カッパ（Vκ）に対する抗体の結合特異性軽鎖を含むヒト（IgM抗体）抗体：ポリシアル酸（PSA）ケーススタディとしてNCAMに添付

サマリー

特定のκ(Vκ)軽鎖を持つヒトおよびマウスのIgM抗体の抗原を含むタンパク質部分を特定するためのプロトコルを提示します。このプロトコールは、IgMクラスの抗体に限定されるものではなく、免疫沈降時に抗原を十分に高い親和性で標的とするすべての免疫グロブリンアイソタイプに適用されます。

要約

IgMアイソタイプの抗体は、ヒトの試験、ヒト疾患の動物モデル、および標準的な実験室技術における検出薬剤の潜在的な治療薬としてしばしば無視されます。対照的に、いくつかのヒトIgMは、がんモデルおよび多発性硬化症(MS)や筋萎縮性側索硬化症(ALS)などのCNS障害のモデルで有効性の証明を示しました。彼らが考慮されていない理由には、IgM抗体の発現、精製、安定化の難しさ、(非タンパク質)抗原の同定の難しさ、アフィニティー結合の低さ、炭水化物および脂質研究における基本的な知識のギャップなどがあります。

この原稿では、HIgM12を例に、ウェスタンブロッティング、免疫沈降、免疫細胞化学による抗原検出の詳細なプロトコールを提供しています。HIgM12は、神経細胞接着分子(NCAM)に結合したポリシアル酸(PSA)を標的としています。3つの主要な中枢神経系(CNS)スプライスバリアントNCAM180、140、および120を欠く野生型(WT)およびNCAMノックアウト(KO)マウスの出生後早期マウス脳組織を使用して、HIgM12への結合に対するNCAMの重要性を評価しました。エンドヌラミニダーゼを用いたCNS組織および培養CNS細胞のさらなる酵素消化により、PSAがHIgM12の特異的結合エピトープであることを同定しました。

概要

IgMアイソタイプの抗体は、癌およびCNS障害^1-7を含む様々な疾患の治療のための優れた治療可能性を実証します。 Vollmers '基が腫瘍特異的なバイオマーカーまたはアポトーシス経路^4,8,9を誘導^することによって悪性細胞を死滅させることができる積極的な治療薬としての潜在的な使用のために癌患者における多数の抗体を同定しました。興味深いことに、治療可能性を持つすべての同定された抗体はIgMアイソタイプのものであり、「自然な自己抗体」（NABS）のグループに属しています。

同様に、ロドリゲスのグループは、マウスおよび多発性硬化症（MS）のモデルでは慢性的に脱髄脊髄病変において再ミエリン化を刺激するヒト抗体を同定しました。抗癌作用を有する抗体と同じ、すべての再ミエリン化を促進する抗体がNABSであり、IgMアイソタイプ^1,6,7,10の。ほとんど識別されたIgMのための正確な抗原は、まだundetermineあります人間の再ミエリン化を促進する抗体rHIgM22含むD、現在MS患者¹¹のための第I相臨床試験インチ学術設定でと業界¹¹とのパートナーシップの両方の脂質や糖質研究の分野の専門家による繰り返しの努力にもかかわらず、rHIgM22の抗原は成功していない識別しよう。 IgM抗体で動作するようにIgG抗体の抗原を同定するために使用される標準的な技術の失敗は、これらの抗体、最も可能性の高いターゲット炭水化物や脂質抗原に特異的な方法を改良するための重要なニーズを特定します。

本稿の焦点は、ヒト回生抗体HIgM12とその抗原を識別するために使用される実験手順です。抗体HIgM12は、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症を有する患者から同定された、 試験管 ^12月14日 に神経突起伸長を刺激し、神経細胞接着分子（PSA-NCAに取り付けられたポリシアル酸（PSA）を標的^M）15,16。 HIgM12は、ALS ¹⁷のマウスモデルにおいて寿命を延ばし、タイラーのマウス脳脊髄炎ウイルス（TMEV）に感染したマウスにおける機能転帰を改善します。腹腔内の単一の低用量は、抗体^18を注入した後、具体的には、HIgM12は中小直径脊髄の軸索8週間の慢性脱髄マウスと増加数の自発的な水平および垂直運動活性を刺激します。

神経細胞接着分子（NCAM）のスーパーファミリー、ニューロン、神経膠、骨格筋、およびナチュラルキラー細胞^19-25の細胞表面上に発現される免疫グロブリン（IG）の糖タンパク質です。 NCAM180、NCAM140、およびNCAM120と呼ばれる三大NCAMアイソフォームは、その細胞質ドメインにのみ変化する一次転写産物の選択的スプライシング変異体です。 CNS内では、NCAMが長く、負に帯電したシアル酸のホモポリマーとの主要なポリシアル分子（> 95％）です。ポリシアルAN> 10とCIDは、PSAと呼ばれているが、短いオリゴマー構造はまた、生物学的に関連していることが存在します。 CNSで発現される他のポリシアルタンパク質はSynCAM1 ^26、ニューロピリン^{-2（NRP-2）27,28}であり、ナトリウムチャネルサブユニット^25（総説については^29を参照^されたいです）。

ここで説明する方法にかかわらず、抗体のアイソタイプ（ 例えば、IgG、IgM抗体の特定のカッパ（Vκ）軽鎖（ヒト抗体およびマウス抗体のためのVκI軽鎖のためのVκI、VκIIIまたはVκIV軽鎖）を含むヒトおよびマウスの免疫グロブリンのための抗原同定を可能にします、IgAの、IgDのまたはIgE）。この制限は、IgMアイソタイプの抗体での免疫沈降のためにプロテインLアガロースの使用に基づいています。代替戦略は、より多くのIgM抗体株式会社に、この方法の適用可能性を広げることができる共有結合アガロースビーズに結合マンノース結合レクチンとセカンダリのIgG抗IgM抗体を含むことができます。ラムダ（λ）軽鎖を有するものをluding（説明を参照してください）​​。 1 ^30：健康な個体由来のIgMλ軽鎖と比較して、血清IgMのVκ軽鎖の比率は1.5です。

、分離充実、および免疫学的に特定の分子^31を検出するために、ここで使用したクロマトグラフィーの方法論に基づいて、すべての抗原は、少なくとも一つの小さなタンパク質ドメインを含める必要があります。抗体の特異的結合エピトープは（、糖タンパク質で、 例えばリポタンパク質）タンパク質ドメイン内または外であっても。潜在的な候補者のリストを絞り込むために、それぞれ、HIgM12のための特定の抗原を識別するために使用される初期の生化学的な手順は、このメソッドの中で最も重要なステップです。細胞型特異的調製物および細胞形態学に基づく特徴付けは、グリア細胞のために記載されているが、この方法は、CNS内部または外部の他の細胞型を収容するために外挿することができます。

緊急があります抗体のターゲットは、炭水化物や脂質の構造は特にこれらのケースで異なるヒトの疾患の治療の可能性を持つIgM抗体の増加（IgM型抗原の大多数）に適用可能な新規または変更された技術を開発する必要があります。

プロトコル

動物のプロトコルおよび手順は、国立衛生研究所のガイドラインに従って実施し、メイヨークリニックの制度的動物のケアと使用委員会（メイヨーIACUCプロトコル番号＃A51912）によって承認されました。

1.一般的なCNS組織の準備

1. ヘテロ接合体を交配することによって、ヘテロ接合NCAMマウスと野生型（WT）同腹子（C57 / BL6）（博士リンLandmesser、ケースウェスタンリザーブ大学、クリーブランド、オハイオ州によって提供された）C57 / BL6の背景にNCAM欠損（KO）マウスを生成します。 NCAMノックアウトマウスの遺伝子型決定は、以前^32-34に記載され、さらに詳細には説明しません。

注：1.2ステップ- 1.6はオプションです。

2. 手術の前に、ペントバルビタールソリューションの管理（在庫：25 mg / mlで、出生後早期それぞれの大人のステージのためにペントバルビタールの50/100μl）を腹腔内注射（27ゲージ針と1ミリリットルを経由してシリンジ）。
3. 2分間、または動物が麻酔の外科的平面に達するまで待ちます。麻酔の外科的平面を維持するために、各操作の過程で必要に応じて追加の麻酔薬を投与します。麻酔の深さを決定するために、つま先のピンチ応答メソッドを使用します。動物は、続行する前に応答しなくなければなりません。
4. ちょうど胸郭の下に外皮および腹壁を通して1センチメートル横切開 - 0.5にします。慎重にダイヤフラムから肝臓を分離します。湾曲した、鈍いはさみを使用して、振動板に小さな切開を行います。胸膜腔を公開するために胸郭の全長に沿って横隔膜切開を続けます。
5. 慎重に肺を変位、胸郭の一方の側に沿って湾曲し、鈍いはさみを置き、鎖骨に胸郭アップカットスルーを行います。対側に同様のカットを行います。離れて胸骨を持ち上げる、慎重に心にそれを接続する任意の組織をトリミング。
6. 動物に切開を作りますできるだけ大きなアウトレットを作成するために、虹彩のはさみを使用して、右心房。ゆっくり動物の左心室の中にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を10mlを注入（赤色光、流速：1ml /分）を27ゲージ針を備えた10mLのシリンジを使用して。組織破壊を回避するために、灌流中に圧力/ PBSの流れを増加させないでください。
7. 外科用ハサミを使用して、新生児マウスに首を切ります。
8. 鉗子で眼窩をつかんによって、および脊柱の中に小さなハサミを挿入することによって、脳を削除してください。耳のレベルで前方に向かって頭蓋骨をカットします。ピールバックスカル、ゆっくり氷（ 表1）氷のように冷たい解剖培地10mlを充填した60ミリメートルペトリ皿に脳を置きます。 1.5ミリリットルのマイクロチューブにそれぞれ脳を置き、直ちにドライアイス（-79ºC）に格納します。
9. 氷の上できれいなカミソリの刃を使用して、凍結した脳から小脳や脳幹を切開。組織を解凍避けるために、迅速に作業。
10. 量りますμlの溶解緩衝液あたり150μgの脳組織の最終濃度まで凍結大脳、氷上で15 mlチューブに入れ、氷冷溶解緩衝液を追加する（ 表1参照）。残りの大脳のために繰り返します。 1.11 - ステップ1.9のためにすべての回で氷の上で脳を保管してください。
11. 27ゲージの針（10倍）を搭載した5mLのシリンジを介して粉砕し、続いて1mLのピペットチップ（10倍）を介して粉砕して、溶解緩衝液で脳をホモジナイズします。完全な組織の溶解を可能にするために、氷上でさらに30分間脳溶解物をインキュベートします。
12. （4℃で10分間19000×gで4ラウンド）界面活性剤不溶性材料と脳シリアル遠心分離を介して脂質を除去。廃棄（白）ミエリン、ペレットを含む細胞の破片が、すべての遠心分離工程後の上清を保持しています。 -80ºCでアリコート脳溶解物およびストア。

大脳からの「プルダウン」をエージェントとしての人間のIgM（HIgM12とアイソタイプコントロールのIgM）を使用する2.免疫沈降WT lの溶解物とNCAM KOマウス

1. プロテインLアガロースビーズ準備^9,35,36
   1. BSA（ 表1参照）を含むIP緩衝液の200ミリリットルを準備します。 BSAせずに同じIPバッファの別の200ミリリットルを準備します。
   2. 免疫沈降反応転送1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブに200μlのピペットを用いて、プロテインLアガローススラリー100μlのあたり。プロテインLアガロースビーズをボルテックスしないでください！各チューブに（ 表1参照 ） を IP緩衝液1mlを加えます。反転（5回）を介して手動でプロテインLアガロースおよびIPバッファを混ぜます。
   3. 卓上型遠心分離機（千×gで、2分間、25ºC）で遠心分離することによって、タンパク質Lアガロースビーズを4回洗浄します。アガロースペレットを乱すことなく、200μlのピペットを用いて上清を脱ぎます。繰り返し洗濯は2.1.2 3 2.1.3への追加の回を繰り返します。
   4. 4ºCで終夜ローラー上に新たに追加されたIP緩衝液1ml中にプロテインLアガロースを平衡化します。
2. ウェスタンブロットでの抗体-抗原-アガロースL複合体の形成および抗原の検出
   1. 4ºCでローラー上で一晩1.5mlの微小管にIgM抗体（HIgM12）20μgので氷冷IP緩衝液1mlに溶解した脳組織（〜200μlの溶解液）30mgをインキュベートします。
   2. 千XG、4ºCで2分間ベンチトップ遠心分離機で（ステップ2.1.4から）プロテインLアガロースビーズをスピンダウン。アガロースペレットを乱すことなく、200μlのピペットを用いて上清を捨てます。 1ミリリットルピペットを用いてタンパク質Lアガロースに（ステップ2.2.1から）チルド抗体脳ライセート溶液を追加します。
   3. 4ºCでローラー上で2時間、抗体 - 抗原タンパク質Lアガロース懸濁液をインキュベートします。 2分、4ºC1000×gの遠心分離を介してLをアガロースに結合させた抗体 - 抗原複合体を洗ってください。ペレットを乱さないように注意して上清を廃棄し、0.2％BSAを含む氷冷IP緩衝液1mlを加えます。
   4. 0.2％BSA及びBSAなし氷冷IP緩衝液を用いてさらに2回を含む氷冷IP緩衝液を用いて洗浄工程をもう一度繰り返します。
   5. 2分、4ºC1000×gでLをアガロースに結合させた抗体 - 抗原複合体をスピンダウン。完全に最初の溶液50μlを10μlのピペットに続くプロテインLアガロースペレットの上に残っている〜まで200μlのピペットを用いて上清を捨てます。氷上でサンプルを保管してください。
   6. IPの溶出緩衝液の40μl加え95ºCで5分間1.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ、指のフリック管6回と熱あたり（ 表1参照）。 2分間氷上にサンプルを入れて、13,000×gで30秒間スピンダウンし、4ºC。
   7. ペレットを乱すことなく新し​​い1.5 mlマイクロチューブに10μlのピペット（〜35μlの合計）を用いて上清を移します。内管壁に溶出された試料の少量をダウンすすぐことによってプロテインLアガロースビーズが存在しないことを確認します。
      注：「粒状」タンパク質Lアガロースビーズ存在する場合はっきりと見えます。
   8. プロテインLアガロースビーズが存在する場合、13,000×gでさらに30秒間試料をスピンダウンし、チューブを洗浄するために上清を移します。何アガロースビーズが検出されなくなるまで、手順を繰り返します。
   9. 負荷10 -トリス/グリシン/ SDS緩衝液系におけるSDSポリアクリルアミドゲル上でウェル当たり溶出サンプルの20μlの（ 表1参照）。
      注：使用して7.5％または4 - PSA-NCAMまたはNCAMアイソフォーム（ゲル寸法（幅×長さ×厚さを検出するためのウェルあたり50μlのローディング体積で20％勾配ゲル：8.6 X 6.7 X 0.1センチメートル）。
   10. ベンチトップで100 V（1.74 V / cm ^2）でで〜1時間ゲルを実行します。追加の冷却は、このステップ^37,38のために必要とされていません。
   11. （ 表1を参照） - （10ºC5）コールド転送バッファを使用して100 V（1.74 V / cmの^2）での低温室で2.5時間、PVDF（ポリフッ化ビニリデン）膜（孔径0.45μm）に伝達タンパク質。
   12. ブロック膜ワット10％ベンチトップオービタルシェーカー上で25ºCで1時間、PBS-Tで（w / v）の乾燥粉乳i番目、PBS-5％BSA中で一晩、一次抗体をPBS-Tとプローブとの10分間の二回膜を洗浄寒い部屋でオービタルシェーカー上のT。
   13. 25ºCで簡単に過剰のPBS-Tで翌朝洗浄膜1時間は10分でオービタルシェーカー上の各（80回転）をPBS-Tで3回洗浄した（ふたと容器を含む）（すべての洗浄工程を25で実施されますºC）。
   14. オービタルシェーカー上で25ºCで1時間のためにPBS-Tで5％ドライミルクパウダー30,000）（70回転数：二次抗体（西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）がHIgM12のための抗ヒト抗IgM抗体を（抱合）（希釈1を追加します。 ）。
   15. ウォッシュ膜が広範囲に25ºCで簡単に過剰のPBS-Tで1時間は10分でオービタルシェーカー上の各（80回転）をPBS-Tで3回洗浄した（ふたと容器を含む）（すべての洗浄工程は、25ºCで行われています） 。
   16. チルド強化chemiluminescenの1ミリリットルを混ぜます25ºCで（ミニブロットあたり）成分B（酸化剤）の1ミリリットルでのce HRP基質成分A（強化ルミノール試薬）。
   17. （非常に縁でそれらを保持）過剰な液体を除去するためにペーパータオルの上膜を転送するためにプラスチック製のピンセットを使用してください。ペーパータオルでドライコンテナやコンテナ（各膜のための1）に戻し膜を置きます。すぐに各膜に予備混合し、増強化学発光HRP基質（化合物A + B）（ステップ2.2.16。）の2ミリリットルを追加し、オービタルシェーカー（90回転）に25ºCで2分間インキュベートします。膜を均一に化学発光試薬によって湿らせていることを確認します。
   18. 透明なプラスチック製のスリーブへの転送の膜をし、ペーパータオルで余分な液体と気泡を除去します。フィルムカセットにプラスチックスリーブ内膜を入れて、最終的にはカセットにプラスチック製のスリーブをテープで固定します。カセットを閉じます。
   19. 暗室にカセット、フィルム、タイマーやはさみを取ります。各Fiのから右上隅を遮断配向のためにLM、時間の異なる期間（異なる）フィルム（10秒、1分、10分）を露出し、フィルム現像液中膜を開発します。

3. Endoneuraminidase-NF NCAM ³⁹に取り付けられているPSAの消化

1. 表2 ³⁹に示すように、生後日（P）7 WTマウスとP7 NCAM KOマウスからのダイジェスト溶解した脳組織はendoneuraminidase-NF（ENDO-NF）を使用して、氷上で2時間（ステップ1.12から調製します）。
2. ステップ3.1（ 表2）から- （6 1）各チューブに4倍Laemmliサンプルバッファー5μlを添加します。
3. 4上の負荷サンプル - 20％勾配SDSポリアクリルアミドゲルとリピートは2.2.19に2.2.10繰り返します。 PBS中5％BSAでHIgM12（を1μg/ ml）を、市販の抗PSAモノクローナル抗体（クローン2-2B）（1μg/ ml）およびβアクチン抗体（ローディングコントロール）（1μg/ ml）でプローブ膜-T。

ラットとマウスのCNS文化の4準備

1. ガラスカバースリップの準備
   1. ガラス容器を使用して、ドラフト中16時間 - 4のための60ºC - 50で1MのHClにおける酸洗浄25ミリメートルのガラスカバースリップ。時折穏やかに旋回を介してカバースリップを攪拌します。
   2. 蒸留水（3×）で広範囲にカバーガラスを洗ってください。積み重ねられたカバースリップの間に酸を洗い流すようにしてください。
   3. 100％エタノール中でカバースリップを洗浄し、細胞培養フード中でパラフィルム上に乾燥します。ある日の使用前に、オーブンで100ºCで蓋付きのガラス容器中で24時間、カバーガラスを加熱します。
   4. 37ºCで1時間滅菌水で40 / mlのポリ-D-リジン3mlで6ウェルディッシュとコートでカバーガラスを置きます。
   5. 滅菌水で2回洗浄、細胞培養フードの下で完全に乾燥させ、20分間UV光を適用します。
2. CNS細胞のための組織培養プラスチックの調製
   1. 3でコート60 mmの細胞培養皿または75cm ²の組織培養フラスコmlまたは10ミリリットル、それぞれ、37ºCで1時間滅菌水中/ mlのポリ-D-リジン40μgのの。
   2. 細胞培養フードの下で完全に乾燥させ、20分間UV光を適用し、水で2回洗浄します。
3. ラット混合グリア・アイソレーション⁴⁰
   1. IACUCに新生児ラットを麻酔は（完全自動化）CO ₂ガスの供給と齧歯類安楽死室を承認しました。動物の無応答性を決定するために、つま先のピンチ応答メソッドを使用します。 （ - 一度に10仔6）新生児のスプラーグドーリーラット（P0P1）を刎ねます。
   2. 鉗子で眼窩をつかんによって、および脊柱の中に小さなハサミを挿入することによって、脳を削除してください。耳のレベルで前方に向かって頭蓋骨をカットします。ピールバック頭蓋骨と優しく氷氷のように冷たい解剖培地10mlを充填した60ミリメートルペトリ皿（ 表1参照）に脳を置きます。
   3. （ - 10仔6）残りのラットの子のために繰り返します。 4.3.7 - 手順4.3.2氷上で組織を保管してください。
   4. 2大脳半球に正中線に沿って大脳を分割し、その後、嗅球を遮断、大脳皮質とデュモン鉗子で海馬以下基底核。氷上で解剖培地を含むきれいなペトリ皿に孤立した大脳皮質を置きます。
   5. 1皮質を取ります。解剖顕微鏡下で微細な先端を有する鉗子で髄膜を除去します。
   6. 残りの皮質に繰り返します。氷上で1きれいなペトリ皿にすべて髄膜フリー皮質を置きます。
   7. 60ミリメートルペトリ皿にすべての仔から皮質半球を合わせ、みじん切り1ミリメートル片に脳組織をダイシングする滅菌カミソリの刃を使用します。
   8. 無菌の、コーティングされていない500ミリリットルのガラスフラスコに10ミリリットルピペットを用いてみじん切り脳組織を移し、ラット脳あたりの氷のように冷たい解剖培地10mlを追加します。ラット脳当たりHBSSの9ミリリットルにHBSS（ハンクス液）中のトリプシン溶液の1ミリリットル（5 mg / mlでトリプシン）を加えながらゆっくりフラスコを旋回。 2を追加します。DNアーゼI溶液（1mg / ml）し、MgSO ₄溶液中の総体積の2％の総体積の％（HBSS中の3.82％のMgSO _4（W / V））脳組織懸濁液を、穏やかに旋回。
   9. 37ºCで30分間回転シェーカー上で穏やかに振盪下でトリプシン処理組織。組織片は、このステップ中に浮遊していると、底に沈殿しないことを確認してください。必要に応じて回転速度を上げます。
   10. 10％（V / V）の最終濃度になるようにウシ胎児血清（FBS）を追加し、10秒間フラスコを10回旋回することによって混合します。 15分間氷水で組織懸濁液をクールダウン。スワールを静かに5回毎秒分をフラスコ。
   11. ゆっくり200×gで、4ºCで25ミリリットルまたは50ミリリットルのピペットと5分間の遠心分離器を使用して滅菌50mlチューブに組織懸濁液を移します。
   12. 上清を捨て、ゆっくりとウシ胎児血清の5ミリリットルを補足した氷冷解剖培地15ミリリットル、0.4ミリリットルのMgSO ₄溶液（3.82パーセントで消化CNS組織を再懸濁HBSS中MgSO _4）し、DNアーゼI（1 mg / mlで）1.6 mlです。
   13. 懸濁液は濁っ/乳白色になるまで均等にゆっくりと2の滅菌15ミリリットルチューブ（〜10ミリリットルずつ）とに分割組織懸濁液は、10 mlピペット（10回）を使用して粉砕します。次のチューブの処理中に氷の上に懸濁した細胞を保管してください。残りの消化されたCNSは、チューブの底に沈殿物を組織するまで3分間待ちます。ペレット画分を乱すことなく50ミリリットルチューブをきれいにするために上清を移します。
   14. 必要に応じて、40ミクロ​​ンの細胞ストレーナーを通して濁った上清を通過させ、氷上の無菌の50ml試験管に、得られた単一細胞懸濁液を組み合わせます。
   15. 200×gで、4ºCで5分間細胞スラリーをスピン。
   16. メディアを解剖する〜2ミリリットルの細胞ペレットの上に残されるまで、慎重に10ミリリットルのピペットを用いて上清を除去します。
   17. 50mlチューブ（〜10倍）で指フリック細胞ペレット。穏やかながらゆっくりと細胞懸濁液に（ 表1参照）暖かい増殖培地の5ミリリットルを追加します。チューブを旋回手。
   18. 必要に応じて、目に見える組織クラスタまたはDNAの塊の場合には、新鮮なDNアーゼI溶液、そしてMgSO ₄ -溶液と氷上でさらに10分間のDNaseステップ4.3.12を繰り返します。スワールチューブ手動で5回毎秒分。
   19. プレート6ウェルディッシュ中の400μlの増殖培地の水たまりで25ミリメートルのガラスカバースリップあたり50,000個の細胞と細胞は細胞培養インキュベーター（5％CO _2、37ºC）で30分間添付してみましょう。
   20. コンフルエントのための（24以内- 48メッキ後の時間）60ミリメートル細胞培養皿と75cm ²の組織培養フラスコ、プレート500,000個の細胞（60ミリメートル皿）または2万個の細胞（75cm ²のフラスコ）。
   21. 静か各ウェルに2ミリリットル（6ウェルディッシュ中のウェルあたり、25ミリメートルのガラスカバースリップ）、暖かい増殖培地の3ミリリットル（60ミリメートルディッシュ）または10ミリリットル（75cm ²のフラスコ）を追加します。一晩細胞をインキュベートし、翌朝培地を完全に変更します。次に、培地一日おきに（3日目、5日目、7日目、 など ） を変更します。
       いいえテ： - メッキ後48時間ラット混合グリア培養物は、免疫細胞化学または生化学24のた​​めに使用する準備が整いました。
4. マウス混合グリア培養
   1. 4.3.6へのセクション4.3.1で説明した新生児ラットの脳の解剖と同一の、脳を除去し、氷冷解剖培地に入れ、C57 / BL6の背景にP0の新生児WTとNCAM KOマウスを刎ねる（ 表1参照）。すべての回で氷上で組織を保管してください。
   2. 2大脳半球に正中線に沿って大脳を分割し、その後、嗅球を遮断、大脳皮質とデュモン鉗子で海馬以下基底核。氷上でHBSSを含むきれいなペトリ皿に孤立した大脳皮質を置きます。
   3. 1皮質を取ります。解剖顕微鏡下で微細な先端を有する鉗子で髄膜を除去します。残りの皮質に繰り返します。氷上で1きれいなペトリ皿にすべて髄膜フリー皮質を置きます。
   4. 皮質hemispheを転送独立した、無菌の15ミリリットルチューブに各マウスから1ミリリットルピペットで解像度。各脳に1.2ミリリットルの氷冷解剖培地を追加し、機械的にそれを2回までと1ミリリットルピペットチップを使用してダウンをピペッティングすることにより脳組織を崩壊させます。
   5. 150μlのパパイン溶液（PBS中10mg / ml）を、100μlのDNアーゼI溶液（HBSS中1mg / ml）を、各脳へ50μlの_硫酸マグネシウム（HBSS中の3.82パーセント）を追加し、指のフリックによって混ぜます。
   6. 水浴中で37ºCで30分間脳のサスペンションをインキュベートし、指のフリックすることにより、脳の懸濁液を毎秒分を混ぜます。 、チューブ当たりFBSの1ミリリットルを加え混合し、氷上で10分間、組織懸濁液を冷却。
   7. 200×gで4分間の脳組織をスピンダウンし、4ºCおよびDNアーゼI溶液70μlの（HBSS中で1mg / ml）し、MgSO ₄溶液を30μlを補充した氷冷解剖緩衝液1mlで組織ペレットを再懸濁（HBSS中の3.82パーセント）。
   8. FBSでコーティングされた1mLのピペットチップを使用して、脳組織を粉砕します（〜5倍）上清を濁るまで。 40ミクロ​​ンの細胞ストレーナーを通して上清をパスし、氷の上にきれいなチューブに移します。
   9. 200×gで、4ºCで5分間の遠心分離を介して混合グリア細胞をペレット化。培地〜100μLまで吸引上清を細胞ペレットの上に残されます。指フリック（〜5倍）と暖かいマウスの増殖培地の1ミリリットルを追加することによって再懸濁細胞ペレット（ 表1参照）。
   10. 必要に応じて、目に見える細胞クラスターおよび溶解した細胞を溶解/そっと細​​胞懸濁液アップと（5回）をピペッティングしてDNAを沈殿させました。
   11. 4.3.21 - ステップ4.3.19で説明したようにPDLでコーティングされたガラスカバースリップまたは60 mmディッシュにプレートマウス混合グリア細胞。暖かいマウスの成長培地、その後隔日で翌朝細胞を洗浄。めっき後72時間 - マウス混合グリアは、免疫細胞化学48に使用する準備ができています。
5. ラットミクログリアの分離
   1. 培養ラットを混合します10日間増殖培地中で75cm ²の組織培養フラスコ中のグリア（ 表1参照）。 1時間140 rpmで細胞培養インキュベーター（5％CO _2、37ºC）内部の回転シェーカー上で混合膠細胞培養からミクログリア細胞クラスターを振り払います。
   2. 、混合グリア培養物からミクログリアを含む上清を脱いで40ミクロ​​ンの細胞ストレーナーを通してそれを渡し、滅菌50mlチューブに細胞懸濁液を保ちます。
      注：ミクログリア培養物は、いくつかの汚染のOPCと非常に少数のアストロサイトと、この工程の後に、典型的には> 95％純粋です。
   3. 必要に応じて、将来のミクログリアシェイクオフのための混合グリア培養で増殖培地を交換してください。典型的には、混合グリア培養物から（1週間に1回）複数のミクログリアシェイクオフを行います。
   4. 任意選択的に、純度が高い95％のプレート100 mmのペトリ皿あたりミクログリア含有上清（ステップ4.5.2）10mlのを取得し、37ºCで30分間、細胞培養インキュベーター中でインキュベートします。のみmicroglアストロサイトとのOPCが上清中に残っている間、とりわけ、ペトリ皿に添付します。
   5. 静かに細胞培養フード内で時計回りと反時計回り（5回ずつ）ペトリ皿を振ります。吸引し、細胞培養培地を完全成長培地10mlで置き換えます。得られた小膠細胞培養物を> 98％の純度です。
   6. DMEMで最大7日間培養ミクログリアを、1％FBSおよび1％ペニシリン/ストレプトマイシンを補充しました。
6. ラットOPC /オリゴデンドロサイトの分離
   1. 高度に濃縮されたOPC培養物を1時間140 rpmで細胞培養インキュベーター（5％CO _2、37ºC）内の回転シェーカー上75cm ²のフラスコ中で増殖させ10日齢の混合グリア培養物から最初のミクログリア細胞を振り払う取得するには。ミクログリアのみ含有上清を廃棄またはミクログリア固有の実験（ステップ5.5を参照）に使用します。
   2. 10ミリリットルの成長培地とミクログリア含有上清を交換し、混合膠細胞培養を振り払います200回転（5％CO _2、37ºC）で回転シェーカー上の別の18時間。
   3. 混合グリア培養物からmicroglia-とOPC含有上清を収集し、40ミクロ​​ンの細胞ストレーナーを通過します。滅菌50mlチューブ中の細胞懸濁液を収集します。
   4. 必要に応じて、今後のOPCシェイクオフのための混合グリア培養で増殖培地を交換してください。
      注：OPCには、よ​​り低い収率ではあるが、アストロサイトのフィーダー層上で増殖し続けると振とうオフすることができます第二および第三回（週1回）。
   5. プレートmicroglia-〜100mmのペトリ皿に上清をOPC含有し、37ºCで30分間、細胞培養インキュベーター中でインキュベートし、10mlの。 OPCのとアストロサイトが上清中に残っている間ミクログリアは、ペトリ皿に添付します。
   6. 静かに細胞培養フード内で時計回りと反時計回り（5回ずつ）ペトリ皿を振ります。細胞培養インキュベーターから一度にわずか数ペトリ皿を取り出し（ミクログリアは、ペットからの脱落を開始します里料理クーラー培地中で激しく振とう）。
   7. 50mlチューブでOPC含有上清を収集し、組み合わせます。必要に応じて、小膠細胞特異的実験で使用するためのペトリ皿に培地を加えます。
   8. 必要に応じて、さらにOPC培養物の純度を高めるために、OPCの準備にミクログリアの程度を下げるために、新鮮なペトリ皿で​​一回のステップ5.6.5と5.6.6を繰り返します。
   9. 250×gで、4ºCで5分間遠心分離器で濃縮されたOPC含有上清をスピンダウン。静かに細胞ペレットを乱すことなく、上清を吸引除去します。 （10回）ペレットの上に上清の3ミリリットルを残すとフリック指でのOPCを再懸濁開始。
   10. （ - 10倍5）10 mlピペットを用いて、ゆっくり粉薬OPC細胞クラスター。
   11. 細胞を計数し、6ウェルディッシュに400μlの増殖培地のパドル25ミリメートルのガラスカバースリップ（PDLでコーティングされた）あ ​​たり50,000のOPCをプレートし、細胞を細胞培養インキュベーター（5％CO _2、37、30分間付着させ6; C）。静かに各ウェルに暖かい増殖培地（ 表1を参照）の2ミリリットルを追加します。増殖培地の3ミリリットルで150万のOPC - PDLでコーティングされた60ミリメートル細胞培養皿、プレート1のため。
   12. 慎重に（正しく接続してくださいのOPCを行い、培地交換の際に取り除くしない）のOPCをメッキした後、新鮮な増殖培地3時間でFBS含有増殖培地を交換してください。交換媒体ごとに二日目。
       注：ラットOPC培養物は、典型的には、星状細胞、続いて主要な汚染細胞型としてミクログリア90％純粋であり、このプロトコルを使用して調製。

初代グリア細胞にHIgM12を使用5.免疫細胞化学

1. HIgM12、抗PSAモノクローナル抗体、およびWTとNCAM KOマウスからの一次グリア細胞における細胞型特異的マーカーを使用してトリプルラベル免疫蛍光
   1. 生細胞条件下では、ラベル60％コンフルエントマウスPDL-コーティングされた上に成長させたWTおよびNCAM KOマウスからグリア培養を混合HIgM12（10μg/ ml）及びPBS中の抗PSAモノクローナル抗体（クローン2-2B）（10μg/ ml）で25ミリメートルのガラスカバースリップを30分間4ºCで、10％FBSを補充しました。
   2. 氷冷PBSで各々10％FBSを補充した20秒間細胞を3回洗浄し、25ºCで15分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒド、pH7.4で固定します。
   3. PBSで各々10％FBSを補充した1分間固定した細胞を2回洗浄し、25ºCで2分間PBS、pH7.4中の0.1％のTriton-X100で細胞を透過性。低温室で4ºCで一晩、10％FBSを補充した1分間細胞を2回洗浄し、グリアマーカーGFAP（アストロサイト）またはPBS中のIBA-1（ミクログリア）（1μg/ ml）でラベル。
   4. DAPI含有封入剤^31を含む標準的な免疫条件に進みます。
      注意：人間のための二次抗体（HIgM12）およびマウス（抗PSAモノクローナル抗体、クローン2 - 2B）として使用し、蛍光のFab ₂フラグメントを標識したIgMを強くお勧めします。
   5. FLを取ります60Xまたは100Xの倍率でuorescent画像。同一のすべての画像およびプロセスイメージに対して同じ機器設定を使用します。
2. 一次抗体としてHIgM12を使用してENDO-NF処置WTグリア細胞の免疫蛍光標識
   1. たNeurobasal Aで3日間増殖させた培養WTマウス混合グリア細胞は、PDLコーティングされたの25mmカバーガラス上で、10％FBS及びB27サプリメント（1：50）を補充しました。 1mLの培地にENDO-NF（30μgの/ ml）を加え、細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO _2）で一晩インキュベートします。
   2. 5.1.5へのステップ5.1.1で説明したようにラベルの細胞は、固定および透過処理後HIgM12と内部アストロサイトマーカーGFAPと寒さの中に住んでいます。 60Xまたは100Xの倍率で蛍光画像を撮影します。すべての画像に同じ機器設定を使用して、同じように処理します。

結果

このセクションでは、CNS中のヒトIgM特異PSA抗原を研究することによって得られる結果の例を示します。生化学的な設定で、蛍光免疫細胞化学により特定のVκ軽鎖を含むヒトIgM抗体の使用が示されています。

HIgM12は、脳の脳溶解物からの抗原を免疫沈降し、ウェスタンブロットで検出エージェント（一次抗体）として機能します。どちらのアイソタイプ対照抗体もアガロースLビーズは、プルダウン（ 図1）の特異性を示す類似の抗原を、免疫沈降します。 WTとNCAM KOからCNS溶解物を用いたウエスタンブロットは、マウスは、PSA-含むNCAM（ 図2A）にHIgM12結合の特異性を実証します。 ENDO-NFを使用して、WTマウスからのCNS ​​組織の酵素消化はHIgM12に対する特異的な結合エピトープ（ 図2BとNCAMに取り付けられたPSAを識別する）。本明細書に概説された方法を用いて、高純度のIBA-1陽性ラットミクログリア培養物（ 図3）が得られます。市販の抗PSA抗体（クローン2-2B）は固定で、細胞表面や内部PSAプールにラベルを付け、蛍光顕微鏡によりIBA-1陽性ミクログリア細胞を透過処理しません。 HIgM12は、精製されたラットミクログリアにおける細胞表面抗原にラベルを付けていないミクログリア^16,41におけるPSA-NCAMのない細胞表面発現を報告していない、以前に発表された文献と一致し。興味深いことに、特定の細胞小器官（ 図3）に限定されるものではなく、細胞内での固定と透過処理ミクログリア結果、核周囲パターンのHIgM12ラベリング。結果は、ゴルジ体⁴¹のレベルでミクログリアにおいてPSA-SynCAMを標的とする抗PSA IgG抗体（クローン^735）26を用いて得られたものとは対照的です。

ミクログリアとは対照的に、HIgM12そして生細胞の状況（ 図4）の下に高度に濃縮されたラットOPC培養物におけるA2B5の標的細胞表面抗原。 OPC培養物は、ミクログリア細胞を汚染〜5％が含まれている。 図5は、GFAP陽性アストロサイト（ 図5A）でHIgM12および抗PSAモノクローナル抗体（クローン2-2B）との間に実質的に同一の細胞表面染色パターンを示しています。 HIgM12を使用して制御処置WT星状細胞を緩衝するために比較ENDO-NF-消化WT星状細胞の免疫蛍光標識はアストロサイトのPSA（ 図5B）の存在を示しています。 インビボで PSA陽性アストロサイトの存在は、まだ確認されなければなりません。

図1：HIgM12は免疫沈降で「プルダウン」をエージェントとして機能する免疫沈降HIgM12を使用して、3ヶ月齢のマウスの脳全体の溶解物から、ヒトアイソタイプコントロールHIgM唯一の「プルダウン」剤として126またはアガロースLビーズ。溶出したタンパク質はHIgM12に対してプローブした膜を用いたウェスタンブロットで行いました。 （ - 73 kDaの〜65）のIgM重鎖に加えて、200キロダルトン - HIgM12コーティングビーズから溶出したタンパク質の分子量は、160の範囲でした。この図は、Jから変更されています^{Neurochem。15。} この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2：HIgM12はNCAMのポリシアル酸（PSA）部分を対象としています。 P7、P13、P16とP27 NCAMの総KOマウスおよびヘテロ接合同腹子対照からA.脳ホモジネートは、ローディングコントロールとしてHIgM12、PSAおよびβアクチンに対するプローブした膜を用いたウェスタンブロットで行いました。 、Jから変更されています^{Neurochem。15。} この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3：ラットミクログリア上のPSAの不在がHIgM12ラベリングの欠如によって反映されたラットミクログリアは、ポリ-D-リジンコーティングしたカバーガラス上で48時間培養し、HIgM12と氷の上またはHIgM12または抗で固定した後、ライブの標識のいずれか。 -Psaモノクローナル抗体（クローン2-2B）。細胞は、トンでしたripleミクログリアマーカーIBA-1（緑）、HIgM12 / PSA（赤）およびDAPI（青）で標識しました。画像は、ミクログリア細胞表面HIgM12（上段）および抗PSAは、初代ラットミクログリア（下段）で、細胞表面や内部に格納する（クローン2-2B）の結合の欠如を使用して、結合の欠如を示しています。双極性形態およびIBA-1染色の欠如に基づいて、小PSA陽性細胞（下段）がOPCであることが示唆されました。固定した細胞では、HIgM12染色は、特定の細胞小器官に限定されませんでしたし、非特異的結合（中段）と考えられていたpunctated、核周囲のパターンが得られた。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4：HIgM12 は、ラットのOPC上の細胞表面PSA-NCAMをターゲットラットのOPCとミクログリアがcultuました。HIgM12またはA2B5（緑）、内部マクロファージ/単球マーカーCD68と氷の上で生きて標識されたポリ-D-リジンコートしたカバーガラスとトリプル上の増殖培地中で4日間、赤（クローンED-1）（赤）およびDAPI（青） 。画像は、OPCマーカーA2B5（上段）といくつかのCD68陽性ミクログリアとHIgM12（下段）（〜5％）のための細胞集団がすぎなかっ正示します。位相コントラストとDAPI画像は各集団のための細胞の完全性と細胞数を明らかにするために追加されました。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図5：HIgM12 と抗PSAモノクローナル抗体は、マウス混合グリアにおけるアストロサイトの亜集団を共同標識。アストロサイト、オリゴデンドロサイト系譜細胞およびマイクログラムを含むWTおよびNCAM総KO動物からA.マウス混合グリア細胞LIAは、3日間培養し、HIgM12（緑）、抗PSAモノクローナル抗体（クローン2-2B）（赤）、続いてアストロサイトマーカーGFAP（紫）およびDAPI（青）のために氷上でのライブラベルされました。 HIgM12および抗PSAはGFAP陽性WTのアストロサイト上の仮想同一の染色パターンを明らかにしたがNCAM KOマウスから培養アストロサイトへの結合を欠いています。この図は、Jから変更されていますA.で説明し、（親切に博士マルティナMuehlenhoff提供）endoneuraminidase-NFまたはPBSコントロールで一晩処理として^{Neurochem。15。B.}混合グリアは、同じように培養しました。細胞をHIgM12と氷（緑）でライブ標識し、その後、内部マーカーGFAP（赤）およびDAPI（青）について染色しました。 HIgM12をPBS-コントロール処置混合膠細胞培養の細胞表面抗原を標的とするがendoneuraminidase-NFはない混合グリアを治療しました。この図は、JNSCI ¹⁶から変更されている。 PLこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックして容易になります。

すべての画像は同一の機器設定を使用して、60Xの倍率で撮影したと同じように処理しました。

表1：バッファおよびソリューションのレシピ この表をダウンロードするにはこちらをクリックしてください。

	CNS組織	ENDO-NF / PBS	溶解バッファー	全容積
1. WTマウス	67μgの（0.45μL）	2μL（12μgの）ENDO-NF	7.55μlの	10μlの
2. WTマウス	67μgの（0.45μL）	2μlのPBS	7.55μlの	10μlの
3. WTマウス	67μgの（0.45μL）	無PBSまたはENDO-NF	9.55μlの	10μlの
4. NCAM KOマウス	67μgの（0.45μL）	2μL（12μgの）ENDO-NF	7.55μlの	10μlの
5. NCAM KOマウス	67μgの（0.45μL）	2μlのPBS	7.55μlの	10μlの
6. NCAM KOマウス	67μgの（0.45μL）	無PBSまたはENDO-NF	9.55μlの	10μlの

表2：P7 WTとNCAM KOマウスからのCNS ​​組織のENDO-NF消化。

ディスカッション

ヒトの天然のIgM自己抗体は、免疫療法の候補を訴えており、癌およびCNS障害^1-7を含む様々な疾患の治療のための治療の可能性を実証しました。有利なことに、これらの抗体は、中和抗体の生成が実質的に効果的な治療用量および有効性を低減する免疫応答を誘発しないであろう。重要なことは、治療可能性を持つすべての抗体はIgMアイソタイプのあったとのNAbレパートリー^{3-5,8,9,37,40,42-45}に属しています。 IgM抗体の潜在的な臨床応用のための主要な障害は、多くの場合、未決定され、それらの抗原の同定です。 IgG抗体のために使用される標準的な技術は、多くの場合、IgM抗体の抗原を同定するために適用されません。

このプロトコルは、動物モデルにおいて有効で、回生ヒトIgM抗体HIgM12のための抗原として​​PSA-NCAMの同定を記載しますMSおよびALS ^15-18の。使用した方法にかかわらず、抗体のアイソタイプの、VκI軽鎖を有する特定のVκ軽鎖VκI、VκIIIとVκIVとマウス抗体とヒト抗体全てに主に適用されます。

このプロトコルにおいて最も重要な工程は、アフィニティークロマトグラフィー用途でのIgM抗体の使用です。より具体的には、成功した抗体を単離するか、複雑な組織または細胞培養溶解物から抗原を濃縮するために免疫沈降にプルダウン剤として作用するために必要とされます。濃縮された抗原の画分は、アイソタイプ対照抗体の免疫沈降と比較し、続いて質量分析による差を分析することができます。一つの必須要件またはこの工程の制限は、プロテインLアガロースに結合する抗体を有効にするために適切な抗体Vκ軽鎖および宿主（ヒト、マウス）の存在です。アガロースに結合したマンナン結合タンパク質の使用（また、カレ代わりにプロテインLアガロースのDマンノース結合レクチン）は、特定のVκ軽鎖なしのIgMを免疫沈降させる潜在的な代替手段です。 アーノルドら ³⁵で述べたようにしかし、抗原が結合したIgM抗体は、IgM抗体は、その抗原に結合した後にターゲットグリカンはアクセスできなくなるように見えるように、マンナン結合タンパク質に結合しません。これらの知見に基づいて、マンナン結合タンパク質が抗原負荷のIgM ^35を分子免疫沈降する結合マトリックスとして使用することができません。他の潜在的な代替案は、二次アガロースに結合した抗IgM IgG抗体^46,47または表面活性化磁気ビーズ⁴⁸の使用を使用することがあります。たIgMに対するIgG抗体は、目的の抗原とともに溶出抗体の程度を低減するために、AまたはGアガロースをアガロースに化学的に架橋することができました。首尾よく同定された抗原に対するIgM抗体の免疫沈降の異なる亜種間の適切な比較Iほとんどの免疫沈降を単離またはその抗原のさらなる関心なしのIgMを枯渇させるために行ったので、難しいですね。また、のIgMを用いた免疫沈降は、主に、精製抗原⁴⁹に対する抗体の曝露を有する既知のまたは予想される単一の抗原性を確認するために使用しました。出発物質⁵⁰と比較した場合、免疫沈降血清IgM分子の- （15％10）ヒトのIgMに対して指向アガロース結合IgGの欠点は、非常に低い収率です。対照的に、表面活性化磁気ビーズは、正常スクレーピー関連原線維^48を免疫沈降するためにIgMを含む、異なるアイソタイプの抗体に適用しました。この方法は、特定のκ（Vκ）またはラムダ（λ）鎖、または特定のホストに限定されず、実質的に免疫沈降に使用されるIgM抗体のスペクトルを広げることができます。

プロトコルにおけるもう一つの重要なステップは、DETとして機能する抗体の能力でありますウェスタンブロットまたは他のスクリーニングプラットフォームにおける抗体（一次抗体）をecting。成功した抗体は、抗原はおそらく、非イオン性またはイオン性界面活性剤の存在下での結合を可能にするために十分に高い親和性で、その抗原を標的としなければなりません。高親和性抗体は、親和性成熟IgG抗体間で共通するが、比較的生化学設定でエージェントを検出するなど、いくつかの市販のIgM抗体が存在する理由の一つであるIgMアイソタイプの抗体の間であまり一般的ではありません。抗体の高親和性結合は、分子の抗原の免疫沈降およびウェスタンブロッティングのための必要条件です。洗剤濃度またはIPバッファおよび溶解緩衝液中の界面活性剤が完全に存在しないことを下げると、そのFabドメインを介して低親和性抗体による標的抗原を可能にします。これとは対照的に、そのFc部分を介して、プロテインLアガロースを標的とする抗体の能力は実質的に異なる洗剤concenの範囲にわたってアイソタイプコントロール間で影響を受けることはありませんtrations。しかし、溶解緩衝液およびIP緩衝液中で低い界面活性剤濃度は、細胞膜の破壊および特定の分子の単離を防止します。同様に、ウェスタンブロット洗浄緩衝液中の低洗剤濃度（ 例えば、PBS-T）は、抗原は、低親和性の抗体の結合が、同時に非特異的結合を増加させ、したがって、オプションではないことができます。

抗原タンパク質のコアの存在は、この方法のための別の要件です。翻訳後修飾（ 例えば 、糖タンパク質、リポタンパク質）および非修飾タンパク質ではなく、唯一の脂質または炭水化物とタンパク質は、ウェスタンブロットで検出可能です。界面活性剤の存在下または非存在下で組織または細胞溶解物からの脂質（ 例えば、スフィンゴ脂質）を免疫沈降することができません。同時に、洗剤が破壊するのに不可欠でありながら、界面活性剤および脂質の物理化学的性質は、選択的脂質抗体の相互作用を可能にするにはあまりにも似ています特定の分子を選択的に単離を可能にするために、膜。私たちの最高の知る限りでは、単に炭水化物から成る免疫沈降は、タンパク質コアが存在しない場合には、以前に報告されていません。 IgM抗体はしばしば、必ずしもタンパク質ユニットにリンクされていない炭水化物や糖脂質を、標的とすることから、これは特に関連になります。他のクロマトグラフィー技術は、タンパク質コアの非存在下における脂質と炭水化物の分離および免疫学的同定のために必要とされます。例えば、TLCプレート（免疫TLC）上の後続の抗体検出と細胞脂質の薄層クロマトグラフィー（TLC）は^、51,52に実装することができます。

他の抗PSA抗体が市販の抗PSAのIgMならびにHIgM12と比較した以前の研究と結果に記載されている（クローン2-2B）。 PSAの分野で最も一般的に使用される抗体は、マウスmonocとして利用可能なIgG抗体（クローン735）であり、lonalまたはウサギポリクローナル抗体^53。この抗PSA IgG抗体は、ミクログリア細胞⁴¹を含む種々のCNS ​​細胞型にSynCAMとNCAMのPSAを検出します。抗PSA IgG抗体とは対照的に、ヒトIgM抗体HIgM12、HIgM42および抗PSAマウスIgM（ク​​ローン2-2B）はSynCAMにPSAをターゲットにすることができない（しかしNCAM上）マウスにおける様々な胚および出生後早期の段階で非ポリシアルSynCAM ^15、容易に検出可能です。使用されるIgM抗体はまた、ミクログリア細胞（ 図3 + 4）のPSAを検出することができません。抗体アイソタイプ間で観察された差異のための可能な説明は、抗PSAのIgGと比較して、IgM抗体の結合可能性の低い親和性で結合さPSA-NCAMのレベルに比べて低いPSA-SynCAMレベルであってもよいです。この仮説を検証するために、我々は 15。 E17 WT同腹仔でHIgM12溶出した抗原を使用して、後続のウエスタンブロットにおけるデンシトメトリーによって検出されたIgM重鎖と比較して、PSA-NCAMを「プルダウン」の同様の強度を示した程度のPSA-NCAMを免疫沈降を制御します。この結果は、その標的PSAにHIgM12の少なくとも十分な親和性を示唆しました。 WT同腹子とは対照的にHIgM12はNCAM KO動物でSynCAMに取り付けられたPSAは検出されなかった制御します。同一の結果は、ヒト抗PSAのIgM HIgM42を用いて免疫沈降で得ました。 HIgM12とHIgM42、ならびにマウス抗PSA IgM抗体（クローン2-2B）は、胚および出生後の発達段階でWTとNCAM KO動物からウェスタンブロットでSynCAMにPSAをターゲットにすることができませんでした。特にCNS組織の少量を用いたウエスタンブロットにおいてNCAMに取り付けられたPSAを検出するために必要なHIgM12の少量（0.1μgの/ mlで）（ウェルあたり0.1μgのCNS ​​組織^）15与えられ、単独で低親和性であることがそうであるように思われます3つの異なる方法でHIgM12によるPSA-SynCAM検出の完全な欠如を担当。

我々は、抗PSA IgM抗体としばしば公開抗PSA IgG抗体（クローン735）との間に有意差があると結論付けます。市販の抗PSA IgM抗体がHIgM12が既に異なる疾患モデルにおいて有効性を証明しているので、これは特に興味深いantiPSA IgG抗体735で得られた結果を確認するために、過去においてより頻繁に使用されなかった理由は明らかではありません。他の抗PSA IgM抗体は、同様の治療効果を有することができるが、それは、抗PSA IgG抗体（クローン735）は、MSおよびALSのモデルにおいて同様の治療結果を有するかどうかは不明のままです。

要するに、ここに記載される方法は、MS及びおそらく他の神経変性疾患のための潜在的な臨床試験をサポートするために、回生ヒト抗体HIgM12の抗原を同定するために主に使用されました。アリの識別生物学的活性を有する抗体のためのigensは、それらの作用機序を理解するとして必要不可欠なステップです。これは、現在臨床試験で安全性と有効性のためにテストされている多数のモノクローナル抗体の文脈で特に関連性になります。これまでの臨床的に試験されたIgM抗体の数が少ないが、この抗体クラス^{1-10,37,40,42-45}の治療可能性を強調した研究の増加と共に、ハイブリドーマ技術における最近の進歩は、新規または開発を促します非タンパク質のIgM抗原を同定するために適用改変方法。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEM	フィッシャーサイエンティフィック	MT-10-013-CVRF	高グルコース、グルタミン配合、ピルビン酸ナトリウム配合、500 ml
DMEM/F-12、HEPES	Life Technologies	11330-032	500 ml、L-グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、高グルコース
ペニシリン-ストレプトマイシン	Life Technologies	15140-122	10,000 U/ml、100ml
N-2 サプリメント (100x)	Life Technologies	17502-048	5 ml
B-27 サプリメント (50x)	Life Technologies	17504-044	無血清、10 ml
ウシ胎児血清 - Optima	Atlanta Biologicals	S12450	500 ml
灌漑用滅菌水	Baxter Healthcare	#2F7114	USP-1,000 ml、12/CA
Poly-D-lysine 臭化水素酸	シグマ	P7886-50MG	D-Lys-(D-Lys)n-D-Lys ·xHBr、分子量30,000-70,000 g / mol、50 mg
ウシ血清アルブミン画分	シグマ	A-3294-100G	熱ショック画分、プロテアーゼフリー、pH 7, 純度98%、100 g
D-(+)-グルコース	シグマ	G5767-500G	C<サブ>6H<サブ>12O<サブ>6、 分子量:180.16 g / mol、ACS試薬、500 g
トリプシン(ウシ膵臓由来	Sigma	T9935-100mg	基本的に無塩、凍結乾燥粉末、9,000 BAEE単位/mgタンパク質
ウシ膵臓由来	Sigma	D5025-150KU	Type IV、凍結乾燥粉末、2,000 Kunitz units/mg タンパク質
組換えラット FGF 塩基性タンパク質	R&Dシステム	3339-FB-025	キャリアタンパク質としてのBSA、25 µg、凍結乾燥、> 95%、16.2 kDa
組換えラットPDGF-AAタンパク質	R&Dシステム	1055-AA-50	キャリアフリー、50µg、凍結乾燥、> 97%、大腸菌由来、12.5 kDa
Neurobasal-A	Life Technologies	10888-022	500 ml、グルタミンなし、アスパラギン酸なし、グルタミン
パラホルムアルデヒド	、ΣP6148-1KG		結晶性、1 kg、試薬グレード、分子量 30.03 g/mol (モノマーとして)
トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン (Tris bas	Biorad	#1610719	1 kg、純度 99.8%、粉末
ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)	Biorad	#1610302	1 kg, 粉末
Glycine	Fisher Scientific	BP-381-5	C2H5NO2, 分子量:75.07 g/mol, 白色結晶性粉末, 5 kg
塩化ナトリウム	Σ	S7653-5KG	NaCl, 分子量:58.44 g/mol, 5 kg
リン酸ナトリウム一塩基性	Sigma	S0751-500G	NaH2PO4、分子量:119.98 g/mol、500 g
リン酸緩衝液 1x (PBS)	Cellgro	MT-21-040-CV	カルシウムとマグネシウムなし、6 x 500 ml
Falcon 60 mm TC-Treated Cell Culture Dish	Corning Life Sciences	#353002	60 mm Cell Culture Dish, TC-treated ポリスチレン, 20/パック, 滅菌済み
Falcon 60 mm x 15 mm Petri dish	Corning Life Sciences	#351007	Not TC-treated Bacteriological Petri Dish, 20/pack
6 well Cell Culture plates	Corning Costar	CLS3516	6 well, 平底 (個別包装), ガンマ線照射, 増殖面積 9.5 c
75 cm² 組織培養フラスコ	Corning Life Sciences	430720U	75 cm²U字型傾斜ネック細胞培養フラスコ、プラグシールキャップ
ピアス付き&貿易;Protein L Plus Agarose	ThermoFisher Scientific	#20520	2 ml、架橋6%ビーズアガロース (CL-6B)、結合能:10 to 20 mg IgG
4 - 20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Biorad	456-1094	10-well, 50 µl、ミニプロティアン電気泳動細胞
Immobilon-Pメンブレン	ミリポア	IPVH00010	PVDF、0.45µで使用します。m, 26.5 cm x 3.75 m roll
Anti-Polysialic Acid-NCAM Antibody, clone	Millipore	MAB5324	50 μLliters, 宿主:マウス、モノクローナル IgM
4x Laemmli Sample Buffer	Biorad	#1610747	10 ml, 4x premixed protein sample buffer
2-mercaptoethanol	Biorad	#1610710	25 ml, 純度 98 %, 14.2 M
Endoneuraminidase-N (Endo-N)	ABC Scientific	ABC0020	50マイクロリットル、200マイクロリットル;g/ml, 3,500 U/mg
25 mm ガラスカバースリップ	Fisher Scientific	12-545-102	Circles No. 1;厚さ:0.13〜0.17 mm;サイズ:25 mm
HEPES緩衝液	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15630-080	100 ml、1 M
ハンクス平衡塩溶液 1x (HBSS)	Cellgro	MT-21-022-CV	500 ml、カルシウム、マグネシウム、フェノールレッド
パパイン	ワージントン生化学協力	LS003119	凍結乾燥粉末、100 mg
マグネシウム硫酸塩	シグマ	M-2643-500G	粉末、500 g
L-Glutamine	Gibco	#25030-081	100 ml、200 mM