神経伝達物質を光学的に検出するための細胞ベースの神経伝達物質の蛍光エンジニア記者の建設（CNiFERs）<em&gt;インビボ</em

サマリー

私たちは、体積、神経伝達物質の放出を光学的に検出するための細胞ベースの神経伝達物質の蛍光工学レポーター（CNiFERs）を作成するためのプロトコルを提示します。

要約

細胞ベースの神経伝達物質の蛍光は記者（CNiFERs）は、光学的に生体内で脳内の神経伝達物質の放出を検出するための神経科学者のための新しいツールを提供する設計さ。特定CNiFERは、ヒト胚性腎臓安定特定のGタンパク質共役型受容体を発現する細胞、G _qを_{/ 11}のGタンパク質に結合し、FRETベースのCa ²⁺ -detector、TN-XXLから作成されます。受容体の活性化は、FRETシグナルの増加をもたらします。 CNiFERクローンは、 例えば 、ドーパミンD2Rを特定の神経伝達物質のための天然受容体を使用しているためCNiFERsはnMの感度および秒の時間応答を持っています。 CNiFERs直接in vivoでの体積透過を測定するように最適未満、せいぜい100人ミクロンの空間分解能で神経伝達物質の放出を検出するためにそれらを可能にする、脳内に注入されます。 CNiFERsもViに潜在的な交差反応性のために他の薬剤をスクリーニングするために使用することができますVO。我々は最近_{、G、I / O} Gタンパク質へのGPCRにそのカップルを含めるようにCNiFERsの家族を拡大しました。 CNiFERsは、アセチルコリン（AChの）、ドーパミン（DA）およびノルエピネフリン（NE）を検出するために利用可能です。任意のGPCRはCNiFER小説を作成するために使用することができることを考えると、ほぼヒトゲノム中の800のGPCRがあることを、我々は、設計実現、およびCNiFERのいずれかのタイプをテストするために、ここで一般的な手順について説明します。

概要

完全ニューロンが脳内でどのように通信するかを理解するためには、 生体内での神経伝達物質の放出を測定するための方法が必要です。 生体内で神経伝達物質を測定するためのいくつかのよく確立された技術があります。 1つの一般的に用いられる技術は、カニューレが脳に挿入され、脳脊髄液の少量を採取し、高速液体クロマトグラフィーおよび電気化学的検出^1を使用して分析された微小透析です。微小透析は、直径200μmのマイクロプローブのための〜0.5ミリメートル、 例えば 、プローブのいくつかの直径のオーダーの空間分解能を持っています。この技術の時間分解能は、しかし、一般的に約5分または¹より長く続くサンプリング間隔に遅いです。さらに、分析はリアルタイムで行われていません。別の技術は、脳に挿入されたカーボンファイバープローブを使用して、高速走査サイクリックボルタンメトリー（FSCV）、です。 FSCVは、優れた温度を持っています経口解像度（サブ秒）、高感度（ナノモル）、および5〜30μmのプローブ径の空間分解能。しかし、FSCVカーボン電位差プローブ²の電圧との特性を酸化還元プロファイルを生成する送信機に限定されます。

神経伝達物質を測定するための第3の技術は、遺伝的にコードされた神経伝達物質（NT）バイオセンサ³を介して直接です。この方法で、融合タンパク質は、....

プロトコル

本研究で実行されるすべての動物の手順は、制度的動物実験委員会（IACUC）のガイドラインに従っていると、マウントサイナイ医科大学とカリフォルニア大学サンディ​​エゴ校のIACUCsによって承認されています。

1. HEK293細胞を形質転換するためのレンチウイルスのGPCRを発現生成

1. 商業的供給源、 例えば 、cdna.orgから特定 ​​のGPCRのcDNAを取得します。あるいは、PCRを用いたcDNAライブラリーからGPCR遺伝子を増幅します。このようなpCDH-CMV-MCS-EF1-プーロ（pCDH）などのレンチウイルス発現ベクターを得ます。 DNAを伝達するだけでなく、レンチウイルスを生成するには、このベクターを使用してください。
2. PCRによるレンチウイルス発現ベクターにGPCRのcDNAをクローニングします。 PCRサブクローニングの詳細については、ローレンツ^8を参照^してください。
3. 展開し、製造元の指示に従ってエンドトキシンを含まない「マキシ」プレップキットを用いて、GPCR-pCDH DNAを精製。 pCDHがmutation-あるにGPCR cDNAをサブクローニングしていることを確認しDNA配列決定により無料。
   注：前にウイルス産生のためのDNAを提出し、インサートとDNAの純度の大きさを確認するために、適切な制限酵素で一定分量を消化。
4. 。例えば、ソ....

結果

特定のGタンパク質共役受容体（GPCR）と遺伝的にコードされた[Ca ^2+]センサ、TN-XXL：CNiFERを安定少なくとも二つのタンパク質を発現するように操作されたヒト胚腎臓（HEK293）細胞から誘導されます。 TN-XXLは、Ca ²⁺イオン^6,15に対応して、それぞれ、シアンおよび黄色蛍光タンパク質間の蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を受けるのeCFPおよびシトリン。内因性G _qをGタンパク質に、その夫婦のGPCRの活性化は、の[Ca ^2+] PLC / IP ₃経路を介し、TNXXLのCa ²⁺検出器からのFRETの増加につながる（ 図1）細胞質ゾルの増加を誘発します。

ディスカッション

CNiFERsの作成 ​​は、光学的にin vivoでの脳内の神経伝達物質の放出を測定するための革新的でユニークな戦略を提供します。 CNiFERsは、理想的には、神経伝達物質、すなわちシナプスリリース、体積伝導を測定するのに適しています。重要なことには、各CNiFERは、脳内の神経伝達物質のレベルの変化の生理学的な光学的測定を提供する、天然のGPCRの特性を有します。現在までに、CNiFERsはアセチルコリンを検出するために作成されている^{（M1-CNiFER）6、}ドーパミン^{（D2-CNiFER）7}およびノルエピネフリン^{（α1A-CNiFER）7。}

原則として、CNiFERは、GPCRを介して信号の任意の神経伝達物質のために作成することができます。 G _qをGタンパク質を介して、GPCR信号は、さらなる変更がHEK293細胞に必要とされない場合には。 _{I / O、}但し、Gの_qi5キメラGタンパク質の共発現を必要とす.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
pCDH-CMV-MCS-EF1-ぷろ	System Biosciences	CD510B-1	ニング:レンチウイルスを生成するため
12 x 75 *BD Falcon High Clarity ポリプロピレン丸底試験管	BD Biosciences	352063	FACS
BD 40 um Falcon cell strainers	BD Biosciences	352340	FACS
0.05% トリプシン EDTA	Invitrogen	25200056	FACS
96ウェルプレート、平底、透明	コーニング	3596	FACS
96ウェル細胞培養プレート	コーニング	CLS3997	Flexstation
Optilux ブラッククリアボトム	コーニング	3603	Flexstation
Flexstation ピペットチップ	Molecular Devices	9000-0911	Flexstation
アセチルコリン塩化物	シグマ・アルドリッチ	A2661	フレックスステーション
ノルエピネフリン	Sigma-Aldrich	A7256	Flexstation
ドーパミン塩酸塩	シグマ・アルドリッチ	PHR1090	フレクステーション
GABA	Sigma-Aldrich	A2129	フレクステーション
ヒスタミン	Sigma-Aldrich	H7125	フレックスステーション
グルタミン酸	Sigma-Aldrich	49621	フレックスステーション
エピネフリン	Sigma-Aldrich	E4642	フレクスステーション
ソマトスタチン	シグマ・アルドリッチ	S1763	フレックスステーション
5HT	シグマ・アルドリッチ	H9523	フレックスステーション
VIP	アルファ・ダイアグノスティックス社	SP-69627	フレキ
シン オレキシン	A アルファ ダイアグノスティックス(株)	12-p-01	フレクステーション
サブスタンス P	Sigma-Aldrich	S6883	Flexstation
アデノシン	Sigma-Aldrich	A4036	Flexstation
Melatonin	Sigma-Aldrich	M5250C	Flexstation
蛍光プレートリーダー & ソフトウェア	Molecular Devices	Flexstation 3	Flexstation
DMEM(高グルコース)とグルタマックス	ライフテクノロジーズ	10569-010	組織培養
ウシ胎児血清	Life Technologies	10082-139	組織培養
ペン/溶連菌感染症 抗生物質	Life Technologies	15140-122	組織培養
ピューロマイシン	InvivoGen	ant-pr-1	組織培養
フィブロネクチン	Sigma-Aldrich	F0895	組織培養
CoolCell LX アルコールフリー速度制御細胞凍結ボックス	Bioexpress	D-3508)	組織培養
シアノアクリレート接着剤	ロックタイト	ロックタイト No. 495	手術と脳定位注射
プラスチック パラフィン フィルム	VWR	パラフィルム®	手術と脳定位固定装置注射
ナノインジェクター	ドラモンド	3-000-204	手術と脳定位固定装置注射
ガラス電極	ドラモンド	3-000-203G	手術と脳定位注射
ハンドヘルドドリル	OSADA	Exl-M40	手術と脳定位注射
ドリル用バリ	ファインサイエンティフィック	19007-05; 19007-07)	手術と脳定位注射
滅菌浴	FST	18000-45、ホットビーズ滅菌器	手術および固定装置注射
ソフルランチャンバー/マスク	ランド医療機器	564-0427、HME 109イソフルラン気化器、O2流量計、ギャングバルブ付きテーブルトップ麻酔器; 564-0852、誘導チャンバー16X7X7.5cm	手術および脳定位注射
3Dスコープ、アーム	ツァイス		手術および脳定位注射
光ファイバー光			手術と脳定位固定装置注射
ベタジン			手術と定位固定装置注射
70%(v / v)イソプロピルアルコール			手術と定位注射
ポビドン-ヨウ素準備パッド	ダイナレックス	1108	手術と固定装置注射
NaCl 0.9%(注射、USP、918610)			手術と定位注射
シクロスポリン(注射、USP)			手術と脳定位固定剤注射
ブプレネックス(注射)ブプレノルフィン(0.03 μg per g げっ歯類)	Sigma-Aldrich		手術と定位固定剤注射
科用軟膏	Akorn	NDC 17478-235-35	手術と脳定位注射
Surgifoam	エチコン		手術と定位注射
グリップ歯科用セメント	Dentsply	#675571、675572	手術と脳定位注射
Instant SuperGlue	NDindustries		の手術と脳定位固定剤注射
LOCTITE 4041			の手術と脳定位注射
METABOND	C&B		手術と脳定位注射
0号カバーガラス	フィッシャー		手術と脳定位注射
脳定位固定器フレーム	Kopf		手術と定位固定装置注射
直腸プローブと加熱パッド	FHC	40-90-8D、DC温度コントローラー、40-90-2-06、6.5X9.5cm加熱パッド40-90-5D-02、直腸サーミスタプローブ	手術とイメージング用固定装置注射
光学ブレッドボード	Thorlabs		手術と定位注射
鉱物油	フィ	ッシャーS55667	手術と脳定位固定剤用注射
Kwik-Cast(シリコーンエラストマー)	World Precision Instruments		の手術と脳定位固定剤注射
用縫合糸	エチコン	18''、1667、4-0	手術と脳定位固定装置注射
はさみ	ファインサイエンティフィックツール	91500-09、15018-10	手術と脳定位注射
Forcepts	Fine Scientific Tools	11252-30;#55、11295-51;グラフ、11050-10	手術と脳定位固定装置注射
学生 ハルステッド-蚊止血剤	ファイン サイエンティフィック ツール	91308-12	手術と定位注射
小血管焼灼器キット	ファイン サイエンティフィック ツール	18000-00	手術と脳定位注射
ホットビーズ滅菌器 ファイン	サイエンティフィック ツール	18000-45	手術と脳定位注射
シリコンマット付きインスツルメントケース	ファインサイエンティフィックツール	20311-21	手術と脳定位注射
シリコンマット付きプラスチック滅菌容器	ファインサイエンティフィックツール	20810-01	手術と脳定位注射
in vivoイメージング用2P固定ステージ蛍光スコープ	オリンパス	FV1200 MPE	in vivoイメージング
多光子レーザー	SpectraPhysics	Mai Tai DeepSee	in vivo イメージング
グリーンレーザー	オリンパス	473 nm レーザー	in vivo イメージング
xy トランスレーショナルベース	Scientifica	MMBP	in vivo イメージング
FRETフィルターキューブ YFPおよびCFP用	オリンパス		in vivoイメージング
10倍および40倍水浸対物レンズ	オリンパス		in vivo イメージング
エアテーブル	ニューポート		の生体内イメージング
カスタムビルドの軽量ケージ	Thorlab		生体内イメージング

クローイハイ眼