方法論記事

のBoc-ALA-ALA-Aspを-S-Bzlのの加水分解：具体的にグランザイムBタンパク質分解活性を測定する比色アッセイ

DOI：

10.3791/52419

⸱

2014年11月28日

 ,  , 
1Cancer Immunology Program, Peter MacCallum Cancer Centre

この記事について

サマリー

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ヒト、マウス、またはラットのグランザイムB（GzmB）のタンパク質分解活性を特異的に測定する、単純で定量的な比色分析法について説明します。このプロトコールは、適切な認識配列を持つ他の合成ペプチド基質の加水分解により、他の顆粒セリンプロテアーゼのプロテアーゼ活性を測定するために容易に適合させることができます。

要約

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セリンプロテアーゼグランザイムB（GzmB）は、細胞傷害性Tリンパ球）またはナチュラルキラー）細胞によって放出されると、標的細胞のアポトーシスを媒介します。GzmBは、ヒトとマウスで最も研究されているグランザイムであるため、研究者は病態生理学におけるその機能と役割を研究するための具体的で信頼性の高いツールを必要としています。そのため、カスパーゼなどのプロテアーゼや、構造的または機能的に関連する他のグランザイムを認識しないアッセイが特に必要となります。ここでは、ペプチドチオエステルBoc-Ala-Ala-Asp-S-Bzlを使用した比色アッセイで、アスパラギン酸残基後の切断に対するGzmBの好みを適用します。GzmBは、この基質を切断できる唯一の哺乳類のセリンプロテアーゼです。この基質は、ヒト、マウス、およびラットのGzmBによって同様の効率で切断されますが、この特性は、他の市販のペプチド基質、この目的に適していると宣伝されているものでさえも共有されていません。このプロトコールは、活性化NK細胞またはCTL由来の未分画ライセートを用いて実証されており、正しいコントロールが使用されていれば、さまざまな原核生物および真核生物系で生成された組換えプロテアーゼにも適しています。このアッセイは、哺乳類リンパ球中の細胞傷害性分子の潜在的なアポトーシス促進活性、およびさまざまな方法論によって発現されるそれらの組換え対応物の潜在的なアポトーシス促進活性を確認するための非常に特異的な方法です。

概要

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グランザイムは、ナチュラルキラー（NK）細胞および細胞傷害性Tリンパ球（CTL）1の分泌リソソームに見出されるセリンプロテアーゼのファミリーである。五つの異なるグランザイムは、ヒト（A、B、H、KとM）で存在し、そしてマウスにおける10（A - G、K、M及びN）2,3。グランザイムAおよびグランザイムB（GZMA、GZMB）が最も豊富であり、広範囲に人間と齧歯類の​​設定で研究されてきた。

GZMBの古典的な機能は、標的細胞の細胞質ゾル4にアクセスするためのグランザイムを可能にする孔形成タンパク質、パーフォリンと組み合わせて実行される、標的細胞におけるアポトーシスの誘導である。 GZMB発現が明確に細胞傷害性リンパ球において見出されているが、最近の研究では、好塩基球6、肥満細胞7、形質細胞様樹状細胞8、およびB細胞9を含むが、ケラチノサイト5に限定されるものではなく、他のGZMBを発現する種々の細胞型に対処されてきた、 10。この文脈では、非アポトーシスGZMB機能は炎症プロセス、組織リモデリングおよび他の免疫調節特性11-14の参加の範囲が明らかになった。

より広範な生物学的役割は、以前に疑われるよりもGZMBのために提案されていることを考えると、研究者は、その検出のための信頼性の高い、特定のツールが必要です。有利なのアスパラギン残基のカルボキシル側で切断するGZMBの特定の要件、真核生物のセリンプロテアーゼ15の中でユニークな特性である。マウス、ヒトおよびラットGZMBしかしマウスGZMBの拡張された基質特異性端子（P1）のAspを有する特定のジェネリック基質は、GZMBによって効率的に切断することができることを意味し、ヒトおよびラット16の両方とは微妙に異なるが、構造的に非常に類似しているすべての3種から、上流のP1のより複雑な配列をもつ他の基材に対し、広く多様な結果を与える可能性があります。過去と最近の李両方でterature、この事実は、注意深く制御、動態試験状況17を修正しようとしているにもかかわらず、いくつかの実験結果の生物学的意義のかなりの混乱や誤解を引き起こした。

本論文では、2つの市販の基板、すなわちのBoc-ALA-ALA-Aspを-SBzlとN-アセチルイルのGlu-Proの-ASP-p-ニトロアニリドを使用して、これらのポイントを説明しようとしてきた。 2つの試薬は、切断（蛍光無料パラニトロアニ対遊離スルフヒドリル）以下の異なる反応基を生成行いますが、これはタンパク質分解的切断には影響何もありません。記載されているプロトコルは、非常に古いプロトコル18の近代的な適応ですが、また、そのようなGZMAやGzmHなど他グランザイム、の活性を検出するための方法論的な枠組みを提供しながら、研究者は、適切に異なるGZMB基板を使用するように助けるべきである。

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プロトコル

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注：脾臓をマウス（6〜10週齢）に由来し、すべての動物実験は、ピーター·マッカラム癌センター（E486）の動物倫理ガイドラインに従って行った。

サンプルの調製。

  1. 活性化したマウスNK細胞の調製。
    1. 市販のキットを用いたネガティブ選択により（GZMB遺伝子ヌル）マウス- / - C57BL / 6またはB6.GrzmBの脾臓の単一細胞懸濁液からの一次ナイーブなNK細胞を単離する。
    2. メーカーのプロトコルに従ってください。簡単に説明すると、磁気的TおよびB細胞、樹状細胞、顆粒球、マクロファージ、およびそれらの特定の表面マーカーに対するビオチン標識抗体を用いて赤血球などの「非NK」細胞を標識する。 「非NK」細胞を枯渇させる抗ビオチンビーズと磁気分離を使用してください。
    3. 培養物を24ウェルプレートに70万細胞/ mlのIL-2（1,000 U / ml）を含む培地中で5~7日間、NK細胞を単離する37時  °C。
    4. あるいは、使用は19 T細胞、OT1 T細胞受容体トランスジェニックマウス20からの一次抗原制限CTLは、CTL分泌GZMB 19の活性を決定するために、活性化NK細胞からの混合リンパ球培養21、または上清中に生成された活性化した。
  2. ヒトNK細胞株および一次NK細胞の単離の維持。
    1. 10％ウシ胎児血清を補充したロズウェルパーク記念研究所（RPMI）培地中のヒトNK白血病（YT細胞）を維持する。代替的に、健康な被験者の末梢血から一次NK細胞を精製し、以前に22を説明したように100 U / mlのIL-2を含む培地中で2~3日間刺激する。
  3. 細胞溶解物を生成する。
    1. PBS（pH7.4）中で細胞を3回洗浄し、次いで、ノニデットP-40溶解緩衝液に懸濁（0.1％NP-40、250のNaCl、25mMのヘペス、2.5mMのEDTA）。理想的には、5×10 6の最小値を溶解7 T細胞>アップ。多くはセリンプロテアーゼの不可逆的阻害剤であるように、プロテアーゼ阻害剤を追加して、そのようなGZMAなどの特定のトリプターゼでしないでください。 20分間氷上でインキュベートし、次いで10分間15000×gで微量で核をペレット化。核ペレットを廃棄し、新しいチューブに上清を移す。
  4. 溶解物のタンパク質濃度を決定します。
    1. そのようなブラッドフォードやビシンコニン酸（BCA）、などの選択肢の市販のプロトコルを使用して、タンパク質濃度を決定する。濃度が〜2 mg / mlの最小であることを確認してください。必要になるまで-20℃で保存溶解物（グランザイム活動は-20℃で何ヶ月も安定している）。

2.グランザイムB活性アッセイ

  1. 試薬の調製
    1. -20＆＃でアリコートに10 mMのDMSO（〜5 mg / mlの）における基板の株式（のBoc-AAD-S-BzlのまたはAC-IEPD-PNA）とストアを準備する176; C。たての作業希釈液を調製及びBoc-AAD-S-Bzlのは、部分的に、DMSO中のストレージに加水分解するとして、それぞれの日の後に捨てる。
    2. -20℃で250 mMのDMSO中の比色試薬（5,5'-ジチオ - ビス（2-ニトロ安息香酸）、DTNB）の株式（0.09グラム/ ml）およびストアを準備します。毎日新鮮な作業希釈を準備します。この試薬は、のみSBzlインジケータグループ、しないのpNAを有する基板に必要です。
    3. 新鮮な緩衝液（0.1M HEPES、0.05 MのMgCl 2、pH7.3）で2〜3週間毎を構成している。
  2. 室温にDTNBと合成基質を持参してください。基質（1：16、 例えばバッファの1.6ミリリットルで100μl）を希釈し、DTNB（1：250、 例えば 2.5ミリリットルバッファ内の10μl）を、よく混ぜる。
  3. 160μlの最終容量までバッファ内の各サンプルの100μgのタンパク質溶解物の最低希釈する。マルチチャンネルピペットを使用すると、 '' U ''底のビニール96ウェルプレートに（〜33.3 /ウェル）三重にウェルあたり50μlを添加する。（また、三重で）「バッファ専用」コントロールを含めます。
  4. のAc-IEPD-PNAを扱う際のサンプル/バッファ制御に希釈しDTNB100μlのを追加します（この手順を省略します。
    注：GZMBにより交流-IEPD-pNAの切断は、直接蛍光性PNA（ 図4B）をリリースします。
  5. その後緩衝液を用いて任意の負の制御を開始し、期待陽性サンプルを終え、すぐに三重の各セットに希釈した基質50μlのを追加するためにマルチチャンネルピペットを使用してください。
  6. プレートリーダーでプレートを置きます。 OD 405 nmでマイクロプレートリーダーでのBoc-ALA-ALA-Aspを-S-Bzlの/ AC-IEPD-pNAの加水分解によるのAspアーゼ活性を測定する。 25の測定値、15秒毎（約6分の合計読み取り時間）を取る、運動アッセイプロトコルを使用してください。
  7. プレートリーダーのソフトウェアがVmaxの値を生成できない場合、手動で基質切断の速度を計算するために、各時点で生成された吸光度測定値を使用する。

ダ3.分析TA

注：生成されたデータは、時間（MOD /分）を超えるODの変化として定義された最大速度として提示される。

  1. データを分析するために、吸光度の変化率から計算される基質切断の最大速度を決定する。通常は、このオプションを持って、プレートリーダーソフトウェアを使用して、これを自動的に行う。
  2. 代わりに手動で、プレートリーダー上で動的アッセイ中に生成される吸光度の変化の速度論的プロットを、表示した後に最も急な直線を与えるデータポイントを選択します。ほとんどのアッセイの最大レートは、アッセイの最初の2分以内に達成される。
  3. 時間間隔によって、この直線と除算で最高OD読み取りから初期ODの読みを引く。統計分析およびグラフィック表示のためのMicrosoft Excel /グラフパッドに生データを転送します。

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結果

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のBoc-AAD-S-Bzlの基板は、GZMBに特異的である

セリンプロテアーゼGZMBは細胞傷害性リンパ球（CTLおよびNK細胞）の主成分であり、そのようなウイルス感染または形質転換細胞などの標的細胞に迅速なアポトーシス死を誘導するのに主に責任がある。これはまた、アスパラギン残基の後に切断するが、プロテアーゼの異なるクラス、システインプロテアーゼファミリー15から選択されたタンパク質中の特定のアスパラギン残基後に切断のための基質優先、カスパーゼと共有属性、によるところが大きい。タンパク質分解機構の違いは、AAD-SBzl任意カスパーゼによって切断されないことを意味する。 GZMB発現が誘導される細胞傷害性リンパ球の酵素活性の活性化の後、これらの細胞（ 図1）から調製した細胞溶解物においてモニターすることができる。グランザイム遺伝子ノックアウトマウスの利用可能性は、私たちはそれを確立することができました合成ペプチド基質のBoc-ALA-ALA-Aspを（AAD） - チオベンジルエステル（S...

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ディスカッション

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歴史的にグランザイムは、標的細胞の急速なアポトーシス死を誘導することができる細胞傷害性リンパ球（CTLおよびNK細胞）の重要なエフェクター分子として同定された。これは主に、アスパラギン酸（D）残基で標的基質分子を切断し、したがって両方の切断プロカスパーゼによってカスパーゼカスケードを活性化することができるだけでなく、それらの下流の標的のいくつかあったGZMBの作用によるものであった。しかし、現在GZMB発現はリンパ細胞傷害性細胞に限定されず、その機能が十分に標的細胞認識および細胞死を超えて拡張できることを理解されたい。

本論文では、つの単純な比色アッセイを用いてマウスおよびヒトCTL / NK細胞の両方に由来する細胞溶解物中のアクティブなGZMBの検出を可能にするプロトコルを記述します。これらの知見によって確認されるように、このアッセイの単純さと特異性は、このプロトコルのアプリケーションが他のソースからの細胞試料にGZMBを調べることができるようにS。しかし、それは細胞溶解物は、少なくとも2mgの/ mlのタンパク質濃度を有し、適切な陽性および陰性対照を実験プロトコルに含まれている...

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開示事項

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著者らは開示するものは何もない。

謝辞

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この研究は、ドイツ研究振興財団（DFG）からMHへの助成金HA 6136/1-1を通じて支援を受けました。JATは、オーストラリア国立保健医療研究評議会(National Health and Medical Research Council of Australia)のプログラムおよびプロジェクト助成金の支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Boc-Ala-Ala-Asp-S-BzlSM Biochemicals LLC、CASMSB05Granzyme B基質(マウスおよびヒト)
Ac-IEPD-pNA SM Biochemicals LLC, CASMPNA009Granzyme B基質(ヒトのみ)
N-α-CBZ-L-リジン-S-BzlSigma-AldrichC3647Granzyme A基質
Suc-Phe-Leu-Phe-S-BzlSM Biochemicals LLC, CASB025Granzyme H基質
5,5'-ジチオ-ビス(2-ニトロ安息香酸) シグマ・アルドリッチD8130DTNB、エルマン試薬
NK細胞分離キット IIマウスMiltenyi Biotec GmbH130-096-892ネガティブセレクションキット
NK細胞分離キット ヒトMiltenyi Biotec GmbH130-092-657ネガティブセレクションキット
プレートリーダーBiorad iMarkBiorad Microplate Manager ソフトウェアバージョン MPM6.3
セロクラスター U底ビニール 96ウェルプレートコーニング、マサチューセッツ州、米国2797

参考文献

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