末梢血造血前駆細胞からヒト神経幹細胞の直接誘導

サマリー

この方法は、直接末梢血細胞から濃縮造血前駆細胞からのヒト神経幹細胞を誘導するために開発された。

要約

ヒトの疾患の特定の神経細胞培養は、人間の神経疾患のためのin vitroモデルの生成に不可欠である。しかし、初代ヒト成体神経の文化へのアクセスの欠如が固有の課題を提起する。誘導多能性幹細胞（IPSC）における最近の開発は、患者固有のIPSCを通して皮膚線維芽細胞からの神経培養物を導出するための別のアプローチを提供するが、このプロセスは労働集約的で、特別な専門知識と大量のリソースを必要とし、数ヶ月かかることがあります。これは神経疾患の研究にこの技術の幅広いアプリケーションを防ぎます。これらの問題のいくつかを克服するために、我々は、IPSC導出処理をバイパスして、直接ヒト成人末梢血から神経幹細胞を誘導するための方法を開発した。ヒト成人末梢血から濃縮造血前駆細胞をin vitroで培養し、転写因子Sox2の、10月を含むセンダイウイルスベクターでトランスフェクト3/4、Klf4及びc-Myc。さらに、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）および血管内皮増殖因子（VEGF）を含むヒト神経前駆細胞培地を用いて選択された細胞の形態変化でのトランスフェクションの結果。得られた細胞は、ネスチンおよびSOX2などの神経幹細胞マーカーについての発現によって特徴づけられる。これらの神経幹細胞は、さらに指定された分化培地でニューロン、星状膠細胞および乏突起膠細胞に分化することができる。簡単にアクセスできるヒト末梢血サンプルを用いて、この方法は、神経疾患のin vitroモデル化のための神経細胞へのさらなる分化のために神経幹細胞を誘導するために使用することができ、これらの疾患の病因及び治療 ​​に関連した研究を進めることができる。

概要

in vitroで神経細胞培養物は、神経疾患の研究のための基本的なツールとして使用されてきた。主要な動物（主にげっ歯類）神経培養^1,2および神経膠腫又は他の腫瘍に由来するヒト神経細胞株は、最も一般的に使用されるような研究である。しかし、げっ歯類およびヒト細胞の間に有意な差があることが認識されている。げっ歯類に基づいた多くの発見は、ヒトに翻訳することができません。さらに、大量のゲノム情報と、比較的容易な遺伝子編集と全ゲノム配列の解析の急速な発展に、傾向はますますギヤード少数の人間の神経細胞を作るもの、病気がちの遺伝子を発見し、特定の疾患で、その機能と役割の輪郭を描くのです。細胞株は、唯一の利用が限られている。理論的には、患者の神経系のサンプル由来のヒト初代神経培養は、最良の選択であるが、それらを得ることは不可能である。したがって、代替メタODSが必要である。近年、いくつかのアプローチは、2つの最も識別可能で、追求されてきた。マウスおよびヒトの体細胞の^3、4を用いて誘導多能性幹細胞（IPSC）を生成する技術の開発に続いて、神経細胞は、さらにそれら^5-7と区別することができた。しかし、生成しIPSCを特徴づけることは労働集約的、技術、および時間の入力を要求し、時には法外。直後に、別のアプローチは、直接体細胞^8,9から神経細胞を形質転換するために開発された。得られた神経細胞は非増殖性であるので、それは、大量の細胞を必要とする、集中的な研究及び薬物スクリーニングにおけるその適用を制限している。両方の技術の利点を取るためには、体細胞から神経幹/前駆細胞の直接の導出は、いくつかのグループによって^10〜12を検討されている、IPSCの生成および特性の退屈なプロセスをバイパスし、それでも専らいるDES後で神経分化のための神経幹細胞のまともな数。我々は以前、造血前駆細胞への山中転写因子の導入に続いて、神経幹細胞は直接培地^13を選択する神経前駆細胞を用いて生成することができることを示している。ここでは、詳細に方法を報告している。

プロトコル

アダルト全血から造血前駆細胞の1濃縮

NOTE：造血前駆細胞またはCD34 +細胞は、臍帯血、白血球搬出材料と密度勾配遠心分離に基づく方法を用いて全血を含む種々の供給源から誘導される末梢血単核細胞（PBMC）から精製することができる。ここに記載されている方法は、一例として、全血を使用しています。

1. 全血由来のPBMCの単離：
   1. 挿入物の中心孔を通してそれをピペッティングすることによりSepMateチューブにリンパ球分離培地の4.5ミリリットルを追加します。
   2. 2％ヒト血清を含有する滅菌DPBS等量の血液サンプルを希釈（v / v）である。例えば、DPBS + 2％ヒト血清5mlの試料を5mlに希釈。
   3. チューブの側面をそれを下にピペッティングすることによって希釈されたサンプルを追加します。中央の穴を通って直接サンプルを注ぐないように注意してください。
   4. 室温で10分間1200×gで遠心分離する。
   5. 慎重にPMBC層の上の上清を除去。
   6. 新しいチューブにPBMC層（曇り）を収集します。
   7. ブレーキをオフにして、室温で10分間150×gでチューブと遠心分離機に2％のヒト血清を含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）の15ミリリットルを追加します。
   8. 上清を捨て、2％ヒト血清を含有するDPBS 15mlにペレットを再懸濁。セルの数を数える。
   9. 室温で10分間690×gで遠心分離する。チューブから全ての上清を取り除きます。
   10. 15 1％抗生物質を含有するイスコフ改変ダルベッコ培地（IMDM）の溶液（v / v）を、10％ヒト血清あたり1×10 ^7個の細胞で細胞を再懸濁し（v / v）である。
   11. CD34 +細胞を単離する前に、5％CO ₂インキュベーター中でO / N、37℃で細胞をインキュベートする。
2. CD34マルチソートキットを使用したPBMCからCD34 +細胞のポジティブ選択：
   注：高速の仕事と冷たい細胞を作るために予め冷却したソリューションを使用し、キャッピングを防ぐキット命令当たりの細胞表面と非特異的細胞標識に対する抗体の。
   1. 50ミリリットルチューブ内のすべてのPMBCを収集し、培地中の全細胞の数を数える。
   2. 10分間300×gで細胞を遠心します。完全にすべての上清を取り除きます。
   3. ビーズ緩衝液中の300μlのあたり10 ⁸細胞（0.5％ヒト血清（v / v）のおよび2mM EDTAを含有するDPBS）まで再懸濁する。
   4. のFcRブロッキング試薬を100μlを追加し、CD34のMultiSortMicroBeads100μlのを追加します。
   5. よく混ぜ、冷蔵庫で30分間インキュベートする（2から8℃）。
   6. RTで10分間、300×gで10 ⁸細胞遠心あたりのビーズ緩衝液2mlを添加して細胞を洗浄する。完全に上清を除去します。
   7. 緩衝液500μl中に10 ⁸細胞まで再懸濁する。
   8. MACSセパレーターの磁場中MACS LSカラムを配置し、ビーズバッファーの3ミリリットルですすぐことにより、カラムを準備します。
   9. CENTE上に細胞懸濁液を適用します列のR。未標識細胞が好ましい場合に収集することができるが流れる。
   10. 洗浄カラムビーズ緩衝液3mlで3回洗浄する。
   11. セパレーターから列を削除し、15ミリリットルチューブの上に置きます。
   12. カラムにビーズ緩衝液5mlを加え、すぐにカラム内にプランジャーを押すことで、磁気標識された細胞を洗い流す。
   13. 細胞懸濁液の1ミリリットルあたりのマルチソートリリース試薬20μlのを追加します。よく混ぜ、冷蔵庫で10分間インキュベートする（2から8℃）。
   14. 10 ⁷個の細胞あたりのビーズ緩衝液2mlと室温で10分間300×gで細胞を遠心- 1を追加します。完全に上清を除去します。
   15. 10 ⁷個の細胞あたりビーズ緩衝液50μlに再懸濁細胞。
   16. 10 ⁷細胞あたりのマルチソート停止試薬30μlのを追加し、冷蔵庫で15分間インキュベートする。
   17. ビーズ緩衝液5mlを加え、室温で10分間300×gで細胞を遠心する。上清を捨てる。

CD34 +細胞から誘導した神経幹細胞の2導出

1. CD34 +細胞の培養：
   注：冷蔵庫に保存した場合、新たに調製した培地は7日以内に使用する必要があります。重要なCD34細胞損失は、24時間後に観察することができたが、細胞数が連続的に減少または全く増殖がない場合、細胞の有意な増殖は、特に5日後に、顕著であるべきで、それは悪い培地またはCD34の細胞質と細胞のいずれかを意味する次のステップのために使用すべきではありません。
   1. 再懸濁し、培養CD34 + CD34の細胞は（ステムスパンSFEMヒトトロンボポエチンを含む培地（TPO、100 ng / ml）を、fms様チロシンキナーゼ3（FLT-3）リガンド（100 ng / ml）を培地に維持し、幹細胞因子（SCF、 24ウェルプレート中で100 ng / ml）を、インターロイキン-6（IL-6を20ng / ml）およびインターロイキン-7（IL-7、20 ng / ml）を）（3×10 ⁵ /ウェルまで5％CO ₂インキュベーター中で37℃にてウェルあたり1mlの培地）。
   2. AFTER 24時間は、浮遊細胞を収集し、接続されているすべての細胞と細胞の破片を取り除くために、室温で110×gで細胞を遠心する。上清を捨て、さらに5日間で5％CO ₂インキュベーター中、37℃で新しい24ウェルプレート（ウエルまでの1×10 ⁵ /）に新鮮なCD34の維持培地と種子の1ミリリットル中に細胞を懸濁します。
   3. CD34 +細胞がウェル（ 図1A）の底に浮かんでいる間に慎重に上清の上半分を吸引することにより、一日おきに培地の半分を交換してください。
2. センダイウイルストランスフェクション：
   1. 5日目に、CD34の細胞を採取し、室温で10分間170×gで細胞を遠心する。上清を捨てる。
   2. 培地1ml中^、1×10、5 /ウェルで24ウェルプレート中の新鮮な培地中に細胞を再懸濁。
   3. 最初の10秒間37℃の水浴中でチューブの底部に浸漬することによりcytotune-のiPS仙台書き換えキットを解凍した後、完全に解凍T RT。簡単に言えば、チューブを遠心し、氷の上に置く。該当ロットの分析証明書（COA）に記載されている各ウイルスの推奨される量を混合することにより、センダイウイルス液を調製する。 MOI 15を推奨します。
   4. CD34細胞の各ウェルにセンダイウイルスミックスを追加します。静かに振とうして井戸を混ぜる。 5％CO ₂インキュベーター中37℃で細胞をインキュベート。
   5. 24時間後にトランスフェクション効率を観察します。細胞集合体と球の形成に成功したトランスフェクション（ 図1B）のための指標であることに注意してください。
   6. 慎重によく別の媒体の上半分を転送することにより、培地の半分を変更します。新しいウェル中の細胞球が存在する場合、新鮮な培地と同じ量を追加する。
   7. ステップ2.2.6を繰り返して、他の日ごとに培地を変更します。
3. 神経幹細胞の誘導。
   注：細胞条件に依存して、約5または7日間トランスフェクション後、単層接着細胞30に到達する -50％のコンフルエンス（ 図1C）。
   1. 栄養混合物F-12 1X N2サプリメント、0.1％（w / v）のウシ血清アルブミンを含む（DMEM / F12）、（：（ダルベッコ改変イーグル培地浮遊細胞と球を含有する上清を外し、神経前駆培地の1ミリリットルを追加BSA）、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）の1％（v / v）の抗生物質、20ng / mlの、および上皮成長因子（EGF）の20 ng / ml）を接着細胞に。
   2. 必要に応じて、静かにピペッティングして細胞球を解離し、10分間170×gで細胞を遠心する。上清を除去し、アップするなどのバック命令あたりのマトリゲルでコーティングされた新しい24ウェルプレート中の神経前駆培地1mlで細胞を懸濁します。
   3. 通常1週間後に、80％コンフルエント - 細胞が60に達するまで、一日おきに培地を変更します。
   4. 上清を捨て、神経幹細胞培地（無血清培地、NSC SFM）の1ミリリットルを追加。続いて、細胞スクレーパーを用いて細胞を解離非常に穏やかにピペッティングすることによって。
   5. 細胞を除去し、6ウェルプレートの1ウェルにそれらのすべてをシードする。神経幹細胞培地の別の1mlを各ウェルに2mlのメディアを作るために加える。 5％CO ₂インキュベーター中37℃で細胞をインキュベート。
   6. 先日の媒体ごとに変更します。
   7. 2.3.4と2.3.6の手順に従って：3の比率の細胞が60％コンフルエンスに達したとき、1で細胞を解離し、replate。
4. 神経幹細胞の凍結。
   1. 神経幹細胞培地に、20％ジメチルスルホキシド（DMSO）を添加することにより凍結培地神経幹細胞を調製する。氷上で凍結培地にしてく​​ださい。
   2. 穏やかにピペッティングし、その後、細胞スクレーパーを用いて、6ウェルプレート中の細胞を解離する。細胞を数える。 RTで10分間、170×gで細胞を集める。上清を捨てる。
   3. 1×10 ⁶ / mlの濃度で神経幹細胞培地中で細胞を再懸濁。細胞に凍結培地の同じボリュームを追加します。
   4. 1ミリリットル（5×1を追加します。クライオバイアル内の細胞の^0〜5の全細胞）。命令の次氏Froster冷凍コンテナを用いて細胞を凍結する。

3.神経細胞の分化

1. 神経細胞の分化：
   1. 神経幹細胞が80％コンフルエンスに達したときに、ラバーポリスマンを用いて神経幹細胞を剥離した後、穏やかにピペッティングすることにより解離する。
   2. 細胞をカウントし、神経幹細胞培地中で1×10 ⁵ / mlに濃度を調整する。
   3. ニューロン分化のために、1×10で⁵ /ウェルで24ウェルプレートにカバースリップをコーティングし、ポリ-D-リジン/ラミニン上で細胞をプレー。 5％CO ₂インキュベーター中37℃で細胞をインキュベート。
   4. 神経分化培地で培地を交換して1×N2サプリメント、1×B27サプリメント、300 / mlのcAMPを、0.2mMのビタミンC、10ng / mlの脳由来神経栄養因子（BDNF）と派生10ng / mlのグリア細胞を含む（DMEM / F12神経栄養因子（GDNF））のaf24時間TER。 5％CO ₂インキュベーター中37℃で細胞をインキュベート。
   5. 2週間、週に2回の神経分化培地を変更します。
2. アストログリア分化：
   1. ピペッティングにより神経幹細胞を解離する。
   2. 細胞を計数し、5×10 ⁴細胞/ mlに細胞濃度を調整する。 24ウェルプレート上に細胞を播種する。 5％CO ₂インキュベーター中37℃で細胞をインキュベート。
   3. 10％ウシ胎児血清（FBS）を含むDMEM / F12に培地を交換し、5％CO ₂インキュベーター中37℃で細胞をインキュベートする。
   4. 2週間、週に2回培地を変更します。細胞は2週間前に合流に達した場合は、ステップ3.2.1と3.2.2以下の細胞をreplate。
3. オリゴデンドロサイト分化：
   1. ピペッティングにより神経幹細胞を解離する。
   2. オリゴデンドロサイトdifferenti 1mlの細胞および種子ポリ-L-オルニチンコーティングした24ウェルプレートに1×10 ^5個の細胞を計数、N2補充を含むDMEM / F12の血小板由来成長因子AA（PDGF-AA）、10ng / mlの、ニューロトロフィン-3（NT-3）の2 ng / mlの、ソニックヘッジホッグの2 ng / mlのからなるATION培地（ SHH）、及びトリヨードサイロニン（T3の3 nM）を有する。 5％CO ₂インキュベーター中37℃で細胞をインキュベート。
   3. 2週間、週に2回培地を変更します。
   4. 1xN2サプリメントとミエリン塩基性タンパク質（MBP）生産のためのT3と文化の3 nMの追加の週のための細胞を含むDMEM / F12を含む培地を交換してください。

4.免疫蛍光染色

1. 4％パラホルムアルデヒド（PFA）でメディアを交換してください。 RTで10分間インキュベートする。
2. PFAを破棄し、PBS、0.1％トリトンX-100（PBS-T）で3回、5分毎に時刻を含む洗浄する。
3. PBSで室温で10分間、0.5％トリトンX-100を含有する細胞を透過。
4. PBS-Tを室温で20分間、4％ヤギ血清を含むPBSで細胞をブロックする。
5. 対応する主antiboで細胞をインキュベート低温室でRTまたはO / Nで2時間、0.1％BSAを含むPBS-Tで希釈したダイ。
6. PBS-Tで3回、5分毎の時間のために細胞を洗浄する。暗所にてシェーカー上で1時間0.1％BSAを含むPBS-Tで希釈400：1を用いて蛍光色素と結合した二次抗体に対応する細胞をインキュベートする。
7. RTで10分間、4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を含有するPBS-Tで細胞を洗浄する。
8. RTで5分間ずつPBS-Tで細胞を2回以上洗う。
9. 顕微鏡を用いて標識された細胞を観察し、撮影した写真（ 図3）。

結果

CD34細胞の品質は、神経幹細胞の形質導入の成功のために重要である。高品質のCD34細胞は、培養の日の最初のカップルの間に増殖し、ちょうど培養容器（ 図1A）の底の上にフローティング、非粘着性、均一に円形細胞として表示されます。拡大と関連が緩んでいる非特定の細胞凝集体は、細胞培養中に発生する可能性がありながら、時間（ 図1B）上で展開する細胞凝集、、で成功した感染の結果。接着細胞は通常、3〜5日、トランスフェクション後の周りに表示されます。彼らは主にバイポーラであり、単層（ 図1C）を作るために増殖します。神経前駆細胞の培地で選択した後、付着細胞のほとんどは、ネスチンおよびSOX2陽性でOCT4陰性（ 図2）である。誘導された神経幹細胞は、ニューロンおよびグリア（ 図3）にさらに分化することができる。

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ディスカッション

直接末梢造血前駆細胞から神経幹細胞を生成するための詳細なプロトコルが提供される。

線維芽細胞と比較して、ヒト末梢血よりアクセス可能である。提示プロトコル以上1×10 ^5、造血前駆細胞、またはCD34陽性細胞を用いて、全血を10mlから濃縮することができる。血小板の汚染は、通常、予防されないが、それは容易に低速遠心分離によって低減することができ、神経幹細胞の生成を妨害しない。しかし、CD34細胞の質および数は、神経幹細胞の最終的な産生を決定する。 CD34細胞の品質は大きくCD34培地に対するそれらの応答によって判断することができる。肯定応答は、培地中でのCD34 +細胞の急速な増殖を意味し、後で形質転換を成功させるために重要である。 CD34細胞は増殖し、あるいは有意な細胞の損失を受けることができなかった場合は、transformation少ない増殖細胞を生じることが困難となる。したがって、それが唯一の良い品質のCD34細胞の形質転換を開始することが提案されている。 1×10 ⁵ CD34 +細胞は、経験豊富な研究者のために十分であるが、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
リンパ球分離培地	Lonza	17-829E	1x
SepMate	Stemcell Technologies	15415	15 ml
ヒト血清	Invitrogen	34005-100
抗生物質	Gibco	15240-062	1%
CD34 MultiSort Kit	Miltenyi Biotec	130-056-701
EDTA	Cellgro	46-034-Cl	2 mM
MACS LS カラム	Miltenyi Biotec	130-042-401
StemSpan SFEM medium	Stemcell Technologies	9650	1x
IMDM	Quality Biologicals	112-035-101	1x
TPO	Peprotech	300-18	100 ng/ml
Flt-3	Peprotech	300-19	100 ng/ml
SCF	Peprotech	300-07	100 ng/ml
IL-6	Peprotech	200-06	20 ng/ml
IL-7	Peprotech	200-07	20 ng/ml
IPS 仙台 リプログラミングキット	Life Technologies	A1378001
Cell scraper	Sarstedt	83.183
DMSO	Sigma	D2650
CryoTube vials	サーモ	368632
Mr. フロスティ容器	サーモ	5100-0001
DMEM/F12	ライフテクノロジー	ズ 12400-024	1x
N2 サプリメント	ライフテクノロジー	ズ 17502-048	1x
ウシ血清アルブミン	Σ	A2934	0.1% (w/v)
bFGF	Peprotech	100-18B	20 ng/ml
EGF	Peprotech	AF-100-15
B27 supplement	Life Technologies	17504-044	1x
NSC serum free medium	Life Technologies	A1050901	1x
Poly-D-lysine/laminin coated cover slips	BD Bioscences	354087
cAMP	Sigma	A9501	300 ng/ml
Vitamin C	Sigma	A0278	0.2 mM
BDNF	Peprotech	450-02	10 ng/ml
GDNF	Peprotech	450-10	10 ng/ml
Poly-L-ornithine	Sigma	P4957	1x
PDGF-AA	Peprotech	100-13A	10 ng/ml
NT-3	Peprotech	450-03	2 ng/ml
Shh	Peprotech	1314-SH/CF	2 ng/ml
T3	Sigma	T6397	3 nM
PFA	Sigma	P6148	4%
PBS	Quality Biological	119-069-101	1x
ヤギ血清		ΣG9023	4%
TritonX-100	Σ	T9284
マウスモノクローナル抗ネスチン	ミリポア	AB5922	1:1,000
抗SOX2抗体	Applied Stemcell	ASA0120	すぐに使える
マウス抗β;III-チューブリン抗体	プロメガ	G712A	1:1,000 希釈
ウサギ抗 GFAP 抗体	シグマ	G4546	1:100
希釈 抗 O4 抗体	R&D Systems	MAB1326	IgM; 1 ng/ml
Alexa Fluor 594 ヤギ抗ウサギ抗体	生命技術	A11012	1:400 希釈
Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス抗体	生命技術	A11001	1:400 希釈
Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス IgM 抗体	生命技術	A21042	1:250 希釈
DAPI	Sigma	D9542	1 μグラム/ミリリットル