この方法は、直接末梢血細胞から濃縮造血前駆細胞からのヒト神経幹細胞を誘導するために開発された。
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この記事について
サマリー
要約
ヒトの疾患の特定の神経細胞培養は、人間の神経疾患のためのin vitroモデルの生成に不可欠である。しかし、初代ヒト成体神経の文化へのアクセスの欠如が固有の課題を提起する。誘導多能性幹細胞（IPSC）における最近の開発は、患者固有のIPSCを通して皮膚線維芽細胞からの神経培養物を導出するための別のアプローチを提供するが、このプロセスは労働集約的で、特別な専門知識と大量のリソースを必要とし、数ヶ月かかることがあります。これは神経疾患の研究にこの技術の幅広いアプリケーションを防ぎます。これらの問題のいくつかを克服するために、我々は、IPSC導出処理をバイパスして、直接ヒト成人末梢血から神経幹細胞を誘導するための方法を開発した。ヒト成人末梢血から濃縮造血前駆細胞をin vitroで培養し、転写因子Sox2の、10月を含むセンダイウイルスベクターでトランスフェクト3/4、Klf4及びc-Myc。さらに、塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）および血管内皮増殖因子（VEGF）を含むヒト神経前駆細胞培地を用いて選択された細胞の形態変化でのトランスフェクションの結果。得られた細胞は、ネスチンおよびSOX2などの神経幹細胞マーカーについての発現によって特徴づけられる。これらの神経幹細胞は、さらに指定された分化培地でニューロン、星状膠細胞および乏突起膠細胞に分化することができる。簡単にアクセスできるヒト末梢血サンプルを用いて、この方法は、神経疾患のin vitroモデル化のための神経細胞へのさらなる分化のために神経幹細胞を誘導するために使用することができ、これらの疾患の病因及び治療 に関連した研究を進めることができる。
概要
in vitroで神経細胞培養物は、神経疾患の研究のための基本的なツールとして使用されてきた。主要な動物（主にげっ歯類）神経培養1,2および神経膠腫又は他の腫瘍に由来するヒト神経細胞株は、最も一般的に使用されるような研究である。しかし、げっ歯類およびヒト細胞の間に有意な差があることが認識されている。げっ歯類に基づいた多くの発見は、ヒトに翻訳することができません。さらに、大量のゲノム情報と、比較的容易な遺伝子編集と全ゲノム配列の解析の急速な発展に、傾向はますますギヤード少数の人間の神経細胞を作るもの、病気がちの遺伝子を発見し、特定の疾患で、その機能と役割の輪郭を描くのです。細胞株は、唯一の利用が限られている。理論的には、患者の神経系のサンプル由来のヒト初代神経培養は、最良の選択であるが、それらを得ることは不可能である。したがって、代替メタODSが必要である。近年、いくつかのアプローチは、2つの最も識別可能で、追求されてきた。マウスおよびヒトの体細胞の3、4を用いて誘導多能性幹細胞（IPSC）を生成する技術の開発に続いて、神経細胞は、さらにそれら5-7と区別することができた。しかし、生成しIPSCを特徴づけることは労働集約的、技術、および時間の入力を要求し、時には法外。直後に、別のアプローチは、直接体細胞8,9から神経細胞を形質転換するために開発された。得られた神経細胞は非増殖性であるので、それは、大量の細胞を必要とする、集中的....
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プロトコル
アダルト全血から造血前駆細胞の1濃縮
NOTE：造血前駆細胞またはCD34 +細胞は、臍帯血、白血球搬出材料と密度勾配遠心分離に基づく方法を用いて全血を含む種々の供給源から誘導される末梢血単核細胞（PBMC）から精製することができる。ここに記載されている方法は、一例として、全血を使用しています。
- 全血由来のPBMCの単離：
- 挿入物の中心孔を通してそれをピペッティングすることによりSepMateチューブにリンパ球分離培地の4.5ミリリットルを追加します。
- 2％ヒト血清を含有する滅菌DPBS等量の血液サンプルを希釈（v / v）である。例えば、DPBS + 2％ヒト血清5mlの試料を5mlに希釈。
- チューブの側面をそれを下にピペッティングすることによって希釈されたサンプルを追加します。中央の穴を通って直接サンプルを注ぐないように注意してください。
- 室温で10分間1200×gで遠心分離する。
- 慎重にPMBC層の上の上清を除去。
- 新しいチューブにPBMC層（曇り）を収集します。
- ブレーキをオフにして、室温で10分間150×gでチューブと遠心分離機に2％のヒト血清を含むダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）の15ミリリットルを追加します。
- 上清を捨て、2％ヒト血清を含有するDPBS 15mlにペレットを再懸濁。セルの数....
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結果
CD34細胞の品質は、神経幹細胞の形質導入の成功のために重要である。高品質のCD34細胞は、培養の日の最初のカップルの間に増殖し、ちょうど培養容器（ 図1A）の底の上にフローティング、非粘着性、均一に円形細胞として表示されます。拡大と関連が緩んでいる非特定の細胞凝集体は、細胞培養中に発生する可能性がありながら、時間（ 図1B）上で展開する細胞凝集、、で成功した感染の結果。接着細胞は通常、3〜5日、トランスフェクション後の周りに表示されます。彼らは主にバイポーラであり、単層（ 図1C）を作るために増殖します。神経前駆細胞の培地で選択した後、付着細胞のほとんどは、ネスチンおよびSOX2陽性でOCT4陰性（ 図2）である。誘導された神経幹細胞は、ニューロンおよびグリア（ 図3）にさらに分化することができる。
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ディスカッション
直接末梢造血前駆細胞から神経幹細胞を生成するための詳細なプロトコルが提供される。
線維芽細胞と比較して、ヒト末梢血よりアクセス可能である。提示プロトコル以上1×10 5、造血前駆細胞、またはCD34陽性細胞を用いて、全血を10mlから濃縮することができる。血小板の汚染は、通常、予防されないが、それは容易に低速遠心分離によって低減することができ、神経幹細胞の生成を妨害しない。しかし、CD34細胞の質および数は、神経幹細胞の最終的な産生を決定する。 CD34細胞の品質は大きくCD34培地に対するそれらの応答によって判断することができる。肯定応答は、培地中でのCD34 +細胞の急速な増殖を意味し、後で形質転換を成功させるために重要である。 CD34細胞は増殖し、あるいは有意な細胞の損失を受けることができなかった場合は、transformation少ない増殖細胞を生じることが困難となる。したがって、それが唯一の良い品質のCD34細胞の形質転換を開始することが提案されている。 1×10 5 CD34 +細胞は、経験豊富な研究者のために十分であるが、.......
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開示事項
この研究は、NIH の学内資金によって資金提供されています。
謝辞
著者は開示すべき利益相反を持っていません。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| リンパ球分離培地 | Lonza | 17-829E | 1x |
| SepMate | Stemcell Technologies | 15415 | 15 ml |
| ヒト血清 | Invitrogen | 34005-100 | |
| 抗生物質 | Gibco | 15240-062 | 1% |
| CD34 MultiSort Kit | Miltenyi Biotec | 130-056-701 | |
| EDTA | Cellgro | 46-034-Cl | 2 mM |
| MACS LS カラム | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| StemSpan SFEM medium | Stemcell Technologies | 9650 | 1x |
| IMDM | Quality Biologicals | 112-035-101 | 1x |
| TPO | Peprotech | 300-18 | 100 ng/ml |
| Flt-3 | Peprotech | 300-19 | 100 ng/ml |
| SCF | Peprotech | 300-07 | 100 ng/ml |
| IL-6 | Peprotech | 200-06 | 20 ng/ml |
| IL-7 | Peprotech | 200-07 | 20 ng/ml |
| IPS 仙台 リプログラミングキット | Life Technologies | A1378001 | |
| Cell scraper | Sarstedt | 83.183 | |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| CryoTube vials | サーモ | 368632 | |
| Mr. フロスティ容器 | サーモ | 5100-0001 | |
| DMEM/F12 | ライフテクノロジー | ズ 12400-024 | 1x |
| N2 サプリメント | ライフテクノロジー | ズ 17502-048 | 1x |
| ウシ血清アルブミン | Σ | A2934 | 0.1% (w/v) |
| bFGF | Peprotech | 100-18B | 20 ng/ml |
| EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B27 supplement | Life Technologies | 17504-044 | 1x |
| NSC serum free medium | Life Technologies | A1050901 | 1x |
| Poly-D-lysine/laminin coated cover slips | BD Bioscences | 354087 | |
| cAMP | Sigma | A9501 | 300 ng/ml |
| Vitamin C | Sigma | A0278 | 0.2 mM |
| BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | 1x |
| PDGF-AA | Peprotech | 100-13A | 10 ng/ml |
| NT-3 | Peprotech | 450-03 | 2 ng/ml |
| Shh | Peprotech | 1314-SH/CF | 2 ng/ml |
| T3 | Sigma | T6397 | 3 nM |
| PFA | Sigma | P6148 | 4% |
| PBS | Quality Biological | 119-069-101 | 1x |
| ヤギ血清 | ΣG9023 | 4% | |
| TritonX-100 | Σ | T9284 | |
| マウスモノクローナル抗ネスチン | ミリポア | AB5922 | 1:1,000 |
| 抗SOX2抗体 | Applied Stemcell | ASA0120 | すぐに使える |
| マウス抗β;III-チューブリン抗体 | プロメガ | G712A | 1:1,000 希釈 |
| ウサギ抗 GFAP 抗体 | シグマ | G4546 | 1:100 |
| 希釈 抗 O4 抗体 | R&D Systems | MAB1326 | IgM; 1 ng/ml |
| Alexa Fluor 594 ヤギ抗ウサギ抗体 | 生命技術 | A11012 | 1:400 希釈 |
| Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス抗体 | 生命技術 | A11001 | 1:400 希釈 |
| Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス IgM 抗体 | 生命技術 | A21042 | 1:250 希釈 |
| DAPI | Sigma | D9542 | 1 μグラム/ミリリットル |
参考文献
- Azari, H., et al. Purification of immature neuronal cells from neural stem cell progeny. PLoS ONE. 6, e20941(2011).
- Azari, H., Sharififar, S., Fortin, J. M., Reynolds, B. A. The neurob....
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