のより明確な機能的亜集団を同定することが可能になります。マイクロ流体ベースの技術は、シングルセルレベルでの遺伝子発現の解析にますます頻繁に利用されるようになっています。マイクロ流体チップ内のマルチプレックス定量ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)により、効果的かつ信頼性の高い高分解能のシングルセル転写解析が可能になります。^1-5

48遺伝子の単一細胞転写プロファイリングを使用した以前の研究では、ASC間でかなりの転写不均一性が観察されました。⁶ しかし、遺伝子MSX2、BMP-5、BMP-7、ALP、OCN、RUNX2の分布は、骨形成性の高い転写プロファイルを持つ細胞群と強い関連を示した。この骨形成遺伝子発現プロファイルに従って細胞を単離するために、表面抗原発現パターンは転写パターンと相関し、その後、エンドグリン(CD105)の表面マーカー発現がASCの骨形成分化能の増強と密接に相関することを発見しました。CD105の発現とは無関係に、Chenらが以前に骨前駆細胞と関連していることを示したグリコシル-ホスファチジルイノシトール結合膜タンパク質である表面受容体Thy-1(CD90)の発現も、骨形成遺伝子の発現と相関していました。^6,7 これらの知見は、細胞ベースの骨組織工学アプリケーションのための骨形成能力が増加したASCのより大きな不均一なプール内の亜集団を前向きに分離する機会を提供します。

プロトコル

注：すべての患者の試料はインフォームドコンセントを得て、実験的なプロトコルは、スタンフォード大学の治験審査委員会（プロトコル＃2188と＃9999）によって審査され、承認された。

1.細胞の単離および培養：

1. 一般/局所麻酔下で腹部、脇腹、および/または大腿部領域の選択科目lipoaspirationを受けた健康女性患者からのヒト皮下脂肪組織を入手します。治験審査委員会（IRB）の承認は、人間の組織からのASCを単離するプロトコルのために得られていることを確認し、そのような材料での作業中に制度的安全上の注意に従ってください。
2. lipoaspirated脂肪組織からSVFを得るために、最初の1倍の滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）等容量の脂肪吸引物を3回洗浄する。慎重に吸引し、底の水層を捨てる。
3. 私はハンクのコラゲナーゼ0.075％の種類：コラゲナーゼ消化緩衝液を準備平衡塩類溶液（HBSS）。 FACS緩衝液を準備します。PBS中の2％FBS、1％のP188と1％のペニシリン - ストレプトマイシンを。市販の0.22μmの細孔サイズ速い流れのポリエーテルスルホンフィルターを使用して両方のソリューションをフィルタリングします。
4. 洗浄した脂肪組織を消化するために、37°C​​（約180シェイク/分）で60分間、振盪水浴中でしっかりと消化槽をコラゲナーゼ消化緩衝液の等量を追加して配置する。
   注：これは、必要とされるよりも、これは（ すなわち 、コラゲナーゼ消化緩衝液の250ミリリットル、1リットルの滅菌フラスコ内の洗浄した脂肪組織の250ミリリットル）しながら中に最大の消化を可能にするので、より大きな容積消化容器を使用するのが最適です。
5. FACS緩衝液の等量を添加し、室温で5分間静置させることによって酵素活性を中和する。次に、4℃で20分間233×gで遠心。
6. 慎重に吸引し、高密度SVFペレットを乱さないように注意しながら、上清を捨てる。
7. RT赤5〜10mlの中でペレットを再懸濁ペレットサイズに基づいて、細胞溶解緩衝液。 RTで5分間233×gで5分間遠心分離を室温で座って解決のままにしておきます。
8. 上清を吸引し、ペレットの大きさに基づいて、伝統的な増殖培地5〜10mlの添加することによりペレットを再懸濁（ダルベッコ改変イーグル培地[DMEM] / 10％FBS / 1％ペニシリン - ストレプトマイシン溶液[ペンストレプトマイシン]）。
9. 細胞破片を除去するためには100μmナイロン細胞ストレーナーを通してサスペンションをフィルタリングします。
10. 4℃で5分間233×gで遠心分離し、ペレットを中断することなく、上清を捨てる。
11. ペレットサイズに基づいて、伝統的な増殖培地5-10中にペレットを再懸濁。
12. 15センチメートル標準培養皿に2×10 ^6個の細胞を配置し、O / N 37°C / 21％O _{2、5％CO 2}で初代培養を確立する。増殖培地中で37℃/ 21％O _{2、5％CO 2}での自発的な分化を防止するために、サブコンフルエントなレベルに維持する。
    注：完全に中の細胞密度コンフルエント15cmのプレートは、約4-6×10 ⁶細胞である。

2.染色

1. ソート/染色前36時間、37℃/ 21％O _{2、5％CO 2、}伝統的な増殖培地中での培養のASC。
2. （製造業者のプロトコルに従って）のAccutaseを用いて培養プレートからリフトのASC。
3. 一度（2％FBSおよび1％のペン - ストレプトマイシンを含むPBS）をFACS緩衝液で細胞を洗浄する。
4. 4℃で5分間233×gで遠心し。
5. ペレットを中断することなく、上清を捨てる。 FACS緩衝液0.5〜1 mlの細胞を再懸濁し（細胞数および所望の抗体の量に依存する）。
   注：細胞懸濁液の体積は、FACS抗体製造業者の推奨に従って、抗体濃度を決定する。しかし、1の開始濃度を用いて抗体濃度の滴定、：それは抗体を使用する最初の時間であれば100は、通常は推奨されている。
6. の合計数血球計数器を用いて細胞。
7. 未染色試料および単色のコントロールのために使用されて1.5 ml遠心管中で予備100μlのアリコート（使用する蛍光抗体の数に応じて）。
8. （製造者の指示に従って、所定の濃度で）適切な蛍光標識されたモノクローナル抗体を追加し、遮光し氷上で20〜30分、インキュベートする。
   1. 骨形成亜集団にラベルを付けるには：1：50の濃度になるようにFACS緩衝液中の抗CD90（APC抗ヒトCD90（はThy1））または抗CD105（FITC抗ヒトCD105（エンドグリン））を希釈します。
   2. 他の細胞集団（ 例えば 、造血および内皮細胞）を標識する：希釈した抗CD45（抗ヒトCD45パシフィックブルー）、抗CD34（抗ヒトCD34 APC）、および/ ​​または抗CD31（抗ヒトCD31 PE ）FACSで1時50分の濃度にバッファー。
   3. 直接結合した抗体を使用していない場合は、適切なストレプトアビジン結合第二に、ビオチン化一次抗体を使用する100：そのような1の希釈でストレプトアビジンPE-Cy7は、などの進の抗体。
9. インキュベーション後、細胞を2回洗浄する。上清を吸引し、4℃で5分間、233×gでFACS緩衝液および遠心機でチューブを埋める。
10. 細胞塊を除去するために70μmのナイロン細胞ストレーナーを通して400〜500μlのFACSバッファおよびフィルタサンプル中の細胞を再懸濁。
11. フィルタートップでFACSチューブに標識細胞を移し、分析の間、サンプルを氷上で維持する。

3.蛍光活性化細胞ソーティング

注：以下の手順では、蛍光活性化細胞選別（FACS）または熟練した技術者の支援に予備知識を義務付ける。

1. 前方散乱（FSC）、側方散乱（SSC）を調べるために、設計解析プロットを適切なFACSソフトウェアを使用して、フィコエリトリン（PE）-Texasレッド、パシフィックブルー、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、アロフィコシアニン（APC）および任意の他のフルオロフォアの使用dは細胞を標識する。
2. セルソーター、簡単に渦に細胞を再懸濁するために、各サンプルをロードする前に。
3. 細胞破片を排除するために、ベースライン自己蛍光を決定するために、全細胞集団のためにゲートを設定するために、未染色試料の分析を開始する。
4. 未染色試料にヨウ化プロピジウム（PI）を追加し、全細胞集団内の生細胞の集団を可視化するためにそれを分析する。この集団の周りにゲートを構築します。
5. 蛍光補正を行うために、各蛍光色素のための単色対照試料を分析する。
6. ソートにゲートの位置を設定するための染色サンプルを分析します。
7. 死細胞を染色するために、染色されたサンプルにPIを追加します。
8. 標識された細胞集団をソートします。ソート培地を含む1.5 mlの遠心チューブまたは円錐管（15ml）中のどちらかに変換する。
9. 手動での細胞の必要量が得られた後に選別止める。
10. 私達取得された細胞集団のFACS、ごく一部分析することによって、高純度チェックを行う（ 例えば 、500細胞）る。
    注：この手順はソートされた細胞集団の純度を確認した。理想的には、純度が90〜95％より大きくなければならない。
11. 10％FBSを含む新鮮な培地1mlにソートし、再懸濁の4°Cの直後の終了で5分間233×gで遠心分離細胞。
    注：使用される媒体の量は、細胞ペレットのサイズに基づいて増加させることができる。
12. ゼラチン被覆プレート上のプレートは、細胞生存率を改善する。最終的な細胞収量に応じて、6ウェルプレート中の12ウェルプレートでウェル当たり100,000細胞を、ウェル当たり300,000細胞をプレーティング。

結果

ヒトASC（ 図1A、1B）の高濃縮集団の単離に強化された骨形成の結果と細胞のマーカーとしてCD90を使用した。 ASCははパシフィックブルー結合抗ヒトCD45、FITC結合抗ヒトCD105、およびAPC結合抗ヒトCD90で染色した。ポストソート分析によって定量しソートした後、純度のレベルは、98％以上であった。

2つの新規な亜集団の将来の単離のために許可された転写プロファイルに基づいてセルのグループを定義する。以前に^6,8,9のように各有望亜集団（ ^低 CD90 ⁺及びCD105）の骨形成能、ならびにそれのin vitroでのソートされていない集団を特徴付けるために、細胞は、14日間骨形成分化培地で培養した。 7日目（骨形成¹⁰の早期検出のために使用される）、アルカリホスファターゼ染色が有意にCD90 ⁺に増加した他のグループ（ 図2A）にSUP>人口の相対的。これは、両方の肉眼...

ディスカッション

現在、ヒト脂肪組織のSVFからASCの均質な亜集団の単離は、望ましい目標ものの依然として厳しい。このような細胞は、骨格組織の形成および恒常性を研究するために使用することができるようにプロ骨形成ASC亜集団の単離は、特に望ましい。しかし、脂肪組織のSVFは、セル容量と分化能を食い止めるに関して有意な異質性を保有する^。11この異質性の分子基盤は、細胞のプールされた集団から理解され、その代わりに、単一細胞分析を必要とすることはできない^。12このアプローチでは、表面マーカー密接にASCの骨形成分化能に関連付け識別することができる。

ASCの成功濃縮のための最も重要な要因は、上記の方法に記載のように、FACSのために使用する抗体に関連している。一つは、CELに対して高い親和性を有する抗体を選択することが賢明である必要があります当該リットル表面マーカー。理想的には、このように複数のステップと、細胞死、細胞損失およびエラー発生主義の増加可能性を必要とする間接的な染色方法とは対照的に、一次複合抗体であるべきである。さらに、FACS中の軽微な変更は、細胞...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
使い捨て 250 ml コニカルチューブ	コーニング (Thomas Scientific)	2602A43
ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122
DMEM、高グルコース、GlutaMAX サプリメント	Gibco	10566-016
PBS、pH 7.4	Gibco	10010-023
Betadine - 消毒剤 ポビドン/ヨウ素溶液	Purdue	PFC-67618015017
Hank's Balanced Salt Solution, 1X	Cellgro	21-023-CV
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin	Gibco	16000-044
コラゲナーゼ from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C0130-5G
ACCUTASE 細胞剥離溶液	幹細胞技術	7920
APC マウス 抗ヒト CD90	BD Pharmingen	559869
FITC マウス 抗ヒト CD105 (エンドグリン)	BD Pharmingen	561443
抗ヒト CD45 eFluor 450 (パシフィックブルーの代替品)	eBioscience	48-9459-41
Anti-Human CD34 APC	eBioscience	17-0349-41
Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE	eBioscience	12-0319-41
Streptavidin PE-Cy7	eBioscience	25-4317-82
BD FACS Aria II instrument	BD Biosciences
BD FACSDiva Software	BD Biosciences