神経伝達物質を光学的に検出するための細胞ベースの神経伝達物質の蛍光エンジニア記者の建設（CNiFERs）インビボ

サマリー

私たちは、体積、神経伝達物質の放出を光学的に検出するための細胞ベースの神経伝達物質の蛍光工学レポーター（CNiFERs）を作成するためのプロトコルを提示します。

要約

細胞ベースの神経伝達物質の蛍光は記者（CNiFERs）は、光学的に生体内で脳内の神経伝達物質の放出を検出するための神経科学者のための新しいツールを提供する設計さ。特定CNiFERは、ヒト胚性腎臓安定特定のGタンパク質共役型受容体を発現する細胞、G _qを_{/ 11}のGタンパク質に結合し、FRETベースのCa ²⁺ -detector、TN-XXLから作成されます。受容体の活性化は、FRETシグナルの増加をもたらします。 CNiFERクローンは、 例えば 、ドーパミンD2Rを特定の神経伝達物質のための天然受容体を使用しているためCNiFERsはnMの感度および秒の時間応答を持っています。 CNiFERs直接in vivoでの体積透過を測定するように最適未満、せいぜい100人ミクロンの空間分解能で神経伝達物質の放出を検出するためにそれらを可能にする、脳内に注入されます。 CNiFERsもViに潜在的な交差反応性のために他の薬剤をスクリーニングするために使用することができますVO。我々は最近_{、G、I / O} Gタンパク質へのGPCRにそのカップルを含めるようにCNiFERsの家族を拡大しました。 CNiFERsは、アセチルコリン（AChの）、ドーパミン（DA）およびノルエピネフリン（NE）を検出するために利用可能です。任意のGPCRはCNiFER小説を作成するために使用することができることを考えると、ほぼヒトゲノム中の800のGPCRがあることを、我々は、設計実現、およびCNiFERのいずれかのタイプをテストするために、ここで一般的な手順について説明します。

概要

完全ニューロンが脳内でどのように通信するかを理解するためには、 生体内での神経伝達物質の放出を測定するための方法が必要です。 生体内で神経伝達物質を測定するためのいくつかのよく確立された技術があります。 1つの一般的に用いられる技術は、カニューレが脳に挿入され、脳脊髄液の少量を採取し、高速液体クロマトグラフィーおよび電気化学的検出^1を使用して分析された微小透析です。微小透析は、直径200μmのマイクロプローブのための〜0.5ミリメートル、 例えば 、プローブのいくつかの直径のオーダーの空間分解能を持っています。この技術の時間分解能は、しかし、一般的に約5分または¹より長く続くサンプリング間隔に遅いです。さらに、分析はリアルタイムで行われていません。別の技術は、脳に挿入されたカーボンファイバープローブを使用して、高速走査サイクリックボルタンメトリー（FSCV）、です。 FSCVは、優れた温度を持っています経口解像度（サブ秒）、高感度（ナノモル）、および5〜30μmのプローブ径の空間分解能。しかし、FSCVカーボン電位差プローブ²の電圧との特性を酸化還元プロファイルを生成する送信機に限定されます。

神経伝達物質を測定するための第3の技術は、遺伝的にコードされた神経伝達物質（NT）バイオセンサ³を介して直接です。この方法で、融合タンパク質は、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）フルオロフォア⁴のベースペアまたは順列GFP ⁵に接続された送信機のリガンド結合ドメインを含むように作成されます。前の2つの方法とは異なり、これらのバイオセンサーは、遺伝的にコードされ、トランスジェニック動物の産生を介して、または急性の細胞に感染するウイルス剤の使用と、そのようなニューロンとして、宿主細胞の表面に発現しました。現在までに、遺伝的にコードされたバイオセンサーは検知情報のために開発されていますグラムグルタミン酸やGABA ^3-5。これらの技術に関する制限事項は、nM範囲の低感度、およびGタンパク質共役受容体（GPCR）を介してシグナル例えば送信機、古典的な神経伝達物質、神経ペプチドおよび神経修飾物質、多数のに検出を拡張することができないことでした。実際には、ヒトゲノム中に約800のGPCRがあります。

これらの不足に対処するために、我々は、GPCRを介して信号の任意の神経伝達物質の光学的に測定するリリースに革新的なツールを開発しました。 CNiFERs（セル・ベースの神経伝達物質の蛍光が記者を設計し）が刺激され、特定のGPCRを発現するように操作クローンHEK293細胞であり、遺伝的にコードされたFRETベースのCa ²⁺センサで検出された細胞内の増加の[Ca ^2+]をトリガーTN-XXL。したがって、CNiFERsは、直接、リアルタイムの光Rを提供する、蛍光の変化に結合神経伝達物質受容体を変換します地元の神経伝達物質活性のEADアウト。指定された神経伝達物質のための天然受容体を利用することにより、CNiFERsは化学的特異性、親和性および内因的に発現される受容体の時間的なダイナミクスを保持している。これまでに、我々はドーパミンを検出するためのCNiFERs、M1受容体を使用してアセチルコリンを検出するための1つの、1の3種類を作成しましたD2受容体を使用して、α1A受容体^6,7を使用して、ノルエピネフリンを検出するための1。 CNiFER技術は、GPCRのいずれかのタイプにそれが影響を受けやすい作り、容易に拡張可能かつスケーラブルです。このJoveの記事では、我々は説明し、任意のアプリケーションのためのin vivoでの CNiFERs で 、設計を実現するための方法論、およびテストを説明します。

プロトコル

本研究で実行されるすべての動物の手順は、制度的動物実験委員会（IACUC）のガイドラインに従っていると、マウントサイナイ医科大学とカリフォルニア大学サンディ​​エゴ校のIACUCsによって承認されています。

1. HEK293細胞を形質転換するためのレンチウイルスのGPCRを発現生成

1. 商業的供給源、 例えば 、cdna.orgから特定 ​​のGPCRのcDNAを取得します。あるいは、PCRを用いたcDNAライブラリーからGPCR遺伝子を増幅します。このようなpCDH-CMV-MCS-EF1-プーロ（pCDH）などのレンチウイルス発現ベクターを得ます。 DNAを伝達するだけでなく、レンチウイルスを生成するには、このベクターを使用してください。
2. PCRによるレンチウイルス発現ベクターにGPCRのcDNAをクローニングします。 PCRサブクローニングの詳細については、ローレンツ^8を参照^してください。
3. 展開し、製造元の指示に従ってエンドトキシンを含まない「マキシ」プレップキットを用いて、GPCR-pCDH DNAを精製。 pCDHがmutation-あるにGPCR cDNAをサブクローニングしていることを確認しDNA配列決定により無料。
   注：前にウイルス産生のためのDNAを提出し、インサートとDNAの純度の大きさを確認するために、適切な制限酵素で一定分量を消化。
4. 。例えば、ソーク・インスティテュートで1、ペンの大学として、ウイルスコア機能を使用してレンチウイルスを生成し、またはノースカロライナ大学等 、または社内⁹生成します。 T75フラスコ中でHEK細胞のトランスフェクションのためにエンドトキシンフリーDNAの約25μgの（>を1μg/μl）を使用してください。 〜1.8の吸光度比_（260 / A _280）を有する、DNAは高純度であることを確認してください。
   注：ウイルスの力価〜10 ^{11〜10 12} GC / mlをHEK293細胞の形質導入のために最適です。

2. インビトロで培養するためのHEK293 / TN-XXLバックボーンセル・タイプの選択

注：Gタンパク質結合特異性を決定し、 例えば _{、G、I / O、G のq / 11、}またはG _の Gタンパク質、GPCRの、このDICなどGタンパク質キメラがCNiFERのために必要とされているかどうかをtates。 例えば G _qを共役型受容体、M1ムスカリン受容体については、HEK293 / TN-XXLバックボーンHEK293細胞型として（＃3G8）を選択します。 _{G、I / O}共役型受容体は、キメラGタンパク質Gの_qi5は ^10を必要とされています。 G _sの共役型受容体は、Gの_QS5キメラは^10を必要とされています。このプロトコルでは、D2R CNiFERの構成は一例として使用されています。 _{I / Oの} Gタンパク質およびGを介して、D2R信号を安定キメラGタンパク質、Gの_qi5、 例えば 、HEK293 / TN-XXL / Gの_qi5は _＃qi5.6を発現するHEK293細胞を必要とします。

1. 研究室からHEK293 / TN-XXL / Gの_qi5 _＃qi5.6クローン細胞を取得します。注：クローン細胞を、以下、HEK293 / TN-XXL G _qを共役型受容体に対する（＃3G8）、HEK293 / TN-XXL / Gの_{qi5（＃qi5.6）G}用の_{I / Oの}共役型受容体、およびHEK293 / TN -XXL / G _{QS5（＃qs5.47）G の}共役型再用ceptors、要求^6,7に応じて自由に利用可能です。
2. 成長し、HEK293増殖培地（ 表1）5mlでT25フラスコに〜qi5.6に_＃90％の密集度をHEK293 / TN-XXL / Gの_qi5を展開_します。 5％（v / v）のCO _2、37℃の加湿インキュベーター中で細胞を増殖させます。
   注：HEK293細胞を培養すると、すべての作業は、標準的な無菌の組織培養技術を用いて実施されるべきです。
3. 最初のT25フラスコから培地を吸引することにより、HEK293細胞を採取します。 5mlのPBSを添加し、フラスコを揺動により穏やかに細胞を洗浄。
4. PBSを削除し、0.05％（w / v）のトリプシン/ EDTA（ 表2）の1ミリリットルを追加します。 CO _2（v / v）の5％、37℃で1~2分間インキュベートします。
5. 細胞を収集し、15ミリリットルコニカルチューブを無菌するために転送します。細胞培養遠心分離機1,000×gで5分間遠心します。上清を吸引除去します。
6. HEK293増殖培地5ml中の細胞ペレットを再懸濁します。使用して、血球計数器で細胞を数えますトリパンブルー。細胞密度を計算し、ステップ3に進んでください。

HEK293 / TN-XXL / Gqi5細胞の3レンチウイルス形質導入

1. 0.7×10 ⁶ HEK293 / TN-XXL / Gの_qi5細胞をT25フラスコをシード。後の約1日、50％コンフルエントになるまで〜5％（v / v）のCO ₂を有する37℃の加湿インキュベーター中で細胞を増殖させます。残りの細胞を凍結（8.2から8.3ステップ）。これらの細胞は、 すなわち 、CNiFERコントロールとしてGPCRを欠いCNiFERを提供します。
2. 感染の日に、HEK293増殖培地（ 表1）を2mlの全量ミリリットル〜10 ⁹ GC /最終濃度レンチウイルス（ステップ1.4）を発現するGPCRを希釈します。例えば、T25フラスコに2ミリリットルのメディアに10 ¹¹ GC / mlのウイルスの20μlを添加します。
   注：ウイルス力価情報は、ウイルスコア施設によって提供されるべきです。遠心管にレンチウイルスとメディアを組み合わせて、静かに粉砕します。 lentivの高力価irusはバイオセーフティーレベル2（BSL-2）です。
3. T25フラスコから培地を吸引除去します。ステップ3.2からウイルス/メディアは、混合物の2ミリリットルを追加します。 5％（v / v）のCO _2、37℃でT25フラスコO / Nインキュベートします。
4. 感染の1日後、ウイルス/メディア混合物を吸引し、HEK293増殖培地を含有するピューロマイシンと交換してください（2 / mlの、 表1）。ピューロマイシンは、形質導入された細胞について選択します。 〜2日後に、約90％コンフルエントになるまで、5％（v / v）のCO ₂で37℃でフラスコをインキュベートします。
5. ステップ4.1で10点アゴニスト/活性化曲線を生成するための、フィブロネクチンでコーティングした96ウェルプレート（透明底黒色）を準備します。無菌フードでは、96ウェルプレートの行AとBでウェルあたり50μlのフィブロネクチン（5μg/ ml）を追加します。 1時間室温でプレートをインキュベートします。 PBSですすぎあたり5分間二回洗浄します。 HEK293増殖培地50μlを添加し、5％（v / v）のCO _2、37℃でO / Nインキュベートします_。
   注：Fibronectin処理プレートは、市販されています。
6. ステップ2.3-2.6（ 表2）に記載のようにT25フラスコ中の細胞を採取。
7. HEK293増殖培地5ml中の細胞ペレットを再懸濁します。 FACS分析のために細胞を1.5 mlのT25フラスコに播種。また、凍結および貯蔵のための細胞の1ミリリットルでT75フラスコに播種（手順を参照してください8.2から8.3）
8. 10ポイントのアゴニスト曲線については、ウェル当たり100μlの細胞懸濁液と（ステップ3.5）、フィブロネクチンコーティングした96ウェルプレートの最初の2列（AとB）を種子。
9. 〜2日後に、5％（v / v）のCO ₂で37℃で約〜90％コンフルエントになるまでHEK293のT25フラスコ、T75フラスコ中で増殖する細胞と、96ウェルプレートをインキュベート。

4. FACSおよびシングルCNiFERクローンの単離

1. 10点アゴニスト活性化曲線を生成するための96ウェルプレートを使用してください。
   注：（FACS）分析を蛍光活性化細胞選別を開始する前に、確認することが重要ですアゴニスト応答（10点アゴニスト曲線）のために導入された細胞を試験することにより、GPCRの発現。この試験は、蛍光プレートリーダーを用いて行われます。
   1. 10点アゴニスト活性化曲線のための薬物プレートを準備します。文献から決定することができる予測EC _50をブラケット10の異なるアゴニスト濃度_を選択します。
      注：CNiFERプレートで3倍希釈薬剤プレートは、1を調整するために（二重に）各濃度の3倍が含まれています。例えば、D2 CNiFERをテストするための薬剤プレートは、3倍の濃度でのドーパミンの10の異なる濃度が含まれています。 0.2、0.5、1、3、5、10、20、30、50、及び1000nmで。 CNiFERプレートでは、したがって、ドーパミンの最終濃度は0.067、0.167、0.333、1.00、1.67、3.33、6.67、10.0、16.7、および333 nMです。
   2. 人工脳脊髄液（ACSF）（ 表1）を使用して、アゴニスト溶液を調製します。 「ACSF '、 例えば 、A1とA2のための2つのウェルを使用して、そして「細胞なし」、 例えば 、B1とB2のための2つの井戸。
      注：シリアル希釈法を用いて、薬物の異なる濃度を準備します。 CNiFERクローンと薬物濃度（ 図3）を追跡するためのテンプレートを作成します。
   3. FRETを測定し、ソリューションの転送を行うための96ウェル蛍光プレートリーダーをプログラムするソフトウェアを使用してください。
      1. 37℃にプレートリーダー温度を設定します。
      2. TN-XXLでFRETを測定するために、436±4.5 nmの（中央±HWHM）に励起波長を設定します。 eCFP用とシトリンのための527±7.5 nmの485±7.5 nmの発光フィルターを設定します。それぞれ、475とのeCFPとシトリンのために515 nmのカットオフフィルターを設定します。
      3. 485 nmおよび527 nmで180秒毎に合計4秒での発光を測定するために、プレートリーダーをプログラムします。の30秒を収集した後、CNiFERプレートで100μlに3倍の薬物プレートから50μLを提供するオプションを選択します。ベースライン蛍光。
   4. 行AとBからメディアを吸引し、ある96ウェルCNiFERプレート〜90％コンフルエント（ステップ3.9）にACSFの100μlを添加します。
   5. 96ウェルCNiFERプレートとプレートリーダーに「3倍」薬物プレートをロードします。プレートを37℃で平衡化するために〜30分を許可します。その後、プログラムを起動します。
   6. プレートリーダーのデータを分析するために、スプレッドシートに蛍光値をエクスポートします。 CNiFERsでウェルからのバックグラウンド測定（細胞なしのウェルからの各信号のために採取）を減算する式を作成します。事前刺激ベースライン、F _シトリン （トン）/ F _シトリン （ベースライン）に蛍光強度を正規化し、FRET比を算出（ΔR/ R;方程式を1）ピーク527 nmでの応答と485 nmの排出量を使用して（ステップ11を参照してください。 ）。
      注：アゴニストΔR/ Rに大きな変化がある場合、これは、GPCRの発現を示し、一方はFACS分析（ステップ4.2）に進むことができます。番目の場合EREは、Ca ²⁺応答をテストし、そのFRETベースのセンサーが機能しているを確認するために、 例えば 、A21387をのCa ²⁺イオノフォアを使用することにより、トラブルシューティング、アゴニストとのFRET応答ではありません。イオノフォアが動作する場合、受容体は、おそらく発現していませんでした。
2. FACS前日に、フィブロネクチンでコーティングされた4 96ウェルプレートを準備選別した細胞を採取する（ステップ3.5を参照してください）​​。 HEK293増殖培地50μlを添加し、5％（v / v）のCO _2、37℃でO / Nインキュベートします。
3. 滅菌ボトルに5％PBSで（w / v）のBSA（5グラム/ 100ミリリットル）とフィルター（0.2μm）を準備します。
4. （工程2.3〜2.5、 表2を参照） を T25フラスコ中で増殖させた細胞を採取します。 PBS中の5％（w / v）のBSA 4mlに細胞ペレットを再懸濁します。 5分間の千×gで細胞を遠心。
5. （w / v）のPBS中のBSAは約5×10 ⁶細胞/ mlの最終濃度を得るために、メディアを吸引し、5％〜5ミリリットル中に細胞ペレットを再懸濁します。
   注：FAに確認してください細胞密度およびソート条件に関する具体的な要件については、CSの中核施設。
6. 塊を除去するために40μmのセルストレーナーで再懸濁した細胞をフィルタリングします。下部チューブラウンド5ミリリットルのポリプロピレンに細胞を移します。 FACS施設への輸送のためのチューブを氷上に置きます。
7. FACS施設で形質導入されたHEK293細胞をソートします。プログラムは以下のサイトメーターのようにFACSフロー上のパラメータは：、試料ホルダーのためのノズルと20 psiのための100ミクロンを4°Cに設定します。事前ソート分析に基づいて、選択した細胞は、 すなわち 、大型のeCFP蛍光（のeCFP励起、のeCFP発光）と大FRET（のeCFP励起、シトリン発光）蛍光を持つ「ゲート」、（下記の結果、 図2を参照してください]を選択します）。
8. 預金個人は、よくピューロマイシンとHEK293増殖培地の50μLを含むあたり1クローンで、ステップ4.2で調製した96ウェルプレートに細胞を選別しました。 （TaのピューロマイシンでHEK293増殖培地50μlのを追加BLE 1）ウェルあたり100μlの合計。 5％（v / v）のCO ₂で37℃で細胞をO / Nを維持します。
   注：HEK293増殖培地は、形質導入細胞の選択のためのピューロマイシンが含まれています。

5.培養およびソートの拡張、クローンCNiFERs

1. 各ウェルから古いメディアを50μlを除去し、新鮮なHEK293増殖培地50μlの含有ピューロマイシン（ 表1）で置き換えることにより、96ウェルプレートでCNiFERsを維持します。 2-3週間後、5〜7日毎〜90％コンフルエントになるまでこれを繰り返します。
2. 優しくメディアを吸引し、PBSで穏やかに一回のすすぎのHarvest CNiFER細胞。 PBSを削除し、トリプシン/ EDTA（w / v）の0.05％の20μlを添加します。 CO _2（v / v）の5％、37℃で1~2分間インキュベートします。
3. トリプシン処理した細胞にHEK293増殖培地の100μlを添加して、細胞を再懸濁。 400μlの新鮮HEK293増殖培地のウィットを含む24ウェルプレートに内容を転送時間ピューロ。ウェルは〜90％コンフルエントになるまで24ウェルプレートでは、5-7日毎にHEK293増殖培地250μlのを置き換えることによって、細胞を維持します。

6.蛍光プレートリーダーを用いてFRET応答に基づいて候補CNiFERsを特定

注：FACSを以下の4つの96ウェルプレートでは、生き残る> 100テスト可能なクローンがあるはずですし、元のクローンの多くが成長しないので、24ウェルプレートステージに展開します。潜在的な候補CNiFERsを識別するために、同族体アゴニスト、 例えば 、D2RのためのドーパミンとのFRET応答を3点分析を使用しています。

1. 細胞は〜24ウェルプレートで90％コンフルエントである場合に、穏やかに培地を吸引。 0.05％から約100μlを添加する（W / V）、トリプシン/ EDTA、5％（v / v）のCO _2、37℃で1~2分間インキュベートします。トリプシン処理した細胞にHEK293増殖培地の400μlを添加して、穏やかな粉砕により細胞を混ぜます。
2. CLOの最初のスクリーニングのための3点アゴニスト曲線を設定しますファミコン。各CNiFERクローンのための、 すなわち 、3つのウェル、 例えば 、A1、A2、A3のそれぞれに、24ウェルプレートのウェルの一つ、アリコートの細胞懸濁液100μl（約4×10 ³細胞/ウェル）のフィブロネクチンコーティングした96ウェルプレート（透明底ブラック）（ステップ3.5を参照してください）​​。
3. HEK293増殖培地（1.2ミリリットル最終容量）の千μLを含む12ウェルプレートに細胞懸濁液の残り〜200μlのを転送します。約90％コンフルエントになるまで、5％（v / v）のCO _2、37℃で両方のプレートをインキュベートします。 96ウェルプレートを、蛍光分析用で、12ウェルプレートに増殖するクローンを拡大するためのものです。
4. 3点分析のために、0.1〜、1.0-あるアゴニストの3つの異なる濃度、および特定のGPCRのための10倍のEC _50を決定_します 。手順で説明するように、薬物プレートにおけるアゴニスト濃度を準備し4.1.1-4.1.2。ステップ4.1.3-4.1.5で説明したように、蛍光プレートリーダーアッセイを実行します。
5. FRを計算ET比（ΔR/ R）のステップ4.1.6で説明したように。バック凍結、およびより包括的な分析（ステップ7）、適切な感度と拡張のための最大のFRET応答を有するCNiFERsを選択してください。
6. ステップ6.5で選択し、12ウェルプレート中で成長しているクローンの場合は、〜90％コンフルエントになるまで、5〜7日毎HEK293増殖培地600μlのを取り外して交換。
7. 徐々に6ウェルプレートに12ウェルプレートからのクローンを展開し、[T25フラスコに（2.3ステップ- 2.6および表2）。記載されているようにT25フラスコは〜90％コンフルエント、収穫細胞である場合（2.3から2.5ステップ）。 HEK293増殖培地5ml中の細胞ペレットを再懸濁します。
8. HEK293増殖培地の9ミリリットルでT75フラスコに細胞懸濁液の1ミリリットルを追加します。 （8.2から8.3ステップ）、液体N ₂中で凍結保護し、保存のために細胞懸濁液の残りの4ミリリットルを使用してください。 8 1.5ミリリットルのクリオチューブを準備し、氷上に置きます。
9. T75フラスコ中、メディアWを交換することによって細胞を維持しますi番目の新鮮HEK293増殖培地、 例えば 70〜80％コンフルエントになるまで10ミリリットル毎3-5日後〜1〜2週間。

蛍光プレートリーダーを用いてCNiFERクローンの7.最終的な選択

1. プレートリーダーアッセイ前日に：
   1. 〜90％のコンフルエントT75フラスコから細胞を回収する（ステップ2.3から2.6、 表2を参照）。ウェルの細胞懸濁液〜100μlで5×10 ⁴ /ウェルで96ウェルのフィブロネクチンでコーティングしたプレート（透明底黒）をシード。注：一つのクローンは、単一の96ウェルプレートに分配されます。
2. 非特異的CNiFER応答から特異的アゴニスト応答を区別し、CNiFERクローンの包括的なスクリーニングのための薬物プレートを準備します。
   1. 全用量反応曲線を生成するには、予測されたEC ₅₀の周りに10の異なるアゴニスト濃度を選択します。 「細胞なし」と「ACSF 'の2つのウェルのための2つのウェルを使用してください。
   2. 非特異的応答を決定するために、THRを選択12種類の神経伝達物質またはモジュレーター（72ウエル）のee濃度（ 図3）。アゴニストと同様に、薬物プレートを重複して3倍の濃度が含まれています。三つの異なるアセチルコリン、グルタミン酸、オレキシン、VIP、アデノシン、セロトニン、ノルエピネフリン、GABA、サブスタンスP、メラトニン、ソマトスタチンおよびヒスタミンの濃度、50の3倍の濃度でそれぞれ、1,000および3,000 nMでの例については、100μlの96ウェル薬物プレートにロードされます。
3. FRETを測定し、ステップ4.1.3-4.1.5で説明したようにソリューション転送を行うための蛍光プレートリーダー上のパラメータを設定します。
4. 完全な用量反応曲線を分析するために、ピークFRET比（ΔR/ R）（ステップ4.1.6）を計算し、ログアゴニスト濃度の関数としてプロットし、Hillの式（ステップ11.4）に適合。 EC _50、ヒル係数、および最大FRET比を決定します。 12他の神経伝達物質/モジュレータのための、機能OとしてプロットピークΔR/ RF薬物濃度。
5. 〜10同族体アゴニストのための大規模なFRET比、適切なEC _50を有するCNiFERクローン、および他の神経伝達物質アゴニストにほとんど、あるいは全くバックグラウンド応答（非特異的応答）を選択します。

8.フリーズバック選択CNiFERクローン

1. 個々のCNiFERクローンの〜90％コンフルエントT75フラスコを使用してください。記載のように収穫細胞（2.3〜2.5、 表2ステップ ）。凍結細胞は、HEK293増殖培地5ml中に細胞ペレットを再懸濁します。 10 1.5ミリリットルのクリオチューブにラベルを付け、氷上に設定してください。
2. 凍結保護のために、細胞を1ミックス： 例えば 20％HEK293増殖培地中（v / v）のDMSOで1を、20％の5mlの（v / v）のDMSO /培地混合物を細胞懸濁液の5mlを穏やかに混合する（最終DMSOの濃度）は10％です。
3. クリオチューブのそれぞれにアリコート1ミリリットル。 （ 材料を参照してください）発泡断熱ボックスで、-80℃の冷凍庫O / Nで細胞とチューブをフリーズします。転送がliquにクリオチューブ長期保存のためのID窒素。

マウス皮質へ9. CNiFER移植

1. 手術前に、オートクレーブ内のすべての手術器具を滅菌します。 70％エタノールで拭い、きれいなラボおむつを敷設することにより、手術のために半無菌領域を準備します。
2. 垂直電極プラーにガラスキャピラリー（0.53ミリメートルのIDを）引っ張ることによりCNiFER注入ピペットを準備します。なしのペアを使用してください。 〜40ミクロ​​ンの直径に電極の先端を破壊する5先の細い鉗子。
   注：これは最高の目盛付きステレオズーム顕微鏡下で達成されます。
3. イソフルランで成人（生後60-90）C57BL / 6マウスを麻酔：4％（v / v）の誘導のため、および1.5〜2.0％（v / v）のメンテナンスのため。マウスが完全に麻酔されていることを確認するために、尾や足指のピンチを使用してください。
   定期的に再ピンチと麻酔の深さを再評価するために、手術全体ウィスカーけいれんを評価：注意してください。
4. pまでの眼軟膏で目を覆いrevent乾燥。耳バーと定位フレームにマウスをマウントします。直腸プローブにより調節加熱パッドを使用して、37℃でマウスの体温を維持します。
5. 動物電気シェーバーと12ミリメートルで約5ミリメートルの領域を剃ります。 70％（v / v）のイソプロパノール、続いてベタジンを適用します。頭蓋骨の表面上に皮膚を切断して除去するために、メスの刃を使用してください。頭蓋骨の表面から骨膜を除去するために、手術用メスの刃を使用してください。定位手術¹¹について説明したように、頭蓋骨の表面を露出し、清掃してください。
6. ブレグマと前後（A / P）および内外方向（M / L）を記録するために、空のガラスピペットを下げて調整します。マウス脳アトラスを参照すると、注射部位の位置を算出します。標的部位にピペットをシフトし、後続のウィンドウ形成のための頭蓋骨をマーク。パルミチン酸セチルらを参照してください。げっ歯類¹¹と定位注射の詳細については。
   注：注射やウィンドウのサイトには、REGに依存します検討されるべきイオン、神経伝達物質またはペプチドの分布は、皮質内の突起を解放します。例えば、最近の刊行物⁷に、定位は1.0 2.0ミリメートルのA / Pおよび1.0 2.0ミリメートルのM / Lに古典的条件時のドーパミン放出のin vivoイメージングのために前頭皮質にCNiFER細胞を注入するために使用された座標。
7. 以前に^12,13を説明したように2ミリメートルのx 3ミリメートル間引き頭蓋骨ウィンドウを形成します。
   注意：ウィンドウ内の骨が15-20μmの厚さでなければなりません。頭蓋骨の表面が湿潤されたときに骨が十分^12,13を薄くする場合、骨に小さな白い斑点は、見えないはずです。
8. 注入する細胞を調製しながら、しっとりそれを維持するために、ウィンドウにACSFに浸したスポンジを置きます。
9. 〜80％コンフルエントにT75フラスコ中で増殖させたCNiFERクローンを収穫。メディアを吸引除去し、滅菌PBSで細胞を洗浄。
   注：トリプシンは、これらのステップのために省略されています。
10. O PBSを削除し、10ミリリットルを使用F ACSFをフラスコの底から細胞を除去します。粉砕物の細胞は、細胞塊を解離します。 ACSF100μlのペレットを遠心分離し、再懸濁します。 ACSFで覆われたペレットを残し、1400×gで30秒間遠心分離し、上清を除去します。このステップは、懸濁液中の細胞の塊を残します。
11. ミネラルオイルでステップ9.2で調製した注入ピペットを埋め戻し、ナノインジェクタ上にピペットをロードし、油の小さなビーズを排出するプランジャーを進めます。マウスの準備に近いプラスチックパラフィンフィルムのストリップ上CNiFER細胞懸濁液の5μLを入れてください。引っ張らピペットにCNiFERsまたは制御CNiFER細胞のいずれかを描画します。
12. ターゲットXとY座標にピペットを移動し、 すなわち 、A / PおよびM / Lは、ステップ9.5で述べました。薄くなった頭蓋骨を貫通、ピペットを下げ、および皮質の層2/3にCNiFER細胞を堆積させるために、200から400μmの頭蓋骨の表面の下に〜し続けます。
13. nanoinjecで最も深い部位でCNiFER細胞の〜4.6 NLを注入その後、器、石油・セルインターフェースでノート運動、細胞を分配するために、5分間待ちます。 〜100μmでピペットを撤回し、CNiFER細胞の別〜4.6 NLを注入し、5分待ってください。その後CNiFERsの逆流を防止するために、ゆっくりと静かにピペットを撤回。隣接する1つ以上の部位での注射を繰り返します。
14. 繰り返し注射は対照HEK293細胞（GPCRを欠くすなわち 、HEK293 / TN-XXL / Gの_{qi5クローン} ）で9.8から9.12を繰り返します。 CNiFERを分離し、〜200ミクロンによる細胞注射部位を制御します。
15. 細胞移植を完了した後、ACSFで間引き頭蓋骨ウィンドウをすすぎ、頭蓋骨を乾燥するのを待ちます。ウィンドウの上（ 材料を参照）シアノアクリレート接着剤のドロップを適用し、迅速に接着剤の上にプレカット滅菌カバーガラスを配置します。軽く数秒間頭蓋骨に対してカバーガラスを押してください。 2分^12,13のための接着剤の乾燥をしてみましょう。
16. 歯科用セメントおよびフォームAWとカバーガラスの縁をシール窓周りのエルは浸漬目的のために水を保持します。
17. 撮像中にマウスの頭部を固定するために、ウィンドウの後ろにシアノアクリレート系接着剤（寸法や材料の詳細については^、14を参照）の小滴で、特注のヘッドバーを取り付けます。接着剤が完全に乾燥した後、さらに、特注のヘッドバーを強化するために追加の歯科用セメントを追加してみましょう。
18. 歯科用セメントの層で、ウィンドウを除いて、頭蓋骨の表面の残りの部分をカバーしています。皮膚のエッジがセメントで覆われていることを確認して、20分間、それが乾燥してみましょう。
19. 手術後、イソフルラン投与を中止し、それが完全に麻酔から回復するまでケージに加熱パッド上でマウスを残します。術後鎮痛のための再水和および0.05〜0.1ミリグラム/キログラムブプレノルフィン（腹腔、即時放出）のために生理食塩水で（w / v）のグルコース（SC）の5％を注入します。
    注意：人間CNiFERsへの潜在的な免疫学的反応を最小限にするために、/ 100グラムのシクロ20μlのを毎日マウスを注入sporine（IP）CNiFERsの注射の前日を開始します。
20. 食料や水のためにそのホームケージにマウスを返します。

CNiFERクローンのin vivoイメージング10

注：ライブイメージングは​​、二光子顕微鏡と頭部固定装置を使用して、マウスを用いて実施されます。無麻酔は、イメージングセッション中に必要とされません。アウェイク状態で動物を撮影するときは、ストレスレベルを低減するためには一度に数時間にヘッドレストを制限します。食料と水のためのイメージングセッションの間、それをホームケージに動物を返します。潜在的なストレスは、部屋の照明を暗くし、エンクロージャ内のマウスの一部を囲むことによって最小化されます。

1. 手術の翌日には、頭部固定フレームに頭蓋骨に移植メタルヘッドバーをねじ込むことにより、イメージングプラットフォーム上でマウスをマウントします。
   注意：目を覚ましマウスを撮影するときは、イメージングセッションは、ヘッド拘束装置によって誘発される潜在的なストレスによる数時間を超えてはなりません。
2. 10X（0.30 NA）および40X（0.80 NA）水浸対物レンズを搭載した2光子イメージング顕微鏡で頭拘束マウスを使って撮影台を置きます。
3. シトリンを測定するための560 nmまでのeCFPおよび520nmでの測定のため500nmの460nmのにま​​たがる505 nmおよびバンドパスフィルタでダイクロイックミラーを持つFRETイメージング（のeCFPとシトリン）用のフィルターキューブを挿入します。
4. 含むウェル間引き頭蓋骨ウィンドウにACSFを追加し、ACSFに水浸対物レンズを下げます。ウィンドウの下の皮質および血管系の表面を見つけるために水銀ランプおよびGFPフィルターキューブと一緒に接眼レンズを使用してください。
   注：血管系のパターンは、イメージングの繰り返し日間にわたって同じ領域を特定し、画像に役立ちます。 手動でGFPフィルターキューブや水銀ランプを用いて細胞の上に皮質の表面に焦点を当ててCNiFERsを見つけるために40X水浸対物レンズに切り替えます。
5. 2光子イメージングのために設定します。 APを選択二光子イメージングのためpropriate光路。典型的な市販のシステムでは、2光子イメージングモードに切り替えると非デスキャン検出器における光電子増倍管（PMT）に光をリダイレクトするソフトウェアを使用しています。 、近赤外フェムト秒パルスレーザーをオンにする820 nmでの波長5〜15％に電力設定を選択します。注：5％の消費電力は、典型的には、試料で〜25ミリワットを提供します。
6. 最大値に近いPMT1＆PMT2電圧、PMTに応じて、通常、700〜1000 Vを設定します。各チャネルの1にゲインを設定します そして、客観のためのz位置をゼロ。
7. 皮質表面から100〜200μmの〜目標を下げて、XYスキャンを開始します。 CNiFER蛍光の信号対雑音比を最適化するために、レーザーパワー、ゲイン、および各チャネルのPMT電圧、 すなわち 、のeCFPおよびシトリンを調整します。
8. CNiFER細胞を含む領域だけでなく、backgrounにイメージを制限するためにソフトウェアでズーム機能を使用しますD地域。ピクセルあたり4マイクロ秒で1フレーム毎に2秒（0.5ヘルツ）を超えない遅いスキャンレートを使用してください。適切な信号対雑音比、 例えば 、カルマン2ライン平均化する平均線を調整します。
9. 平面あたり約3〜4個の細胞を囲む、関心領域（ROI）CNiFER細胞の周りを描きます。 ROIの平均強度のリアルタイム分析を設定します。時間をかけてCNiFER蛍光を監視するために取得を開始します。
10. 前と実験操作、 例えば 、ユーザによって決定されるような電気刺激、のChR2刺激、行動、中にCNiFERsからの蛍光を収集します。
11. 画像化実験が終了すると、そのホームケージにマウスを返します。所望のように、日全体で撮影を繰り返します。ときに再イメージングする細胞は、同じイメージング分野（ステップ10.4）に戻って配向する以前に取得した低倍率の血管系の画像を参照してください。
    注：移植CNiFERsは、少なくとも7日間、画像化することができます。

11.データ解析

オープンイメージングファイルとCNiFERsと背景のための1つのROIのためのROIを選択します。各ROIの両チャンネルの「系列分析」を選択します。タブ区切りファイルとして各ROIのためのエクスポートの平均蛍光強度。

蛍光値を分析するために数学ソフトウェア（ マテリアルを参照）プログラムを使用します。低域通過フィルタ（0.3 Hz）で、各信号とその後のeCFPとシトリンの蛍光強度から各ROIにおけるバックグラウンド蛍光を差し引きます。

ベースラインの平均蛍光を計算し、FRET比ΔR（T）/ Rを測定するために、式（1）に記載のように比を計算します。

CNiFERsの感度を決定するために、ログのアゴニスト濃度の関数としてのFRET比をプロットします。科学的な統計ソフトとヒル式（式2）を用いて、EC ₅₀及びヒル係数（n）を決定するために、ヒルの式にフィット。

結果

特定のGタンパク質共役受容体（GPCR）と遺伝的にコードされた[Ca ^2+]センサ、TN-XXL：CNiFERを安定少なくとも二つのタンパク質を発現するように操作されたヒト胚腎臓（HEK293）細胞から誘導されます。 TN-XXLは、Ca ²⁺イオン^6,15に対応して、それぞれ、シアンおよび黄色蛍光タンパク質間の蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）を受けるのeCFPおよびシトリン。内因性G _qをGタンパク質に、その夫婦のGPCRの活性化は、の[Ca ^2+] PLC / IP ₃経路を介し、TNXXLのCa ²⁺検出器からのFRETの増加につながる（ 図1）細胞質ゾルの増加を誘発します。

ディスカッション

CNiFERsの作成 ​​は、光学的にin vivoでの脳内の神経伝達物質の放出を測定するための革新的でユニークな戦略を提供します。 CNiFERsは、理想的には、神経伝達物質、すなわちシナプスリリース、体積伝導を測定するのに適しています。重要なことには、各CNiFERは、脳内の神経伝達物質のレベルの変化の生理学的な光学的測定を提供する、天然のGPCRの特性を有します。現在までに、CNiFERsはアセチルコリンを検出するために作成されている^{（M1-CNiFER）6、}ドーパミン^{（D2-CNiFER）7}およびノルエピネフリン^{（α1A-CNiFER）7。}

原則として、CNiFERは、GPCRを介して信号の任意の神経伝達物質のために作成することができます。 G _qをGタンパク質を介して、GPCR信号は、さらなる変更がHEK293細胞に必要とされない場合には。 _{I / O、}但し、Gの_qi5キメラGタンパク質の共発現を必要とす...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
pCDH-CMV-MCS-EF1-ぷろ	System Biosciences	CD510B-1	ニング:レンチウイルスを生成するため
12 x 75 *BD Falcon High Clarity ポリプロピレン丸底試験管	BD Biosciences	352063	FACS
BD 40 um Falcon cell strainers	BD Biosciences	352340	FACS
0.05% トリプシン EDTA	Invitrogen	25200056	FACS
96ウェルプレート、平底、透明	コーニング	3596	FACS
96ウェル細胞培養プレート	コーニング	CLS3997	Flexstation
Optilux ブラッククリアボトム	コーニング	3603	Flexstation
Flexstation ピペットチップ	Molecular Devices	9000-0911	Flexstation
アセチルコリン塩化物	シグマ・アルドリッチ	A2661	フレックスステーション
ノルエピネフリン	Sigma-Aldrich	A7256	Flexstation
ドーパミン塩酸塩	シグマ・アルドリッチ	PHR1090	フレクステーション
GABA	Sigma-Aldrich	A2129	フレクステーション
ヒスタミン	Sigma-Aldrich	H7125	フレックスステーション
グルタミン酸	Sigma-Aldrich	49621	フレックスステーション
エピネフリン	Sigma-Aldrich	E4642	フレクスステーション
ソマトスタチン	シグマ・アルドリッチ	S1763	フレックスステーション
5HT	シグマ・アルドリッチ	H9523	フレックスステーション
VIP	アルファ・ダイアグノスティックス社	SP-69627	フレキ
シン オレキシン	A アルファ ダイアグノスティックス(株)	12-p-01	フレクステーション
サブスタンス P	Sigma-Aldrich	S6883	Flexstation
アデノシン	Sigma-Aldrich	A4036	Flexstation
Melatonin	Sigma-Aldrich	M5250C	Flexstation
蛍光プレートリーダー & ソフトウェア	Molecular Devices	Flexstation 3	Flexstation
DMEM(高グルコース)とグルタマックス	ライフテクノロジーズ	10569-010	組織培養
ウシ胎児血清	Life Technologies	10082-139	組織培養
ペン/溶連菌感染症 抗生物質	Life Technologies	15140-122	組織培養
ピューロマイシン	InvivoGen	ant-pr-1	組織培養
フィブロネクチン	Sigma-Aldrich	F0895	組織培養
CoolCell LX アルコールフリー速度制御細胞凍結ボックス	Bioexpress	D-3508)	組織培養
シアノアクリレート接着剤	ロックタイト	ロックタイト No. 495	手術と脳定位注射
プラスチック パラフィン フィルム	VWR	パラフィルム®	手術と脳定位固定装置注射
ナノインジェクター	ドラモンド	3-000-204	手術と脳定位固定装置注射
ガラス電極	ドラモンド	3-000-203G	手術と脳定位注射
ハンドヘルドドリル	OSADA	Exl-M40	手術と脳定位注射
ドリル用バリ	ファインサイエンティフィック	19007-05; 19007-07)	手術と脳定位注射
滅菌浴	FST	18000-45、ホットビーズ滅菌器	手術および固定装置注射
ソフルランチャンバー/マスク	ランド医療機器	564-0427、HME 109イソフルラン気化器、O2流量計、ギャングバルブ付きテーブルトップ麻酔器; 564-0852、誘導チャンバー16X7X7.5cm	手術および脳定位注射
3Dスコープ、アーム	ツァイス		手術および脳定位注射
光ファイバー光			手術と脳定位固定装置注射
ベタジン			手術と定位固定装置注射
70%(v / v)イソプロピルアルコール			手術と定位注射
ポビドン-ヨウ素準備パッド	ダイナレックス	1108	手術と固定装置注射
NaCl 0.9%(注射、USP、918610)			手術と定位注射
シクロスポリン(注射、USP)			手術と脳定位固定剤注射
ブプレネックス(注射)ブプレノルフィン(0.03 μg per g げっ歯類)	Sigma-Aldrich		手術と定位固定剤注射
科用軟膏	Akorn	NDC 17478-235-35	手術と脳定位注射
Surgifoam	エチコン		手術と定位注射
グリップ歯科用セメント	Dentsply	#675571、675572	手術と脳定位注射
Instant SuperGlue	NDindustries		の手術と脳定位固定剤注射
LOCTITE 4041			の手術と脳定位注射
METABOND	C&B		手術と脳定位注射
0号カバーガラス	フィッシャー		手術と脳定位注射
脳定位固定器フレーム	Kopf		手術と定位固定装置注射
直腸プローブと加熱パッド	FHC	40-90-8D、DC温度コントローラー、40-90-2-06、6.5X9.5cm加熱パッド40-90-5D-02、直腸サーミスタプローブ	手術とイメージング用固定装置注射
光学ブレッドボード	Thorlabs		手術と定位注射
鉱物油	フィ	ッシャーS55667	手術と脳定位固定剤用注射
Kwik-Cast(シリコーンエラストマー)	World Precision Instruments		の手術と脳定位固定剤注射
用縫合糸	エチコン	18''、1667、4-0	手術と脳定位固定装置注射
はさみ	ファインサイエンティフィックツール	91500-09、15018-10	手術と脳定位注射
Forcepts	Fine Scientific Tools	11252-30;#55、11295-51;グラフ、11050-10	手術と脳定位固定装置注射
学生 ハルステッド-蚊止血剤	ファイン サイエンティフィック ツール	91308-12	手術と定位注射
小血管焼灼器キット	ファイン サイエンティフィック ツール	18000-00	手術と脳定位注射
ホットビーズ滅菌器 ファイン	サイエンティフィック ツール	18000-45	手術と脳定位注射
シリコンマット付きインスツルメントケース	ファインサイエンティフィックツール	20311-21	手術と脳定位注射
シリコンマット付きプラスチック滅菌容器	ファインサイエンティフィックツール	20810-01	手術と脳定位注射
in vivoイメージング用2P固定ステージ蛍光スコープ	オリンパス	FV1200 MPE	in vivoイメージング
多光子レーザー	SpectraPhysics	Mai Tai DeepSee	in vivo イメージング
グリーンレーザー	オリンパス	473 nm レーザー	in vivo イメージング
xy トランスレーショナルベース	Scientifica	MMBP	in vivo イメージング
FRETフィルターキューブ YFPおよびCFP用	オリンパス		in vivoイメージング
10倍および40倍水浸対物レンズ	オリンパス		in vivo イメージング
エアテーブル	ニューポート		の生体内イメージング
カスタムビルドの軽量ケージ	Thorlab		生体内イメージング