小さなRNAおよびリボソームの占有の調節の役割を調査する方法<em&gt;熱帯熱マラリア原虫</em

サマリー

ヒトマイクロRNAは、宿主赤血球から熱帯熱マラリア原虫に移行します。ここでは、合成マイクロRNAを宿主赤血球にトランスフェクションし、熱帯熱マラリア原虫からすべてのRNAを単離するために使用される技術について説明します。 さらに、この論文では、寄生虫転写産物のリボソーム占有率と翻訳電位を決定するための熱帯熱マラリア原虫のポリソーム単離方法について詳しく説明します。

要約

鎌状赤血球対立遺伝子（HBS）を担当する遺伝的変異は 、P、マラリア原虫による感染に抵抗するために赤血球を可能にします熱帯熱マラリア原虫 。多因子性であることが知られており、この抵抗の分子的基礎は、完全には理解されたままです。最近の研究では、遺伝子調節や寄生虫の成長の両方に影響を与え、一度マラリア原虫に転位、赤血球マイクロRNAの発現差異ことがわかりました。これらのmiRNAは、後寄生虫mRNAの控えめなサブセットと5 'RNAの融合を介してキメラRNA転写物を形成することによりmRNAの翻訳を阻害することが示されました。ここで、技術はPの遺伝子調節および翻訳可能性に赤血球マイクロRNAの基礎となる機能的役割と推定されるメカニズムを研究するために使用されたこと熱帯熱マラリア原虫 、宿主赤血球に変性合成マイクロRNAのトランスフェクションを含め、詳細に説明します。最後に、ポリソーム勾配法は、TRAの程度を決定するために使用されますこれらの転写物のnslation。一緒に、これらの技術は、私たちは赤血球マイクロRNAの調節不全のレベルは鎌状赤血球の細胞固有のマラリア耐性に寄与することを実証することができました。

概要

属マラリア原虫のアピコンプレクサ寄生虫によって引き起こされるマラリアは、世界的に毎年約200万人が感染し、約60万死亡^{1を引き起こし} 、最も一般的な人間の寄生虫疾患です。ヒトに感染するマラリア原虫 5 種のうち、ヒトの疾患に最も関連があるP.熱帯熱マラリア原虫と P.彼らの広範囲の分布および重症マラリアの合併症の可能性のために三日熱マラリア原虫 、。マラリア原虫のライフサイクルは蚊と人間の両方の感染を必要とします。感染した蚊が人間をかむときに、寄生虫は複製の最初のラウンドが発生し、肝臓への血流を通って移動します。ホスト肝細胞からのメロゾイトが破裂した後、彼らは無性や性的いずれかの複製を開始し、近くの赤血球に感染します。 Pに 48時間持続する複製の無性段階、それはほとんどの発作の原因でもあるので、 熱帯熱マラリア原虫は 、この研究の焦点でありますアリアの症状とは、簡単に、in vitroで再現されています。

改善された抗マラリア治療を含む公衆衛生の取り組みの数は、多少グローバルマラリアの負担を低減しているが、薬剤耐性寄生虫の継続的な出現は、マラリア対策への取り組みのための問題を提起します。新しい治療法を提案することができる1つの領域は、遺伝的変異がマラリアに対する耐性を付与する方法、各種の研究です。マラリア流行地....

プロトコル

1：Pから小型RNAの単離IDCの間に熱帯熱マラリア原虫

1. 無性文化^29にマラリア原虫を取得します。
   注：必要な培養サイズは、所望の用途に基づいて変化します。しかし、3〜5％の寄生虫血と5％のヘマトクリットで10ミリリットルの文化は、リアルタイムPCR（RT-PCR）のための十分なRNAを提供します。技術は当初、非同期の文化のために最適化されたが、感染サイクル中の特定の時点が所望されるとき、リング段階の寄生虫は、遅くとも10〜12時間後に侵攻よりソルビトール同期で同期することができません。同期は1サイクル（約48時間^）29の後に繰り返す必要があります。
2. プールは一緒に細胞を感染させた（3〜5％の寄生虫血で〜5×10 ⁹個のRBC）と赤の細胞をペレットにブレーキなしで5分間800×gでチューブと遠心分離機の上部に冷PBSを埋めます。
3. 遠心分離した後、添付、慎重に吸引ピペットを用いて上清を除去し真空に、赤血球ペレットので、取り除くことは容易です。冷たい1×PBSでもう一度、ペレットを洗浄します。
4. 氷上で30分間再懸濁した細胞（1×PBS中）の冷0.15％サポニンでペレットと場所。
5. 4℃で12分間、1,500×gで遠心分離細胞は、冷PBSで（色が暗赤色になります）、上清とペレットを再懸濁しを削除します。もう一度この手順を繰り返します....

結果

P.中のヒトマイクロRNAのグローバルプロファイリング熱帯熱マラリア原虫

ここに提示された技術は、様々な条件に寄生虫からマイクロRNAを抽出するために使用されました。もう一つ注意すべきは、多くの場合、この記事を最初の研究²⁹の双方に提示マイクロRNAデータの基準点を務め^32に示すように、非感染赤血球のためのRNA抽出を行ったということです。これらの以前の研究はまた、HBSS赤血球は、特に、特定のmiRNAのはるかに高いレベルを有したmiR-451ことを実証しました。上に示された技術は、HbSを（のHBAまたはHBSS）感染寄生虫におけるmiRNA豊富の変化を実証するのに十分でした。上に示さおよび18SのrRNAに対して標準としてRNAサンプルを抽出しました。 HBSS赤血球の寄生虫のサンプルは、例えば、のmiR-451（ 図1）を含むいくつかのマイクロRNAのレベルの有意な増加を示さありません。ホストerythrからのmiRNAの取り込みocyteも以前の研究

ディスカッション

HbSを、それがPによって引き起こされる重症マラリアに対する保護を提供する主な理由、マラリア流行地域で最も一般的なヘモグロビン変異体の一つであります熱帯熱マラリア原虫 。 P.の遺伝子調節におけるヒトマイクロRNAの役割を特徴づけるために必要な技術熱帯熱マラリア原虫は、この原稿全体に詳述されています。すべての低分子RNAを含むような方法で総RNAを抽出し、かつ比較的簡単寄生虫溶解手順を実行することにより、これらの融合RNAは、独立した、種々の技術により同定することができました。

これらの手順は比較的簡単ですが、適切に従わない場合の問題、汚染に敏感です。寄生虫抽出中、ホスト赤血球を汚染除去するためのサポニンの溶解を行うことが重要です。これは、RNA単離のサポニン溶解工程中に特に当てはまります。宿主赤血球のmiRNAの成分は、大きさGの数オーダーでありますほとんどの赤血球が感染していないことに部分における寄生虫のよりreater、それは、できるだけ多くの赤血球汚染を除去することが重要です。 （感染サイクルの特定の.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬-すべての試薬はRNAseフリーでなければなりません.
ジエチルピロカーボネート	Sigma	D5758	DEPC
DEPC 処理水 (試薬のセットアップを参照)
Yoyo-1 DNA 蛍光色素	Thermo Fisher
Gene Pulser II エレクトロポレーター	Bio-Rad
0.2 cm エレクトロポレーションキュ
4 M 酢酸カリウム	Mallinckrodt	6700
2 M HEPES カリウム	Σ	H0527	pH 7.2
1 M 酢酸マグネシウム	Σ	M-2545
1 M ジチオスレイトール	研究製品 国際	D11000	DTT
100 mM フェニルメチルスルホン酸フッ化物	Σ	P7626	PMSF、イソプロパノールに溶解
10% (v/v) Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	I3021
10% (w/v) デオキシコール酸ナトリウム	Sigma	D-6750	DOC
シクロヘキシミド	Sigma	C-7698	CHX
ショ糖	Mallinckrodt	8360-04
RNAseOUT (Invitrogen, カタログ番号 100000840)	Invitrogen
RPMI-1640 w/ L-グルタミン	Cellgro	10-040-CV
10% AlbuMAX I	Invitrogen	11020-039	w/v in sterile
water Gentamicin	Gibco	15750-060
HT supplement (100x) (Invitrogen, カタログ番号 11067030)
45% (w/v) スクロース (Sigma, カタログ番号 G8769)
1 M HEPES緩衝液(Gibco、カタログ番号15630-080)
1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS;セルグロ、ネコ。No. 2109310CV)
コーニング500 ml真空フィルターフラスコ(VWR、カタログ番号430769)
スライドガラス(VWR、カタログ番号48311-702)
ギムサ染色(50X)(VWR、カタログ番号m708-01)
mirVana miRNA単離キット(Ambion、ThermoFisher Scientific)。
5' ビオチン標識成熟 miRNA (配列は目的の miRNA により異なる) (Dharmacon)
ビオチン粉末 (Sigma-Aldrich)
1 M 塩化
ストレプトアビジンセファロース高性能ビーズ (GE Healthcare)
リボソーム再懸濁バッファー (試薬のセットアップを参照)
溶解バッファー (REAGENT SETUP を参照)
15% (w/v) ショ糖勾配溶液 (REAGENT SETUP を参照)
50% (w/v) ショ糖勾配溶液 (REAGENT SETUP を参照)0.5
M スクロースクッション (REAGENT SETUP を参照)
60% (w/v) スクロースチェイス溶液 (REAGENT SETUP を参照)
マラリア原虫細胞培養培地(REAGENT SETUP参照)
RNA capture Wash Buffer (REAGENT SETUP参照)
RNA Elution Buffer (REAGENT SETUP参照)
REAGENT SETUP
Solutions
<ストロング>マラリア原虫細胞培養培地
500 ml RPMI-1640 w/ L-グルタミン
0.5 ml ゲンタマイシン
5 ml HT サプリメント
2.5 ml 45% グルコース
25 ml 10% AlbuMAX I
12.5 ml 1 M HEPES
0.2mm真空フィルターフラスコ付き滅菌フィルター
Plasmodium細胞培養培地に10x CHX
上記のPlasmodium細胞培養培地と同じレシピで、以下のものを加えます:
2 mMシクロヘキシミド
培地を通常どおりに調製し、CHXを最終濃度2 mMまで添加してろ過します。
シクロヘキシミド
PBSを1x PBSに新たに添加し、最終濃度200 mMまで添加し、使用まで4OCに保ちます。
<ストロング>リボソーム再懸濁バッファー
400 mM酢酸
25 mMカリウムHEPES、pH 7.2
15 mM酢酸
200 mMシクロヘキシミド(新鮮を追加)
1 mM DTT(新鮮を追加)
1 mM PMSF (新鮮に添加)
40 U/ml RNaseOUT (新鮮に添加)
Lysis buffer
上記のリボソーム再懸濁バッファーと同じレシピで、
0.5%(w / v)DOC
スクロース溶液
上記のリボソーム再懸濁液と同じレシピで、さまざまな量のスクロースを添加します:
15%(w / v)スクロースを追加して15%スクロース勾配溶液
を作成します50%(w / v)スクロースで50%スクロースグラジエント溶液
0.5Mスクロースで0.5Mスクロー
上記のように、シクロヘキシミド、DTT、PMSF、およびRNaseOUTを新鮮に添加する必要があります。
60% スクロース チェイス溶液は、ショ糖と水のみを必要とし、他の成分
60% (w/v) スクロースを DEPC 処理水中に含まない 60%
RNA Capture Wash Buffer
20 mM KCl
5 unit/ml Rnase Out (Invitrogen)
RNA Capture Elution Buffer
RNA Capture Wash Buffer と同じレシピに、
2 mM ビオ
EQUIPMENT
SW55 Ti超遠心ローター(Beckman、カタログ番号342194)
SW41 Ti超遠心ローター(Beckman、カタログ番号331362)
Ultra-ClearTM ½ SW55(Beckman、カタログ番号344057)
用2インチ(13 x 51 mm)超遠心チューブポリアロマー 9/16 x 3 ½SW41(ベックマン、カタログ番号331372)
L8-80M超遠心分離機(ベックマン)
スチール鈍器シリンジ針、4インチ、16G(アルドリッチ、カタログ番号Z261378)
1 mlシリンジ、27 G½針(ベクトン・ディキンソン、カタログ番号309623)
5 mlシリンジ(ベクトン・ディキンソン、カタログ番号309646)
パラフィルム
チューブローテーター、エンドオーバーエンド
マイクロ遠心分離機、冷蔵
密度勾配分画システム(Teledyne Isco、カタログ番号69-3873-179)
TracerDAQ(Measurement Computing)
Eppendorf 5810R遠心分離機
エッペンドルフA-4-81ローター(エッペンドルフ、カタログ番号022638807)

ベット100000840カリウム。シクロヘキシミドを含む<ストロング>1xカリウムマグネシウム1% (v/v) Igepal CA-630 を添加を作るスクッションを作る スクロース溶液チンを追加