DNA結合色素化学と液滴デジタルPCRを使用したマイクロRNA定量循環

Summary

色素ベースの化学および液滴デジタルPCR技術を使用した無細胞マイクロRNA定量のための高感度で正確な方法が説明されています。

Abstract

マイクロRNA（miRNAは）（無細胞の）循環血液流に細胞から放出されます。循環中の特定のマイクロRNAの量は、疾患状態に連結され、疾患のバイオマーカーとして使用する可能性を有するされています。デジタルPCR技術染料系化学を用いて、液滴マイクロRNA定量を循環させるための高感度で正確な方法が最近開発されました。具体的には、ロックされた核酸（LNA）を使用することは、特定のmiRNAの絶対的な定量化を得ることができる互換性のある液滴デジタルPCRシステムにおいて緑色蛍光DNA結合色素とのmiRNA特異的プライマーをベース。ここでは、そのような血漿および血清などの生物学的流体、中のmiRNAの量を評価するためにこの技術を実行方法について説明し、実行可能かつ効果的です。

Introduction

マイクロRNA(miRNA)は、活発な放出または壊死およびアポトーシスのプロセスの結果として、潜在的に生物のすべての細胞によって血液循環に放出されます。無細胞miRNAは、遊離安定分子として血流中に検出されているか、リポタンパク質に結合しているか、エキソソームや微小胞に包まれているかのいずれかで検出されています^1-3。それらは細胞間コミュニケー^ター4として機能し、癌、心臓障害、または自己免疫疾患^5-7の存在下でその量が変化すると考えられています。その正確で再現性のある定量は、疾患バイオマーカーとしての評価の基礎となります。しかし、すでに他の場所で説明したいくつかの理由により^8,9、血清や血漿、その他の体液中のmiRNAの定量は非常に困難になる可能性があります^10,11。私たちは最近、miRNA特異的LNAプライマーとDNA結合色素液滴デジタルPCR(ddPCR)技術¹²に基づいて、循環するmiRNAの絶対定量法を開発しました。この方法論は、miRNA乳がんバイオ^{マーカー13,14}の検証に適用されています。

ナノリットルサイズの液滴内で各逆転写されたmiRNA分子を分配した後、各サンプル中の各miRNAのコピー数を数えることが可能であり、基本的には緑色、したがって正の蛍光液滴の数を数えることができます。PCR反応が起こるとすぐに、定量的RT-PCR(RT-qPCR)のように標準曲線を設定したり、目標量の計算でPCR効率を考慮に入れたりすることなく、陽性カウントが達成されます。さらに、ddPCRは、循環miRNA定量においてRT-qPCRよりも感度と精度が高いことが証明されました¹⁵。 この記事では、この方法論の詳細なプロトコルを提示し、最も関連性の高い手順について説明し、特に血清と血漿の臨床サンプルを検討します。

Protocol

血漿または血清からのマイクロRNAの単離

注：血漿および血清調製は、miRNAの定量化を循環関連のステップです。血漿および血清の調製のための好ましい手順はありません。検討する唯一の重要なことは、同じ実験からの全てのサンプルは正確に同じワークフローを使用して処理しなければならないことです。 200μlの血清または血漿から開始します。総RNAは、市販のキットを用いて血清または血漿から単離することができます。

1.（miRNAを含む）全RNAのためのプロトコルの単離

1. 氷上で解凍血清/血漿サンプル。
2. 200μlの血清/血漿に溶解試薬 ​​（ 例えば 、のQIAzol）の1ミリリットルを追加します。
3. ボルテックスで混合し、室温で5分間、ベンチのホモジネートを含むチューブを置きます。
4. Cから合成miRNA CEL-のmiR-39-3pの4.16 nMの溶液を3μLを加えますエレガンス 。
5. 200μlのクロロホルムを追加します。 15秒間激しくチューブを振ります。目を配置します2分間室温でベンチ上の電子管。
6. 相分離を得るために4℃で12,000×gで15分間遠心操作：上部の水相は、RNAが含まれています。
7. 任意の白相間材料の移動を防ぐため、約700μlを、新しいチューブに水相を転送します。
8. 100％エタノールの1ミリリットルを加え、反転により混合します。
9. 最大700μlのサンプル2 mlのコレクションチューブ上に配置されたミニスピンカラムにピペットで。 15秒間12,000×gで蓋と遠心分離機を閉じます。フロースルーを捨てます。
10. 残りのサンプルを使用して、この手順を繰り返します。
11. ミニスピンカラムに700μlのBuffer RWTを追加し、カラムを洗浄するために12,000×gで15秒間蓋と遠心分離機を閉じます。フロースルーを捨てます。
12. ミニスピンカラムにピペットで500μlのBuffer RPE。 12,000 rpmで15秒間蓋と遠心分離機を閉じます。フロースルーを捨てます。もう一度この手順を繰り返します。
13. スピンカラムを乾燥させるために2分間フルスピードでミニスピンカラムを遠心残留エタノールからの膜。
14. カラムのメンブレン上に新しい1.5 mlコレクションチューブとピペット35μlのRNaseフリー水にミニスピンカラムを移します。
15. RNAを溶出するために12,000×gで1分間遠心します。
16. -80℃でRNAを保管してください。
    注：RNAの濃度を正確に決定することができないので、入力された量の尺度として固定ボリュームを使用します。

2.マイクロRNA逆転写

1. 5×反応緩衝液、ヌクレアーゼフリー水：逆転写（RT）試薬ミックス成分を解凍。氷の上管と場所を反転穏やかに混合します。使用直前に、冷凍庫から酵素混合物を除去し、氷の上に置きます。すべての試薬をスピンダウン。
2. 表1に記載されているように氷上でRT試薬ミックスを調製する。少なくとも10％超えるミックスを調製します。
3. ピペット操作によって反応をミックスし、その後スピンダウン。
4. 42℃で60分間インキュベートします。
5. reverを熱不活性化95℃で5分間SE転写酵素。
6. 直ちに4℃に冷却します。
7. -20℃でのcDNAを保管してください。

3. cDNAを希釈

1. ヌクレアーゼを含まない水で計画ddPCR反応に必要なcDNAテンプレートの量を希釈します。午前1時50分と1の間のcDNA反応を希釈水で500、標的miRNAの豊富さに依存します。 -20°Cで希釈したcDNAを保管してください。希釈されたcDNAを、-20℃で少なくとも3ヶ月間安定であることが判明しました。

4.ドロップレットの生成とPCR

注意：小滴の生成は、一度に8個のサンプルで実行する必要があります。技術的反復が原因^12,15 .Aテンプレートなしのコントロール（NTC）サンプルは、すべてのプレートで実行する必要があり、この技術の高い再現性に、それぞれ異なるddPCR条件のために、必要とされていません。

1. 解凍し、マスターミックスを平衡化（ 例えば 、EvaGreenマスターミックス）RTで、マイクロRNAプライマーセットおよびcDNA。
2. マスターミックス番目のミックスoroughlyチューブを数回反転させることによって。すべての試薬をスピンダウン。
3. 表2に記載されているようにddPCRミックスを調製する。複数のddPCR反応が行われた場合、ddPCRが作業-溶液を混合用意。少なくとも10％超えるミックスを調製します。
4. 組み立てた後、十分に混合するとddPCRミックスをスピンダウン。
5. ddPCR12μlの96ウェルPCRプレートまたはPCRチューブに混合分配。
6. ウェル/各チューブに希釈したcDNA鋳型の8μlを添加します。
7. ホルダーに液滴発生器のカートリッジを挿入します。
8. 空気を回避しながら、液滴発生器のカートリッジのサンプルウェルに移し、各調製した試料を20μl（中段）、慎重には、井戸の底に泡。
9. 液滴発生器油の70μlの各油井（下段）を入力します。
10. カートリッジホルダーの上にガスケットをフックし、液滴発生器に挿入します。
11. メーカーの広報に係る液滴生成を開始するためにふたを閉めotocol。液滴生成​​が​​完了したら、ふたを開け、使い捨てガスケットを取り外します。カートリッジの上部ウェルは液滴を含んでいます。
12. 96ウェルPCRプレートの単一の列に8トップウェル（液滴）の内容のピペットでゆっくりとスムーズに40μlの。
13. 直ちに蒸発を避けるために、液滴を移送した後、ホイルでPCRプレートを密封します。液滴リーダーに針と互換性のある穿刺可能なホイルプレートシールを使用してください。
14. プレートを封止し、30分以内に熱サイクル（PCR）を開始します。
15. 表3に記載のサイクリングプロトコルを実行します。

5.ドロップレット読書

1. 液滴リーダーの電源をオンにします。
2. 液滴リーダーにサーマルサイクラーからプレートを移動します。
3. プレートホルダーのベースにPCR後の液滴を含む96ウェルPCRプレートを置きます。
4. PCRプレート上にプレートホルダーの上部に配置します。しっかりと両方のリリースタブを押してくださいダウンホルダーにPCRプレートを固定します。
5. システムのPCからソフトウェアを起動します。
   1. 実験（絶対定量化）を定義するために、セットアップをクリックした後の液滴の読み取りを開始するには[実行]をクリックします。
   2. 液滴の読み取りが完了すると、データを開き、分析するためのボタンを「分析」をクリックします。
   3. 正の滴（なげなわツール）（ 図1B）を選択するために、解析ソフトウェアで2D振幅プロットを使用してください。
   4. 正と総滴数を確認するには、[イベント]タブを使用します。 18000の総数 - 21,000液滴は、通常probeless ddPCRで達成されます。
   5. 正の液滴を選択したら、集中タブからの輸出の.csvオプションを使用して、miRNAの濃度値をエクスポートします。

Results

血漿または血清の1ml当たりの特定のmiRNAの絶対量は、緑色蛍光DNA結合色素を用いて測定し、デジタルPCR技術滴することができる。 図1は、最終的なmiRNAの濃度を決定する正の液滴の選択、（コピー/μLのプロセスを示します）解析ソフトウェアにより計算増幅反応です。血液中の各miRNAの量が他のものよりも豊富ないくつかのmiRNA種であること、非常に異なっています。 ddPCR反応で1:50希釈されたcDNAを用いて、正および負の液滴の適切な数を得ることが可能です。正の液滴飽和（ 例えば 、残存負滴）の場合は、cDNA試料のさらなる希釈が必要であってもよいです。

すべてのLNAプライマーセットは、液滴デジタルPCRシステム上で正しく動作するように最適化されるべきです。 miR-181A-5Pの最適化処理であります図2に示される具体的には、（通常は0.25の範囲内-...

Discussion

循環するmiRNAは、非常に低濃度で血液中に存在し、血漿および血清試料から抽出することができるRNAの量は低いです。この理由のため、それらは、マイクロアレイおよびRNA配列のような他の技術を用いて定量化することは困難です。また、データの正規化と血液中の内因性の「基準」のmiRNAの存在に合意の一般化が欠如しています。この文脈において、液滴デジタルPCRのような敏感な技術は、非常に低い場合には、血清または血漿の1mlあたりのmiRNAのコピー数をカウントすることが可能な、非常に魅力的です。私たちは、逆転写、したがって、時間を節約し、最も重要な、RNA材料1の反応ですべての循環のmiRNAをユニバーサルcDNAのシステムでこの技術をペアリング。我々のアプローチでは、特異性は、他のソリューション¹⁶と比較した場合のmiRNA定量化は非常に好調LNAプライマーの使用に固有のものです。

滴デジタルPCRは、標的遺伝子の絶対濃度の​​計算を可能にするエンドポイントアッセイです。定量PCRとは異なり、不十分な増幅効率は、最終的なddPCR定量に影響を与えません。したがって、...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
miRNeasy Mini Kit	Qiagen	217004	Columns for total RNA, including miRNA, extraction from serum/plasma
100 nmole RNA oligo Cel-miR-39-3p	Integrated DNA Technologies	Custom	Sequence: UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG
Universal cDNA synthesis kit II, 8-64 rxns	Exiqon	203301	Kit for microRNA
reverse transcription MicroRNA LNA PCR primer set	Exiqon	204000-206xxxおよび2100000-21xxxxx	液滴内部のmiRNA増幅用プライマー
QX200液滴発生器	BioRad	186-4002	液滴読み取り用機器
QX200液滴リーダー	BioRad	186-4003	液滴生成用機器
QuantaSoftソフトウェア	BioRad	186-3007	データ収集・解析
PX1 PCRプレートシーラー	BioRad	181-4000	プレートシーラー
DG8液滴発生器カートリッジとガスケット	BioRad	186-4008	液滴を生成するためにサンプルとオイルを混合するために使用されるカートリッジ
QX200 ddPCR EvaGreenスーパーミックス	BioRad	186-4033/36	PCR supermix
QX200 EvaGreen染料用液滴発生器オイル	BioRad	186-4005	液滴生成用オイル