CXCR6.Gfpレポーターマウスを使用して、健康で罹患肝臓における免疫細胞の長期生体内多光子顕微鏡イメージング

サマリー

肝臓の免疫細胞の安定した生体内高解像度イメージングは困難です。ここでは、マウス肝臓内の免疫細胞の遊走と細胞間相互作用を、インテンシブケアモニタリングと組み合わせた生体内多光子レーザー走査型顕微鏡法と組み合わせた長時間(約6時間)にわたって研究するための高感度で信頼性の高い方法を提供します。

要約

傷害に応答して肝臓の炎症は、単球、好中球、T細胞サブセット、B細胞、ナチュラルキラー（NK）およびNKT細胞を含む白血球の異なるサブタイプの浸潤を伴う非常に動的なプロセスである。免疫細胞の遊走を監視するための肝臓の生体内顕微鏡起因試料調製及び固定、光学分割および長期動物の生存に関して高い要件に特に困難である。しかし、炎症過程の動力学ならびに細胞の相互作用の研究は、より良好な炎症性肝疾患の開始、進行および退行を理解するために重要な情報を提供することができる。したがって、高感度で信頼性の高い方法は、集中治療と組み合わせて生体二光子レーザー走査顕微鏡（TPLSM）で長時間（約6時間）マウスの肝臓に移行し、異なる免疫細胞の細胞間相互作用を研究するために設立された監視。 ENT ">提供される方法は、穏やかな調製および器官の最小の摂動と肝臓の安定した固定を含み、長期生体内イメージング最大6時間の期間にわたって事実上退色や光毒性効果を多色多光子顕微鏡を用いて、トラッキングを可能にする特定の白血球サブセットの、及び安定した撮影条件によるマウスの重要なパラメータと循環、温度およびガス交換の安定化の大規模な監視する。

肝臓の炎症の際のリンパ球の遊走を調べるためには、ノックインマウスCXCR6.gfpベースライン条件下および四塩化炭素（CCl _4）の腹腔内注射（複数可）によって誘発される急性および慢性肝障害の後に生体内肝臓イメージングに供した。

、ナチュラルキラー（NK） - - このようなCD4 T細胞などのTリンパ球のサブセットでなく、粘膜associ CXCR6、主にナチュラルキラーT（NKT）上で、リンパ球上に発現されるケモカイン受容体であるatedの不変（MAIT）T細胞^1。 CXCR6.gfp ⁺免疫細胞の回遊パターンと位置決め後の肝臓損傷の際、変更された行動を詳細に洞察力、したがって、疾患の進行におけるそれらの潜在的な関与を許可。

概要

細胞や器官全体での細胞機能、さらには生物全体の可視化は、本体²の事実上すべての部分を含め、50年以上のために大きな関心となっている。そのため、いくつかの初期の研究では、すでに肝臓^3,4の生体内イメージングを採用。しかし、いくつかの制限が肝組織の長期安定した高解像度画像に関する最新に存在する。

によるダイアフラムおよび胃腸管⁵との密着肝臓の解剖学的位置に、微細な生体イメージングのための最も一般的な問題は、呼吸による動きと、より少ない程度に、腸管の蠕動⁶である。他の固形臓器と比較して、肝臓手術は特に困難である。による緻密な微小血管構造のために、外科的処置は、大規模な出血性病変を引き起こす障害微小^7、また居住者のiの活性化できそのようなクッパー細胞⁸としてmmune細胞。したがって、組織の機械的固定は^6,9は生体顕微鏡イメージングに干渉する可能性がある他の場所で公開されている。

健康な肝臓では、全血液量の10〜15％は、肝血管系内に存在し、臓器循環の変化（ 例えば 、血圧変動の影響を非常に受けやすい臓器をレンダリングする、全体的な心拍出量¹⁰の約25％を受け取る）。したがって、過度の組織処理または集中循環により、例えば 、せん断応力、変位、損傷に対する肝臓の血流の途絶は、同様に肝臓の免疫応答に影響を与え、白血球遊走行動における人為的な変更、障害、肝酸素したがってさらに肝臓の損傷につながる臓器保存および動物の全体的な生活時間など。

初期の微視的研究は、生体内エピ蛍光MIに基づいていたcroscopy、そのような光退色および低い浸透深さのようないくつかの技術的な制約は、長期の肝臓イメージング^4,11,12のためのこの技術の使用を制限する。この新しい方法は、現実の状況^13-15の下に、ほぼすべての臓器においてイメージング研究を実行することが技術的に可能であったように、1990年代の多光子顕微鏡の発展に伴い、フォト漂白または侵入深さの制限は主に、解決された。しかし、肝臓イメージングに対する主残された課題であった：いくつかの時間の¹⁶のより長い期間の呼吸運動、肝臓組織の自己蛍光、肝類洞に不変の血流を確保し、特に安定したイメージング。

いくつかの研究は、肝臓¹⁷における様々な白血球の機能および移動に対処し、 例えば 、NKT細胞^18-20、T細胞^21,22、肝臓マクロファージ^23,24または好中球^25、長期多メートルもののicroscopyイメージングはまだ成功し、さらに難しい既存の損傷に起因する急性または慢性の肝疾患を有する動物におけるタスク及び更なる損傷²⁶に、したがってより高い感受性を確立されていなかった。しかし、リアルタイムで回遊行動と肝臓の白血球の細胞機能を監視することは、肝臓の恒常性と疾患²⁷において、その特定の役割で小説洞察を可能にする。

ケモカイン受容体CXCR6は、ナチュラルキラー（NK）細胞、NKT細胞、およびいくつかのT細胞集団^18,28を含むいくつかのリンパ球サブセット上で発現される。マウスでの以前の研究は、CXCR6とその同族リガンドCXCL16が恒常性の間に肝正弦波にNKT細胞のパトロールを制御することができることが示されている。したがって、（CXCR6座に緑色蛍光タンパク質[gfpを]のノックインを運ぶ）CXCR6.gfpマウスの使用は、脳²⁹のような種々の器官でのリンパ球の遊走を調べるために記載されているまた、肝臓^18,20は 、炎症時にCXCR6.gfp細胞の浸潤を増加を示す。

この研究で提供される方法では、安定化条件下で長期間にわたりこれらのプロセスに従うことが可能であった。生体多光子ベースの手順は、動物や器官の最小限の摂動と高度に再現性があったイメージングを可能にした。呼吸と循環の開閉制御に続く大規模な監視により、長期的な動物の生存のために最適化。と非常に柔軟で、腎臓や脾臓などの他の実質臓器にも採用しやすい。

プロトコル

注：実験は、動物の保護に関する（NIH出版、第8版、2011年）「実験動物の管理と使用に関する指針」及び指令63分の2010 / EU以下の動物実験を支配するドイツの法律に従って行った科学的な目的（欧州連合官報、2010）に使用される。公式許可は政府の動物の管理と使用オフィス（LANUVノルトラインヴェストファーレン、レックリングハウゼン、ドイツ）から付与されました。

注：短期画像化のために省略することができる手順の準備時間を削減し、外科的プロトコルを簡略化するアスタリスク（*）が付いています（ 例もショット、3-Dスタックまたは短期間のタイムラプス顕微鏡をスナップ）。必要に応じて、しかし、生存期間が顕著に減少する場合の撮像には、広範囲の監視および制御を循環することなく行うことができる。

1.顕微鏡のセットアップと手術前の準備（5-10マイルN）

1. （顕微鏡、パワーラボ、レーザー、加熱パッド、気象室、Webカム、シリンジポンプ装置、人工呼吸器）上のスイッチシステム。
2. イソフルラン蒸気と設定イソフルランレベルへのO ₂供給が1.5体積％に接続します（V / V）、小動物人工呼吸器に接続します。
   1. 短期間のイメージングのために、唯一の初期腹腔内麻酔誘導後、イソフルランを用いて麻酔を維持し（ステップ2.2参照）。次いで、安定な肝臓微小循環を保証するために2巻の％（v / v）のイソフルランを使用して、2時間未満に撮像時間を維持する。
3. 150〜200μLの容量で120〜140呼吸サイクル/分に呼吸を設定します。
4. マウスのアガロース段階を設定します。 40°の角度でディッシュ（約10cm×15センチベース）に注ぐこと、3％（w / v）アガロース100mlのを準備する。
5. 必要な機器を収集外科作業領域を設定します。微生物感染を防ぐために、w / vのSekuseptフォルテSの1％溶液（9.9％を使用して器具を消毒する5分です。v、ホルムアルデヒド/ w）の、グルタラール9.8％実験（ 図1A）の前に。
6. 残りの成分を得る：皮膚消毒剤（ 例えば 、10％ポビドンヨード溶液）、肝臓ステージ（スタック·ブリッジ）、アガロース溶液（3％（w / v）のPBS中の）5％、シリンジポンプ（w / v）のグルコース溶液を麻酔液I（ケタミン0.1mg / mlの、キシラジンを0.5mg / mlのフェンタニル5μg/ ml）を、綿棒、n-ブチル-2- Cyanoacrylat、及び1×PBSで（G-5）、シリンジポンプ。予熱のインキュベーション室にアガロース段階ディッシュを入れてください。

2.気管切開（10〜15分）

1. 25〜28グラムの重さ、家の繁殖でからC57BL / 6マウスを使用してください。 12時間明/ 12時間暗サイクルで、温度と湿度が管理された環境でのハウスFELASAガイドラインに従って特定病原体フリーの条件下ではマウス、。動物に標準マウス食餌（スニフ標準的なげっ歯類食）と水を自由に無料でアクセスを許可します。
2. initによってマウスを麻酔IAL腹腔内麻酔液II（ケタミン0.1 mg / mlの、キシラジン1 mg / mlの、ブプレノルフィン10μg/ ml）を250μlの内（ip）注射。
   1. *生体内撮像中維持費のために、継続的に連続的な腹腔内注射により麻酔液Iを投与し（ケタミン0.1mg / mlの、キシラジンを0.5mg / mlのフェンタニル5μg/ ml）を0.2ミリリットル/時間の流量でシリンジポンプ装置を使用して吸入イソフルラン0.5巻の％との組合せ（v / v）である。
   2. 5分後の反射神経をチェックします（ 例えば鉗子でフットパッドピンチ）、気管切開のために皮膚を消毒、マウスは外科トレラント麻酔状態にある場合の準備を開始。
   3. （ 図1B）を乾燥から角膜を防ぐために、目の保護クリーム（ 例えば 、デクスパンテノールは50mg / g）を適用します。
3. 四肢のために粘着テープを使用して腹側を露出する準備テーブルの上にマウスを固定。穏やかに、この位置に固定する、例えば 、首を引き伸ばし、ゴムバンドを使用して、tはフック切歯O。
   1. 綿棒で消毒剤を適用することにより、ポビドンヨード溶液を用いて、皮膚や毛を消毒する。
4. 直接顎の下に、最初の皮膚カット（0.5〜長さ1cm）を実行する（ 図1C）
   1. 慎重に唾液腺（ 図1D）との間に結合組織を解剖。
   2. 慎重に開いている筋肉の管周囲の気管（ 図1E、F）を引き裂く。
5. 後で換気チューブの固定（ 図1G）のための気管の下に外科スレッドを置きます。
   1. T字型の切開を行う軟骨リング間のマイクロハサミでオープン気管（ 図1H）
6. 切開（〜0.5センチメートル）を介して気管内に換気チューブを置きます。 、前方のチューブをプッシュ小さな解剖鉗子で尾方端をつかみ、ゆっくりと気管にチューブを前進させるために（ 図1I）
7. 外科糸でチューブを固定（ 例： 、5-0）;偶発depositioning（ 図1J、K）を避けるために、皮膚の管の第2頭蓋固定を行う。
8. シールは、組織接着剤（ 例えば 、n-ブチル-2- Cyanoacrylat）（ 図1L）で切断した。
9. 粘着テープを使用して先頭にチューブを固定する。

3.開腹（15〜20分）

1. 低体温症を防ぐために加熱パッド上にマウスを置きます。腹部を剃る、慎重に皮膚から毛を取り除く。ポビドンヨード溶液を用いて剃毛した皮膚や毛を消毒。
2. 外科用ハサミ（ 図2A）を使用して、胸骨の下にある小さな皮膚カットを行います。出血を防ぐために、すべての可視血管を焼灼、両側に横方向に肋骨の下にカットを拡張します。
3. 慎重に腹膜（ 図2B）を開く、胸骨下の白線の小さなカットを行う。 cauterizを使用して両側にカットを拡張ationが（ 図2C、D）を出血を防ぐために。
4. アガロース段階皿（ 図2E）にマウスを置きます。マウス（通常は12〜14カバースリップ）（ 図2F）の両側に適切な高さのスタックを置きます。
5. 呼吸に顕微鏡を同期させるために背中の上部の下に呼吸トリガーセンサを配置します。トリガーユニット（ 図2G）をアクティブにします。
6. リブ（ 図2I）を後退させる胸骨を通して外科糸（5-0）を配置します。
7. 慎重に湾曲した外科用ハサミを使用して、肝臓および横隔膜（鎌状靱帯）、ならびに肝臓および胃腸管を連結する靭帯を切断する。大動脈（ 図2J）まで鎌状靭帯をカット。

4.サンプルのセットアップ（10〜15分）

1. 大型肝葉へ簡単にアクセスするための45°の角度で右側にマウスを置きます。
2. 腹部をカバーし、肋骨下のステージングブリッジを追加します。空洞。鋭いエッジ（ 図2K）を覆うように粘着テープ被覆を有する標準カバースリップを使用してブリッジを製造する。
3. ステージ上で大規模な肝葉を置きます。慎重にダブルボールスタイラスプローブまたは肝臓下のパッド入りのへらをスリップし、湿った綿棒やウェットティッシュを使用して臓器の上部を保持する。スライド上に葉を持ち上げて、穏やかなドラッグを適用します。ローブは曲げたり折り畳むことができる。肝臓（ 図2L）の唯一の穏やかな操作に余分なケアを提供する。
4. 例えば 、小さなカバースリップ（20ミリメートル×20ミリメートル）、その横に肝葉のほぼ同じ高さの山がカバースリップをサポートするために、横方向のサポートステークスを、置きます。
5. 肝葉に大きなカバースリップ（24ミリメートル×50ミリメートル）を配置します。そのカバースリップは、（ 図2M）できるだけ水平に配向されていることを確認してください。
   注：カバースリップは、それを圧迫することなく、組織と接触しているべきである。血流障害（白組織）の目に見える兆候を確認してください。 microcirc場合、ulationが破壊され、さらに支援する株式を追加します。
6. *長期の麻酔およびG-5アプリケーションのために二つの独立した腹腔内カテーテル（ 図2N）を配置します。次の後肢に下腹部に横方向にカテーテルをインストールします。
   注：腹腔カテーテルは柔 ​​軟なシリコーンチューブ（ 図3）27 G針を接続して自作することができる。
7. *皮膚に5-0外科用糸のループを有する固定する針が偶発的変位を回避する。
8. * I 1カテーテルする麻酔溶液とシリンジポンプを取り付け、0.2ミリリットル/時間に設定された流量、カテーテル2にG-5とシリンジポンプを取り付け、0.1ミリリットル/時に流量設定。

5.マウスの監視

1. *場所のECGフロントに電極および後肢四肢（ 図4A）。
2. * ₂レベルセンサをCOに有効期限のチューブを取り付けます。
3. （ 図4Cの熱パッドに接続された外部温度センサを追加する）。

6.埋め込み、組織固定（5〜10分）

1. 1X PBSにアガロース（w / v）の3％の100ミリリットルを準備します。温度を5 mlシリンジと18 G針（ 図5A）を用いて41°Cである場合に肝臓を埋め込 ​​む。
2. （ 図5B、C）カバースリップ上で、マウスの周りに残っているアガロースを注ぐ。アガロースが完全に糊化するまでお待ちください。
3. 準備肝葉（ 図5D、E）をスキャンするために十分なviewfield大型の準備、ハイデマンのへらを使用して余分なアガロースを削除します。

7.イメージング

1. 顕微鏡気候室にマウスを転送します。
2. 1×PBS（37℃に予熱した）の50〜100ミリリットルを追加します。
3. 蒸発（ 図5F）を防止するために試料皿をカバーしています。
4. * 0.5体積％（V / V）に吸入イソフルランを減らします。
5. *、ソフトウェアを監視するECG、心拍数及び呼気CO _2の記録_を開始。
6. イメージングを起動します。オープンラのSerシャッター、Z-スタックの上限と下限を定義し、関心のビューのフィールドを識別し、時間経過の記録を開始。必要に応じて、Z-ドリフト（ 例えば 、血液の圧力または温度変動の変化に、 図（5G）を補正するために、Zスタックを再調整する。
   注：撮像期間終了後、または動物の循環や麻酔が不安定になった場合、（麻酔からの覚醒せず）頸椎脱臼によりマウスを生け贄に捧げる。

結果

私たちの生体内TPLSMアプローチを検証するために、我々は生体内TPLSMイメージングにCXCR6の^{GFP / +}マウスを受ける。マウスは、いずれかのベースライン対照として未処理のまま、または急性肝障害^20を誘導するために四塩化炭素（CCl _4）の単回腹腔内注射を行った。

ビデオシーケンスは、2-5時間の期間にわたり採取し、細胞は、それらの緑色蛍光を経時的に追跡した。一般的な細胞運動性を表示するには、手順の間に検出されたすべてのトラックは、重畳画像（ 図6A）としてプロットした。ベースライン条件下で細胞が中心静脈に向かって肝臓類洞に沿って長距離の移動を示したが、18時間のCCl ₄処置後CXCR6 ^{+ / gfpの細胞}は、既に部分的に損なわれた運動パターンを示した。いくつかの高速移動の細胞はまだ、肝臓類洞に存在したが、いくつかの焦点領域が、その細胞で見ることができた傷害の領域に細胞を募集し走化性応答を示す、ローカルスキャンにランダム移行から...

ディスカッション

我々の研究の目的は、肝臓の生体TPLSMイメージングのための高度に標準化された安定した再現性のある方法を開発することであった。一般的に、生体内イメージングは​​、開発、恒常性および疾患における異なる白血球集団のホーミングとの相互作用を、以下の実際の生活条件の下で細胞挙動に貴重な洞察を与えている。しかし、呼吸器および腸の蠕動運動を直接他の固形臓器と比較して、肝臓、ならびにそれらの高い脆弱性に送信される起因れる肝臓のやや困難な解剖学的位置は、安定した長期生体内イメージングのためのいくつかの課題を課した。ここ数年、マウスでの多くの実験研究が常駐から主要な貢献や浸潤単球/マクロファージ^30-32、好中球³³または様々なリンパ球サブセット^34,35と、負傷した肝臓²⁸中の免疫細胞浸潤の非常に動的な性質を明らかにした。しかし、Mこれらのデータのレオナは、エンドポイント分析（ 例えば 、多色、動物を犠牲にした後にフローサイトメトリー）から誘導した。今まで唯一の少数の研究は、多色生体内イメージングを用いて肝臓の炎症の際に携帯トラフィックのダイナミク...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
麻酔薬
Buprenorphine	Essex Pharma	997.00.00	Analgeticum、0.1 mg/kg
Fentanyl	Rotex Medica	料金: 30819
Fluovac 麻酔システム	ハーバード装置	34-1030
グルコース 5%	Braun
ISOFLO (イソフルラン蒸気) 気化器	アイケマイヤー	4802885
イソフルラン	フォレンアボット	B 506
アイソトニック(0.9%)NaCl溶液	デルタセレクトGmbH	PZN 00765145
ケタミン10%	セバ	電荷:36217/09
キシラジン2%	メディスター	電荷:04-03-9338 / 23
消耗品
20ミリリットルシリンジ	BD Plastipak
250 ml 三角フラスコ	Schott Duran	21 226 36
25 ml ビーカー 2x	Schott Duran	50-1150
2 ml シリンジ	BD Plastipak
4-0 Vicryl 縫合糸	Ethicon	V7980
アガロース	市販の
Bepanthen Eye と鼻軟膏	Bayer Vital GmbH	6029009.00.00
Change-A-Tip Deluxe High-Temp Cautery Kit	Fine Science Tools Inc.	18010-00
綿ガーゼ綿棒	Fuhrmann GmbH	32014
スリップ24x50 mm	ROTH	1871
ラポアシルクテープ	3M	1538-1
羽使い捨てメス	羽02.001.30.011
ファインボアポリエチレンチューブ0.58 mm ID	スミス医療	800/100/200
ヒストアクリル	ブラウン	1050052	5x 0.5 ml
ロイコプラスト	BSN Medical Inc.
顕微鏡スライド	ROTH	1879
アルコールHaut…farblos Antisepticum	Antiseptica GmbH	72PAH200
ステリカン針 18 G x 1	B. ブラウン	304622
ステリカン針 27 3/4 G x 1	B. ブラウン	4657705
		ティッシュペーパー	市販
手術器具
アマルガム バーニッシャー 3PL	ギャッツ	0110?
ブレアリトラクター(4芯(鈍い))x2	ルツ&クライン	S-01134
デュモン No.7 鉗子	ファイン・サイエンス・ツールズ社	91197-00
Graefe鉗子湾曲x1	ファインサイエンスツール株式会社	11151-10
グレーフ鉗子ストレート x2	ファインサイエンスツールズ株式会社	11050-10
ハイデマン スパチュラ HD2	ストーマ	2030.00
ニードルホルダー Mathieu	Fine Science Tools Inc.	12010-14
シザー	ファインサイエンスツールズ株式会社	14074-11
Semken鉗子	ファインサイエンスツール株式会社	11008-13
湾曲した小型手術用ハサミ	Fine Science Tools Inc.	14029-10
小型手術用ハサミ ストレート	ファイン・サイエンス・ツールズ社	14028-10
標準パターン鉗子	ファインサイエンスツールズ株式会社	11000-12
Vannas春はさみ	ファインサイエンスツール株式会社	15000-08
機器
ECG トリガーユニット	ラピッドバイオメディカル	3000003686
MICROCAPSTAR 呼気終末二酸化炭素分析装置	AD 機器
Minivent Typ 845	ハーバード大学装置	73-0043
多光子顕微鏡 Trimscope I	LaVision
Perfusor Compact	B. Braun
PowerLab 8/30 8チャンネルレコーダー	ADインスツルメンツ	PL3508
温度制御加熱パッド	Sygonix	26857617
温度センサー	comercially available
用温度制御システム -Cube&ボックス	ライフイメージングサービス