別のマウス皮膚の領域から細胞蛍光分析のための単一細胞懸濁液の調製

サマリー

皮膚は複雑な免疫細胞ネットワークに生息しています。私たちは、動物の体のさまざまな部分からマウスの皮膚を消化するための効率的な方法論を説明し、単一細胞懸濁液を取得し、フローサイトメトリーによって皮膚に常在するさまざまな白血球集団を分析します。

要約

皮膚は外部環境と相互作用するバリア器官です。潜在的な微生物の侵入に絶えずさらされているため、真皮と表皮は恒常性および炎症状態の両方でさまざまな免疫細胞を収容します。したがって、細胞蛍光分析のために皮膚細胞の放出を得るためのツールは、皮膚に存在する免疫細胞の複雑なネットワークと微生物刺激に対するそれらの応答を研究するために非常に有用です。ここでは、マウスの皮膚を迅速かつ効率的に消化し、単一細胞懸濁液を迅速かつ効率的に得るための効率的な方法論について説明します。このプロトコルにより、表面抗原の発現を損なうことなく、細胞生存率を最大限に維持することができます。また、耳、体幹、尻尾、足パッドなど、さまざまな解剖学的位置から皮膚サンプルを採取して消化する方法についても説明します。得られた懸濁液は、フローサイトメトリーで染色および分析され、異なる白血球集団を区別します。

概要

皮膚は体の最大の器官の一つであり、その大きな表面は絶えず外部環境にさらされています。したがって、皮膚は、物理的手段と潜在的な病原体の侵入に対する積極的な保護を提供することの両方によって、恒常性を維持するために、生物を潜在的な脅威から保護する必要があります。腸や肺の粘膜と同様に、皮膚にはさまざまな免疫細胞があり、免疫監視を維持するために上皮と継続的に相互作用します。 皮膚の免疫細胞と非免疫細胞の両方を含むこの複雑なシステムは、免疫学の初期の頃から認識されており、1978年に「皮膚関連リンパ組織」(SALT)¹という用語がそのような複雑さを説明するために初めて造られました。

皮膚に存在する多数の免疫細胞は、生物が潜在的な侵入と戦うだけでなく、創傷治癒を組織し、自己抗原と皮膚微生物叢に対する耐性を維持するのを助けます^2,3。

皮膚に常在する免疫細胞の中で、樹状細胞(DC)は免疫応答の形成と恒常性の維持に重要な役割を果たし^{ています4。}真皮DCおよびランゲルハンス細胞は病原体の侵入に容易に応答し、リンパ節に移動するとT細胞を活性化し、新たに生成されたエフェクターT細胞に皮膚ホーミング受容体の発現を誘導します⁵。DCは、皮膚の恒常性を調節する上でも基本的な役割を果たしています。恒常性状態で真皮からリンパ節に移動するDCは、主に皮膚抗原^6-8に特異的な制御性T細胞(Treg)の分化を通じてT細胞耐性を誘導する目的で、皮膚隔離抗原を輸送します。

T細胞は、皮膚に最も多く存在する免疫細胞の集団を表しています。彼らは感染中に皮膚に浸潤するだけでなく、皮膚に常在するリンパ球^9,10の中で安定した集団を表しています。CD8⁺とCD4⁺の両方の常在記憶(rm)T細胞は皮膚に存在し、感染後、エフェクターT細胞が血液から動員されるずっと前に応答する可能性があります。皮膚には、皮膚抗原および組織恒常性に対する耐性を維持できる組織常在性制御性Tregの集団も存在します。 これらの細胞は、同族抗原への曝露後に急速かつ強力に活性化されるため、^{メモリーTreg11,12}として定義されています。

DC細胞とT細胞に加えて、NK細胞、γδT細胞、グループ^2ILCs13、肥満細胞、マクロファージなどの多くの自然免疫細胞が皮膚に存在し、宿主の保護に貢献しています。このような複雑な環境を解析するためには、皮膚検体からシングルセル懸濁液を高効率で取得すると同時に、フローサイト蛍光分析やソーティングのための表面マーカーの発現を維持することが必須です。

マウスの皮膚は、主にケラチノサイト、ランゲルハンス細胞、樹状表皮T細胞から構成される外側の表皮層と、その下の真皮層を示します。真皮は免疫細胞の大部分を収容し、コラーゲン繊維、特にコラーゲンIとコラーゲンIVが最も豊富である細胞外マトリックスによって作られています。人間の皮膚とは異なり、マウスの皮膚は毛皮で覆われているため、毛包がより多く生息しています。また、人間の皮膚よりもはるかに薄く、筋肉層であるpanniculus carnosusが含まれており、創傷治癒を助けます¹⁴。これらの特性により、免疫細胞を取り出すために真皮のコラーゲンネットを効率的に破壊することがより困難になります。

この論文では、高純度のコラゲナーゼ1と2とサーモリシンのカクテルに依存する細胞外マトリックスの消化に適した方法を提供します。さらに、異なる領域からの皮膚の分析には異なる実験手順が必要であるため、フットパッド、尾、耳、および体幹から皮膚サンプルを効率的に取得するためのさまざまな方法を示します。次に、DC(MHCII⁺CD11c⁺CD45⁺)、マクロファージ(CD11b⁺F4/80⁺CD45⁺)、CD8⁺、およびCD4⁺ T細胞の存在を評価するために、サンプルを標識します。

プロトコル

研究の承認：実験プロトコルはDecretoに応じた保健のイタリア省（ローマ、イタリア）によって承認された27 gennaio 1992 legislativo、n個。 116「AttuazioneデッラDirettivaのn。609分の86 / CEEでマテリアディprotezioneデッリanimali utilizzati Aフィニsperimentali O広告altriフィニscientifici。」

1.皮膚サンプルを入手

1. 頸椎脱臼によりマウスを安楽死させます。
2. 耳：
   1. マウスの耳の毛のない部分を切り取ります。
   2. 鉗子でそれらを引き離すことにより、独立した背と腹側。静かにピンセットで耳の内側の部分をこすることによって、残りの軟骨を取り除きます。
3. トランク皮膚：
   1. 電気かみそりで、繊細な脱毛ローションで両方の動物の皮膚全体を剃ります。
   2. （2 cm ²で全動物の皮膚まで）所望の皮膚サンプルを遮断。
      1. 全体の背側を切断した場合とVENクトルのマウスの皮膚は、バックした後、マウス本体の周りの毛を剃った領域の境界線に沿って切断し、マウスの真ん中の縦のカットを行います。
      2. 静かに手術用ハサミやメスの閉じラウンドエッジの先端で皮膚のサンプルを分離しながら、鉗子でまだ皮膚サンプルを保ち、腹膜や背中の筋肉から皮膚を分離します。
   3. 氷冷PBSの10ミリリットルを含む100ミリメートル細胞培養プレートを準備します。
   4. ステップ1.3.3で製造したプレートにPBSで皮膚サンプルを浸漬し、鉗子で皮膚試料をこすることによって皮下脂肪を除去します。
4. 尾：
   1. マウスの尾を切り落としました。
   2. 尾の基部から始まり、尾の先端に到達し、手術用はさみまたは外科メスで尾の垂直カットを行います。
   3. 尾から皮膚を分離するために鉗子を使用してください。尾の基部にカットのエッジをつかみ、そっと押さえながら先端に向かって引っ張ります鉗子で尾の体。
   4. 優しく皮膚試料をこすることによって、任意の余分な脂肪を取り除きます。
5. 追いはぎ
   1. 手術用ハサミでマウス全体の足を切り取ります。任意の有毛皮膚を切断回避。
   2. 数字の先頭に縦方向に足首から足の皮膚をカット。
   3. 鉗子で皮膚をつかんながら鉗子でまたは手で足首の骨を持ち、手袋を脱いでいるかのように数字に向かって皮膚を引っ張ります。

2.消化

1. 酵素ミックス（仕様のための材料リストを参照してください）​​300μgの/ mlの、DNAse1 50 U / mlの次のレシピ（材料リストのように調製）ストック溶液から消化カクテルを準備します。 RPMI 5％FBS中で希釈します。
2. （：消化カクテルの2ミリリットル皮膚のあらゆる2 cm ²で、最大3 mlの全トランク肌用）消化カクテルの2ミリリットルと35ミリメートルペトリ皿に小片にハサミで皮膚サンプルをみじん切りに。
3. 90分間37℃でインキュベートします。ゆっくりインキュベーション中のペトリ皿に1-2回振ります。
4. RPMI1640 5％FBSの1ミリリットルを含む66ミリメートルペトリ皿に70μmのセルストレーナーに消化された皮膚試料を注ぎます。
5. RPMI 1640の5ミリリットルの5％FBSでストレーナーを洗ってください。
6. シリンジプランジャと細胞ストレーナーを通して試料を絞ります。
7. フラッシュプランジャー、RPMI1640 5％FBSの20ミリリットルとペトリ皿とストレーナ、50ミリリットルチューブに移します。

3.抗体とラベリング

1. PBS、1％FBS（またはBSA）の5ミリリットルで二回得られた懸濁液を洗​​ってください。
2. 所望の抗体で得られた細胞懸濁液にラベルを付けます。
   1. 100μlのサンプルを再懸濁/ PBS、1％FBS中で希釈したaCD16 / CD32（クローン2.4G2）を2μg/ mlを含むミックスのサンプル。
   2. Fc受容体を介して、所望の抗体の非特異的結合をブロックするために4℃で15分間インキュベートします。
   3. 表に示した抗体を追加します。1。
      1. 4μg/ mlの濃度でPBS、1％FBSを100μl/サンプル中の所望の抗体を希釈ミックスを調製します。
      2. チューブに、2μgの/ mlの最終濃度で抗体混合物200μlの容量が存在することになるように、各サンプルにステップ3.2.3.1で準備ミックス100μlのを追加します。
   4. 4℃で30分間インキュベートし、光から覆います。
3. PBS、1％FBSの1ミリリットル、400×gで5分間の遠心分離で洗浄し、PBS、1％FBSの300μlの上清および再懸濁を捨てます。
4. 2μg/ mlの最終濃度でDAPIを加え、10分間、光から保護し、4℃でインキュベートします。
5. FACSによって得られた試​​料を分析します。
   1. 白血球を単離するために、以下のゲーティング戦略を使用します。
      1. まずDAPI-集団に対してゲートすることによって、任意の死細胞を排除します。
      2. 図1に示すように、FSCのWプロット対FSC-Aにシングレットを選択。
      3. ゲート関心の白血球の典型的な大きさと細かさに基づいてセル。
      4. 図1に示すようにFSC-CD45プロットでCD45 +細胞を選択します。
   2. 次のように、表面マーカーの発現によって、白血球の異なる集団を区別する。
      1. CD11c ⁺ MHC II ⁺細胞としてDCを識別します。これらは、後でCD207-皮膚樹状細胞からのランゲルハンス細胞及びCD207 +皮膚樹状細胞を区別するためにCD207の発現について分析することができます。
      2. CD64 + F4 / 80 +細胞としてマクロファージを識別します。
      3. CD19 + MHCII +細胞などのB細胞を識別します。
      4. CD8 +またはCD4 +細胞のようなT細胞を識別します。

結果

体のさまざまな部位からの皮膚は、標識した抗体を用い説明し、染色されたプロトコルに従って消化しました。ゲーティング戦略は、まずシングレット（FSC-W対FSC-A）にし、リンパ球の形態（SSC-A対FSC-A）を持つ細胞でライブ後、細胞（DAPI-細胞）、ゲートを選択し、図1に示されています。示された場合に、造血起源のCD45 ^+細胞が選択されます。

DCは、マクロファージは、F4 / 80 ⁺ CD64 ⁺ CD45 ⁺ CD4 ⁺ CD45 ⁺のようなCD19 ⁺ CD45 ⁺ MHCII ⁺細胞、CD4 ⁺ Tリンパ球のような細胞、B細胞として同定される、抗CD11cの、-MHCII、および-CD...

ディスカッション

我々は、異なるマウス皮膚領域からの単一細胞懸濁液を調製するための方法を記載しています。我々が採用した消化の方法は、高い収率を与えるだけでなく、その後のFACS分析のために基本的な表面マーカーの発現を維持するだけでなく。

コラゲナーゼIおよびIIおよびサーモリシンのカクテルの使用は、この方法は、再現性の高い作り酵素活性のバッチの違いに最小バッチを保証します。他の公表された方法は、異なる酵素カクテルに依存しているが、我々の手で、彼らはより低い収率を与えると、もっと重要なのは、あまり再現性があります。私たちの方法は、しかし、表皮の移植細胞と真皮を移植する細胞を区別しません。多くの場合、それは、これら2つの異なる区画を区別することが有用である可能性があるため、我々はこのような方法を使用して、これらの以前の作品を読者に指示します^。15

我々の経験の皮膚試料中の耳と尾からの皮下グリース層は、徹底的に酵素カクテルに真皮にアクセスできるようにするために掻き取られなければならないトランク皮膚よりも消化しやすくなります。脱加...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Reagents
Supplemented RPMI 1640 medium			RPMI1640 / L-glu、ペン連鎖球菌、ベータメルカプトエタノールPBS
FBS
リベラーゼTM(酵素ミックス)	ロシュ	5401119001	再懸濁液を添加[2.5 dH2Oのmg / ml];-20 °C
Dnase I	Sigma	D4263-1VL	再懸濁液 (血清なし) [1,000 U/ml]
Materials
手術用ハサミ
外科用鉗子
外科用メス
66 mm シャーレ
100 mm シャー
70 & マイクロ;m Cell Strainers	BD	352350
Digestion cocktail			Dilute in RPMI 5% FBS
Lberase TM			300 & micro;g/ml
DNAse1			50 U/ml
抗体
名前	Company	Clone	Label
>aCD45.2		104	PE-Cy5.5
aCD11c		N418	PE-Cy7
CD11b		M1/70	FITC
F4/80		A 3-1	APC-Cy7
aCD4		Gk1.5	APC-Cy7
aCD8		53-6.7	PE
aCD64		X54-5/7.1	PE-Cy7
aCD207		4C7	APC