がん薬感の有効性を評価<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

サマリー

ここでは、腫瘍細胞代謝のリアルタイムモニタリングと、転移のin vivoニワトリ胚絨毛膜-尿膜(CAM)モデルを組み合わせて、腫瘍細胞をDNA損傷化学療法に感作する能力について、新規の抗がん標的/薬剤を評価するために使用されます。

要約

による異質と同じ経路を標的ヒト癌、単剤療法、または併用レジメンに固有の変異のハイレベルに、失敗する可能性がある。重点は、治療への内因性および/または適応耐性に関与している経路の阻害の際に配置する必要があります。研究の活発な分野での作用を促進するDNA修復阻害剤の開発および試験され、そして、一般的に使用される化学療法および放射線療法に対する耐性を防ぐ。我々はDNA損傷薬剤シスプラチンに対して腫瘍細胞を感作するための手段としてBRCA2阻害の有効性を評価するための新規なプロトコルを使用する。腫瘍細胞の代謝（酸性および呼吸）分毎分で治療効果を描写するために72時間にわたりリアルタイムでモニターした。組み合わせでは、血管外遊出および浸潤のニワトリ胚漿尿膜（CAM）モデルを使用して、転移頻度の評価を行った。このプロトコルは、一般的に、新規な癌治療レジメンを評価するために、インビトロおよびインビボの方法を使用するの短所のいくつかに対処する。これは、より密接に候補標的及び薬剤間を区別し、さらなる発展のためには、最も有望な候補を選択するために、そのような細胞増殖アッセイ、細胞死アッセイ、およびin vivoのマウス異種移植研究におけるような一般的な方法に加えて使用することができる。

概要

標的および/ ​​または細胞傷害性癌治療に対する獲得 ​​耐性は治療の失敗、再発、および増加した患者の死亡率¹をもたらすことができる重要な臨床的問題である。ほとんどの腫瘍における不均一性の高いレベルを考えると、十分に高い細胞数の腫瘍は、それらの細胞は生存のために^2,3依存している分子経路を標的とする単一または併用療法に耐性の細胞のサブセットを含むこと数学的確実性である。このような腫瘍細胞は積極的疾患の再発につながる、治療中に選択することができる。同時に治療媒介選択の前または後のいずれかで、異なる癌細胞の生存メカニズムを標的とする新規治療法の開発は、このように臨床的に重要である。

腫瘍ゲノムにおけるゲノム不安定性および突然変異の高レベルは、非腫瘍宿主細胞⁴から癌細胞を区別する基本的な特性である。その結果、usefuDNA損傷化学療法の有効性を高め、抵抗性の発達を防止するために、Lの戦略は、積極的に腫瘍細胞⁵にDNA修復を阻害することである。これは、調査のアクティブなフィールドであり、新規なDNA修復対象の様々な前臨床設定において探索されている。これらの標的の小分子またはアンチセンスベースの阻害剤が開発されているとテスト^6-8を受けている。目的は、最も有望な前臨床候補を特定し、臨床試験におけるそれらの安全性および有効性を評価することである。

臨床試験のコストが高く、（次善の前臨床評価を含む様々な理由のために）失敗のリスクは、新しい治療法⁹の開発に進行する手ごわい障害となっている。十分新しい治療標的および候補薬物を評価するための適切な厳密な前臨床モデルの使用は、臨床試験の¹⁰の高い故障率を減少させることができる。

新規な抗癌療法の有効性を評価するためのいくつかの一般的に使用される前臨床の方法がある： インビトロ （細胞増殖アッセイ） 腫瘍細胞増殖を減少させる能力は、a）測定に対する腫瘍細胞の能力のa、b）療法誘発性の減少フォームの組織培養コロニー（コロニー形成アッセイ） インビトロ （レドックス染料変換） における腫瘍細胞の代謝活性におけるc）治療誘発性の減少、関連するインビトロの腫瘍細胞死（アポトーシス、壊死、オートファジーのd）の治療によって誘導される誘導インビボにおける有糸分裂等^）11、及びe）ヒトおよびマウス異種移植片^12-14の成長またはアブレーションの減少を治療によって誘発される。

記載されているインビトロの方法の主な弱点は、それらのどれも、候補治療法の効果の連続リアルタイム評価を提供しないことである。むしろ、それらは、選択された、広く分離された時点での情報を提供治療の過程。このような測定は、正確に腫瘍細胞応答の大きさおよびタイミングを反映する能力が減少している。 インビボのマウス異種移植モデルは、高コスト、完了するまでの時間の長さは、サブ最適な投与および治療 ​​のタイミング（スケジューリング）の危険性によって制限される。また、齧歯類異種移植モデルは、候補治療的介入への一次ヒト腫瘍細胞および樹立されたヒト腫瘍細胞株の応答^15,16 のインビトロ評価に比べて、ヒトにおける臨床的有効性の限られた予測因子であるという証拠がある。

我々は、上記の一般的な手順の弱点に対処するようにして、前臨床の新しい薬物の組み合わせを評価するための新規な組合せのプロトコルを考案した。増殖、コロニー形成、またはレドックス色素変換アッセイの代わりに、我々は、リアルタイムで、細胞接着、呼吸、および酸性化を分析するために、代謝測定部を利用全体治療期間¹⁷の間に。同時に、我々は、浸潤および転移^18,19のニワトリ胚漿尿膜（CAM）モデルを用いてインビボでの治療の組み合わせの効果を調べた。我々は、一般的に使用される化学療法剤シスプラチンの有効性を増強するBRCA2を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ASO）の能力を評価するためにこれらの方法を使用する。

プロトコル

注：以下のプロトコルは、接着細胞で使用するために設計されました。修飾は、懸濁液中で増殖させた非接着細胞に方法を適用することが必要である。プロトコールに記載されてCAM実験は、蛍光マーカー（ 例えば 、GFP、RFP など ） を発現する細胞で使用するために設計されている。ナイン日齢のニワトリ胚は、CAM実験のための実験プロトコルの2日目に必要とされる。

1.準備およびアンチセンスオリゴヌクレオチドによる腫瘍細胞のトランスフェクション（ASOは）

1. 興味のある細胞を含むT75フラスコ（S）から吸引する媒体は、1×PBSで洗浄し、0.25％トリプシン/ EDTAの2ミリリットルを追加します。各フラスコに完全増殖培地10mlを加え、50mlチューブに溶液中に細胞を移す。細胞をカウントし、最終濃度が1ml当たり^5個の細胞1.0×10になるように音量を調整。
2. T25フラスコのラベルつのグループ：1グループは1-8ラベル8フラスコを、含まれています、とuになりますリアルタイム代謝測定実験のためのsed。第2のグループはまた、8フラスコを含有し、 ニワトリ胚のCAM実験のために使用される。インキュベータ内の各フラスコ場所（37℃、5％CO ₂ O / N）に、溶液中の細胞を2ml加える。
3. 翌朝（0日、時間0）、ラベル3 5ミリリットルのチューブを次のようにコントロール（非標的ASOまたはsiRNA）、「目的の標的」（すなわち 、標的とASOまたはsiRNA）、およびリポフェクタミン2000（または類似のトランスフェクション試薬）。適切なチューブで、無血清培地中で適切な濃度に株式ASOソリューションを希釈する。
   1. 適切なチューブにトランスフェクション試薬の必要量を添加し、5分間、無血清培地中でインキュベートする。 ASOチューブにトランスフェクション試薬溶液を加え、20分間インキュベートする。
4. 各グループ内でのフラスコ1-4のそれぞれに制御ASOトランスフェクション試薬溶液の250μlのを追加し、250各群のフラスコ5-8のそれぞれに「目的の標的」ASOトランスフェクション試薬溶液μlの。 4時間（37ᵒC、5％CO _2）インキュベートする。
   1. インキュベーションの間、2.1節で説明する手順を実行する。インキュベーション後、CAM実験群で各フラスコに、完全培地3mlを追加し、インキュベータO / N（37ᵒC、5％CO _2）に戻る。 セクション2.2の記載に従って代謝の実験グループを処理します。 セクション4の記述に従って設定CAM実験を処理します。

2.バイオセンサーチップの調製と細胞播種

1. 無菌環境では、慎重にPBS400μlの6バイオセンサーチップを洗う。 20分間の70％エタノール400μlのチップを滅菌する。 PBS400μlの3回洗浄する。
   1. 滅菌組織cultur内部のチップを置きますeは皿汚染を防止する。 「コントロール」ラベル皿に3つのチップを置き、「関心の対象」というラベル皿の中の3。
2. 「コントロール」と「目的の標的」として2 50mlチューブにラベルを付けます。 PBSで細胞を洗浄し、0.25％トリプシン/ EDTAの適切なボリュームを追加。単層が外れるまで待ってから、各フラスコから細胞を収集する。適切なチューブに溶液を堆積させる。
   1. 細胞を計数し、最終濃度6.0x10 ⁵細胞/ mlとなるように音量を調整する。初期濃度が低すぎる場合、細胞を遠心分離し、再懸濁する。
3. （チップ当たり1.25×10 ⁵細胞の合計）適切なグループ内の各バイオセンサーチップに細胞溶液の250μlのを追加します。チップの混乱のリスクを最小限に抑えるために、随時、このタスクを1グループを実行します。蒸発を防ぐために、湿度室内にチップを含む滅菌皿を置き、湿度茶を配置mberインキュベーター中でO / N（37ᵒC、5％CO _2）。
4. 翌朝（1日目）は、慎重に各チップから培地を吸引し、0.2％ウシ胎児血清（FBS）および1×ペニシリン及びストレプトマイシン（P / S）を補充した増殖培地を250μlと交換してください。 4時間（37ᵒC、5％CO _2）インキュベートする。

3.代謝測定システム準備及び溶液の調製

1. インキュベーションの間、必要な薬剤溶液と今後の分析のための代謝測定システムを準備する。
   注：代謝測定システムは、6つのモジュールの合計が含まれています。各モジュールは、実験ごとに1つのチップに対応しています。
   1. アッセイの間、車両を受け取るために「コントロール」とグループ「目的の標的」のそれぞれから1チップと、次の実験群に検定を細分化A中に定義された期間のための薬物治療を受けるために、各群から2チップssay、ウォッシュアウト期間中に車両が続く。
   2. 薬物感研究のために、問題の特定の薬剤に合わせて薬物治療の長さ、タイミング、および濃度を変更する。
      NOTE：シスプラチンについては、以下のステップがA549細胞を経験的に決定し、細胞株に依存して変化し得る。 4μL/分のデフォルトの流量ですべての段階を実行します。
      増殖培地+ 0.2％FBS及び1×P / Sの6時間
      培地中の6μMシスプラチンの24時間+ 0.2％FBS、1X P / S
      増殖培地+ 0.2％FBS及び1×P / Sの24時間
      増殖培地+ 0.2％FBS及び1×P / Sの18時間
      0.1％のTriton-Xの4時間
      注：これらの手順からの逸脱は、所望の流量と実験の期間に基づいて、メディアと薬物ソリューションの必要量を決定するための計算が必要になります。以下の節では、上記の工程に基づいている。
2. ラベル増殖培地+ 0.2％FBSのAN 50mlで14 50mlチューブに充填dは1×P / S。また、シスプラチンとのチューブが含まれている第三のチューブラックに1代謝測定システム管ラックに6、別の6、および残りの2を配置します。蒸発を防ぐために、空気透過性膜との最初の二つのラックをシール。
3. 1X P / Sを含む培地+ 0.2％FBS中で（適切なボリュームの）6100μMのシスプラチンの溶液を調製する。 4ラベル5​​0ミリリットルチューブにシスプラチン液の必要量を分注する。
   1. 第三の代謝測定管ラックに残りの4つのスロットにチューブを置きます。チューブは希望biomodulesに対応し、適切なスロットに配置されていることを確認。空気透過性膜を有する管をシール。
4. 準備し、標識6 50mlチューブを20 mlの培地中0.1％のTriton-Xの溶液のそれぞれに、それらを埋める。トリトンX溶液が残った細胞を溶解し、各チップ用の「ゼロ」値を提供する。第四の代謝測定単位管ラックにチューブを配置し、ウィットをシールH過度の蒸発を防ぐために空気permable膜。
5. biomodulesにチップをロードし、実験を開始する。

4. CAM実験薬物治療、注射

注：CAM実験にニワトリ胚を調製するための手順は、手順は他の場所^19に記載されている

1. CAM実験 48時間のトランスフェクション後（2日目）の処理を開始します。 「コントロール」と車両のための2つのフラスコにグループ「目的の標的」、及びシスプラチンのための2つのサブ分割する。吸引し、フラスコから培地を新鮮な培地の3ミリリットル、または6μMシスプラチンのいずれかで補充する。 6時間（37ᵒC、5％CO _2）インキュベートする。
2. 洗った後、培地を吸引し、細胞をトリプシン処理。 4適切に標識15ミリリットルチューブに溶液中のトリプシン処理した細胞を収集します。
   1. PBSで細胞を3回遠心機および洗浄。 5mlのPBSで細胞ペレットを再懸濁する細胞を数えるdは。
   2. 最終細胞濃度が1.0×10 ⁶細胞/ mlとなるように音量を調整する。注射のためにラベル5ミリリットルチューブに細胞溶液を移し、氷上に置きます。細胞が十分に混合されることを保証するために、注射の前に静かにチューブを反転。
3. 注射のための（9日齢）24ニワトリ胚（グループあたり6）の合計を脇に置きます。 1mlシリンジに接続されたフレキシブルチューブに取り付けたガラス針を用いて注射を行う。噴射を行う個人は、治療群を知らされるべきである。
   1. 実体顕微鏡を用いて、CAMの静脈循環に100μlの容量で1.0×10 ^5個の細胞を注入する。細胞のフルボリュームを注入するために遅く、脈動技術を使用してください。柔らかい血液の流れを止めると、任意のこぼれを吸収するためにワイプで注射部位を軽くたたく。適切に各注射後の各胚コンテナにラベルを付けます。
4. 存在感とdistriの確認蛍光顕微鏡を使用してそれらを視覚化することによって注射後のCAMの血管系における蛍光細胞のbution。腫瘍細胞の数が少ない表示され、または配布が悪いされる任意の胚に注意してください。
5. 湿度チャンバー内でニワトリ胚を置き、インキュベーター（37℃、湿度60％）に格納します。転移巣を列挙する前に7-9日間待ちます。

5.転移巣の列挙

1. 7-9日のインキュベーション期間の間、胚を監視し、死んだものを廃棄する。湿度室は、潜伏期間中、常に湿ったままであることを確認してください。
2. 20Xの倍率で蛍光実体顕微鏡を用いて、規則的な格子状パターンで胚CAMの上面全体を走査する。
3. その後胚当たりの最終合計数を集計、各視野における転移病巣の数を数える。各グループの6胚についてそうすることで平均数Oを提供します処置当たりF転移巣。

結果

結果と数字は発表された研究²²からの許可を得て適応さ。

BRCA2阻害は、シスプラチン処理した腫瘍細胞における呼吸の減少を誘導する

BRCA2ターゲティングASOおよびシスプラチンで処理したヒトA549肺癌細胞は、対照ASOとシスプラチン単独を受けた細胞と比較して、呼吸における初期不可逆減少を示した。シスプラチン処理の24時間後にBRCA2 ASOとASOは、細胞を処理した対照との間に呼吸の差は39％（図1A）であった。重要なことは、呼吸のこの減少は、これは、細胞数の変化とは無関係に発生したことを示唆し、細胞接着における検出可能な低下の前に開始した。呼吸は、呼吸の低下が細胞死（図1B）を先行する形成的イベントであることを示唆し、密着性の最初の観察可能なドロップする前に、約10時間を減少し始めた。 ACに差ませんidificationはBRCA2 ASO及びシスプラチン処置は、グルコース代謝（図1C）<...

ディスカッション

による臨床試験に関連する固有のコストとリスクを、十分に新規の抗癌治療レジメンを評価するために、より良く、より厳密な前臨床試験の方法論を開発する必要がある。現在一般的に使用される技術は、潜在的に有望な治療標的/薬剤とを識別する能力を制限し、あまり効果的であり得るものがあり、すべての展示弱点。我々は、従来の方法の欠点の多くに対処する新規な抗癌アプローチを評価するためのプロトコルを考案した。

記載されたプロトコルの特に重要な特徴は、リアルタイムでの細胞応答を測定するための、および分による代謝および付着分の変化を追跡する能力である。これは、ピーク薬物効果の同定、最適用量および薬物組み合わせ治療の成分間の相互作用のより詳細な理解を可能にする。同時に、それはdiscreへの洞察を提供細胞計数、アポトーシス、または色素変換アッセイによって提供されていない情報であり、癌細胞におけるteの代謝の変化、。このアッセイの制限は、正確に、薬物治療中に発生している細胞死のタイプを決定することができないことである。生存率の変化は、バイオセンサーチップへの接着の変化によって反映されるが、これは、細胞死の様式に関...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
A549細胞	ATCC	CCL-185
http://www.atcc.org/products/all/CCL-185.aspx AeraSeal film	Carl Roth GmbH
AMEM	Wisent Bioproducts	210-011-QK
アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド	Avecia		BRCA2 ターゲット配列: 5' - UAAGGAACGUCAAGAGAUAC - 3' (塩基 7241-7259 )
Axio Zoom V16	顕微鏡 Carl Zeiss
http://www.zeiss.ca/microscopy/en_ca/products/stereo-zoom-microscopes/axio-zoom-v16.html Bionas Biosensor	Chips Bionas GmbH and Micronas GmbH	BIS8001D
Bionas Discovery 2500 System	Bionas GmbH
http://www.bionas-discovery.com/prodservices/instruments/system2500/ Cisplatin	Sigma Aldrich	479306
で調達された			受精鶏卵
ウシ胎児血清	Gibco - ライフテクノロジー
ズリポフェクタミン 2000	Invitrogen - ライフテクノロジーズ	12566014
http://www.lifetechnologies.com/ca/en/home/life-science/protein-expression-and-analysis/transfection-selection/lipofectamine-2000.html PBS	Wisent Bioproducts	311-010-CL
トリプシン( 0.25%)/EDTA	Wisent Bioproducts	325-043-CL