このコンテンツを表示するには、JoVEへの購読が必要です。 または、無料トライアルをお申し込みください。

方法論記事

幼生ゼブラフィッシュ性腺組織の解剖

10.2K 回視聴

⸱

DOI:

10.3791/55294

⸱

2017年4月26日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institutes of Brain Science, State Key Laboratory of Medical Neurobiology and Collaborative Innovation Center for Brain Science, Fudan University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

ここでは、ゼブラフィッシュの性分化とメンテナンスの調査を容易にするであろう幼虫のゼブラフィッシュの生殖腺組織を単離するためのプロトコルを提示します。

要約

野生のゼブラフィッシュは、ZZ / ZWセックス決意システムを有するが、飼いならされたゼブラフィッシュは、性染色体を失っています。彼らは、ゲノム全体に分布するいくつかの遺伝子は、まとめて、個々の魚の性同一性を決定多遺伝子性別決意システムを利用します。現在、生殖腺の発達の調節に関与する遺伝子とその仕組みは、とらえどころのないまま。通常、生殖腺組織を分離することは、セックスの発生過程を調べるための最初のステップです。ここでは、ゼブラフィッシュの幼虫DPF 17 DPF（日受精後）と25からの性腺組織を分離するための手順を提示します。単離された生殖腺組織は、その後、形態学および遺伝子発現プロファイリングによって調べることができます。

概要

野生のゼブラフィッシュ4染色体の主要な女性セックス行列は、1（ すなわち 、共通の実験室株）を紛失したり、飼いならされたゼブラフィッシュに変更されます。代わりに、彼らは、温度、低酸素症、食品の可用性と人口密度などの環境要因を伴う多遺伝子のセックス決意システムを持っています。ゼブラフィッシュのセックス開発の詳細なメカニズムは完全には理解されていません。プライマリ性別決意信号（単数または複数）/何であるか、そのようなゼブラフィッシュ性別決意が発生した場合のように基本的な質問は、であり、遺伝子は、生殖腺の変換の最初のステップは、3 2 に答えされずに残って調節います。

ゼブラフィッシュのセックス、開発の過程では、いくつかの重要な段階では認識されています。開発の初期段階では、4 HPF（時間後に受精）始原生殖細胞（始原生殖細胞）仕様を受け、から出発して生殖隆起に移動および増殖。 PGC番号と生殖細胞と体細胞間の相互の相互作用は、生殖腺の分化4のために重要です。 13 DPF（日受精後）では、生殖腺は、未分化段階にあります。 17のDPFすることにより、生殖腺は、将来、女性と男性の両方における双方向性卵巣へと発展します。卵巣からの精巣にアポトーシス依存遷移は21〜25 DPFから始まり、数週間継続することができます。 35のDPFにより、生殖腺の性別が決定されており、性別特異的配偶子生産は両方の卵巣に進行中であると5精巣、6、7。

現在まで、多様な候補遺伝子とセックス決意のメカニズムが提案されています。プロテオミクスとトランスクリプトーム解析は、性的二型表現で多くの遺伝子を単離したこれらの遺伝子は、ゼブラフィッシュ8に性分化を研究するために利用されてきました 9、10。例えば、幼生ゼブラフィッシュでは、cyp19a1a遺伝子は特になく、精巣11,12における卵巣において発現されます。また、AMH遺伝子が弱く卵胞顆粒膜細胞で発現するが、強く精巣のセルトリ細胞13れます。対照的に、Vasa遺伝子は、連続的に適切な性腺マーカー14、15作り、女性と男性の両方ゼブラフィッシュの生殖細胞において発現されます。

性腺遺伝子発現レベルを調べることは、特に双電位卵巣ステージ3,9に性別決意と分化の分子機構を理解することが重要です。しかし、幼虫のゼブラフィッシュおよび対応小さな生殖腺のサイズが小さいgonadaの単離を複雑さらなる分子分析のためにL組織。以前の研究では、operculaと肛門の気孔16との間の解剖全体のトランク域を使用しました。この準備は、生殖腺を含むが、複数の組織や器官から構成されています。あるいは、脈などの生殖腺特異的GFP発現を有するトランスジェニック動物：EGFPの蛍光活性化細胞選別（FACS）およびレーザー捕捉マイクロ切開17、18 を介して、性腺組織単離のために使用しました。しかし、彼らの広範なアプリケーションが限られています。ここでは、17 DPFと25 DPFの幼虫のゼブラフィッシュからの性腺組織を分離するための簡単な手順について説明します。我々は、他の器官に対する生殖腺の位置を示し、周囲の組織から形態学的に無傷の生殖腺を分離します。我々はさらに、（例えばヴァーサとcyp19a1aなどの生殖腺特異的遺伝子は高度に定量的PCRを介してトランク組織と比較して、単離された生殖腺で発現される表示します定量PCR）分析。本プロトコルは、それによって性腺組織19のその後の分子分析を可能にする、幼生ゼブラフィッシュから生殖腺特異的遺伝子の同定、単離、RNAの精製及び増幅を可能にします。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

プロトコル

ゼブラフィッシュ実験は、復旦大学施設内動物管理使用委員会によって承認されました。ゼブラフィッシュは、標準的な手順20に従って上昇させて飼育しました。

1.準備

  1. 幼虫のゼブラフィッシュDPF 17 DPFと25を育成
    1. 交差前日午後遅く交差タンクに移し2のオスとメスの2大人のゼブラフィッシュ（、3〜6ヶ月、健康的な実験室アブ・ストレイン）。バリアで男性と女性を分離します。翌朝、タンクの水をリフレッシュし、それらが交尾できるようにするために障壁を取り除きます。受精後1〜2時間、100ミリメートルペトリ皿に卵を収集します。
    2. 初期の開発期間（4日間）の間に28.5°Cで40 mLの胚培地（EM）と100mmのプレートで約40胚を保ち、一日二回EMをリフレッシュ。 1 Lタンク（300 mLのシステム水40幼虫）に幼虫を移し、5 DPF後生ワムシ（全電源、一日二回）で供給。10 DPFの後にライブブラインシュリンプの代わりに、ワムシの食事を養います。 21 DPF 14に再循環水システムの中に魚を転送します。
    3. 17 DPF又は25 DPFまで再循環水システムにおける幼虫ゼブラフィッシュを上げます。明/暗サイクルを保証するシステムの水の14/10時間およびpH値は約7.2です。 17 DPF（5.5 6.8ミリメートル）の体長を測定し、25 DPF（8〜11 mm）の幼虫22。
  2. 解剖2％寒天プレートを準備します。
    1. 200mLの滅菌水に4gの寒天を加えます。それが透明になるまでマイクロ波オーブン中で混合物を加熱します。
    2. 次いで、直径60mmのペトリ皿（プレートのおよそ1/3量）にそれを注ぎ、約15分間、寒天溶液を冷却します。 4°Cで固化寒天プレートを保管してください。

2.プロトコール1：幼虫DPF 17及び25の生殖組織を分析

  1. 17 DPFの幼虫を麻酔するためにタンクに砕いた氷を追加します。転送30 mLの冷リンゲル液でペトリ皿冷却100mMの麻酔幼虫。完全に幼虫を麻酔するために、少なくとも15分間冷却リンゲル液中で培養した魚を保管してください。
  2. 小さなプラスチックのスプーンで予冷した寒天プレートに幼虫を転送します。 10 mLの全体の魚の体を水没リンゲル液を冷却し、そっとその側にそれを置きます。
  3. 25X実体顕微鏡の視野の下で以下の操作を行います。安定化のためのピンセットで魚のトランクをクランプします。ピンセットの別のペアと心に肛門から縦方向に腹部をリッピング。静かに内臓を露出するために、本体の片側に皮膚や筋肉を取り除きます。
  4. 慎重に浮き袋に腹器官の質量を削除します。浮き袋に添付生殖腺にダメージを与えることは避けてください。
  5. 浮き袋と前部本体との間の接続を遮断します。優しく全体の浮き袋と生殖腺組織を引き出します。
    注：ほとんどの場合S、17 DPFの性腺組織は、上皮組織とprotonephridiumを取り巻く含まれています。それらは容易に分離されていないが、25℃で容易に分離することができるDPF。生殖腺は、肛門に接続されています。肛門で相互に接続され、左右の生殖腺との接合は、はっきりと見えるであろう。
  6. 慎重に浮き袋から生殖腺組織を分離し、周囲の脂肪組織をクリーンアップするためにピンセットを使用してください。
  7. 直ちに200μLのリンゲル液を含有する予冷1.5mLの遠心管に、単離された生殖腺組織を移します。すべての生殖腺組織が幼虫から分離されるまで、チューブを氷上に保管してください。
  8. 2.7 - 手順2.1に記載したように25 DPFの幼虫の生殖腺を解剖。

3.プロトコル2：孤立生殖腺組織の遺伝子発現を分析

  1. 幼虫性腺組織からトータルRNAを抽出します。
    1. 新しいRNaseフリー1に分離された生殖腺組織を転送します。5mLのチューブ及びリンゲル液を除去します。 100μLの溶解液を追加します。組織が完全に溶解するまでボルテックス。
    2. 製造業者の説明書に従って全RNA抽出手順を実行します。
    3. 私はバッファ10倍DNアーゼの1/10量とRNA溶液にDNアーゼIの1μLを加え、穏やかに混合。 37°Cで20分間インキュベートします。
    4. RNA溶液に1/10量のDNase不活性化試薬を追加します。 70°Cで10分間インキュベートします。分光光度計を用いて全RNAの濃度を測定します。 -20℃で保管してください。
  2. 第一鎖cDNA合成を行います
    1. 製造業者のプロトコルに従って第一鎖cDNA合成を実行するためにオリゴ（dT） - リンカープライマーを使用します。 20μLの総反応容量にRNAの1〜2μgのを追加。
    2. 45℃で90分間反応溶液をインキュベートします。 5分間70℃で加熱することによって反応を停止。
    3. cDNAに1μLのRNase Hを追加しますので、残留RNAを除去するためにlution。 〜13,000×gで10秒間静かに遠心混ぜます。 37°Cで20分間インキュベートします。 20μlのヌクレアーゼを含まない水を追加します。 -70℃で保管してください。
  3. 蛍光定量的PCRを行います
    1. 蛍光色素でサイクラーシステム上で定量PCRを行います。 30秒、15秒、15秒、95℃で35サイクル、TM-5°C、68°C以下のPCRサイクル条件を使用します。次のようにプライマー配列を使用する：AMH（FWD：GTGGATGGCAGCAGTACGAC; REV：GCGGAGAGGTGGAAGAGAGAATG）、cyp19a1a（FWD：GTCCTGTTGTCTCCTACTGTCG; REV：CATTTGAGTTGAATATGATGCCCTG）、nanos3（FWD：GCTCGGTGTACGCCAAATCAACAT; REV：CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC）、 ヴァーサ （FWD：ATCGCATAGGAAGAACTGGACGCT; REV：CCAAGTGAAAACACAACACCAGTGC）とβアクチン （FWD：AGTGCGACGTGGACATCCGTA; REV：GCACTTCCTGTGGACGATGGA）19。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

結果

生殖腺の解剖は、アブ・ストレイン幼虫のゼブラフィッシュで行われました。 図1は、17 DPF、25 DPFにおける幼虫のゼブラフィッシュの典型的な性腺組織を示しています。まず、皮膚や腹部の片側の筋肉は内臓を露出するように切断されます。臓器の質量を除去した後、一緒に生殖腺を有する水泳膀胱トランクに残ります。生殖腺は、水泳膀胱（ 図1B 'の矢印）の腹側に取り付けました。 17のDPFでは、生殖腺は、双方向性卵巣段階にありました。単離された生殖腺は、左右の生殖腺を含有し（ 図1C）、半透明でした。ほとんどの場合、それは、上皮組織とprotonephridium（ 図1Cの矢印）に囲まれました。性腺DPF 25でしばしば脂肪組織（ 図1D）で...

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

ディスカッション

ゼブラフィッシュは、強力なモデルとなっており、広範囲の開発と疾患関連研究に使用されています。例えば、脳、心臓、生殖腺、腎臓などのアダルトゼブラフィッシュにおける臓器の単離のための方法は、ウェル23、24、25を文書化されています。小型及び幼虫のゼブラフィッシュにおける生殖組織の動的再造形に、生殖腺組織の単離は困難な作業です。幼虫の生殖腺26を検査するためにEGFPベースの細胞選別とレーザーマイクロダイセクション：これまでの研究では、全体の解剖トランク組織またはトランスジェニック脈を使用します。栽培中の第4染色体の改変は、家畜ゼブラフィッシュにおける性別決意謎を行います。ここで説明する私たちの方法は、性決定メカを探索するために役立つことができ、さらに形態学的および分子検査のために、比較的きれいで、早期の生殖腺の製剤を提供することができますanisms。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

開示事項

著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。

謝辞

私たちは、魚のケアのためのCチャンに感謝します。この作品は、中国の国家自然科学基金（GPへ31171074、31371099と31571067）によって及び浦江タレントプロジェクト（GPへ09PJ1401900）によってサポートされていました。

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
細胞培養皿 100 mmコーニング430167胚インキュベーション用
20x EM必要な1 Lの場合:17.5 g NaCl、0.75 g KCl、2.9 g CaCl·2H<サブ>2O;次に、0.41 gのKH2PO4、0.412 gのNa2HPO4無水および4.9 gのMgSO4·を追加します。7H2O.
1x EM蒸留水で20x EMを希釈
AGAROSE G-10遺伝子1219852%寒天プレートの調製用
Trizol 試薬Invitrogen15596-026RNA単離
用 メーターガラスシェンボー250 ml2%寒天プレートの調製用
電子レンジMideaM1-211AAGAR
の加熱用ピンセット デュモン#5INOXワールド精密機器解剖用
500341 実体顕微鏡MoticSMZ168解剖用
純水装置ミリポア
リンガー'Lの溶液が必要な場合:6.78 g NaCl、0.22 g KCl、0.26 g CaCl2、および1.19 gのHepesを追加します。pHを7.2に調整します。ろ過により滅菌し、オートクレーブ滅菌した透明なポリカーボネート容器に保管してください。
トランスファーピペットSamco202, 204
Metal bathQiLinbeierModel GL-150
MicroscopeLeica M205 FA顕微鏡写真用
遠心分離機Eppendorf5417R
マイクロスケール RNA 単離キットAmbionAM1931生殖腺組織からのRNA単離用
Dnase ISigmaAMPD1-1KTRNA溶液中のDNA消化用
RevertAid First Strand cDNA Synthesis KitThermo Scientific#K1631First-strand cDNA合成用
Rnase HThermo Scientific#EN0202cDNA溶液中の残留RNAを消化します。
SYBR Green Realtime PCR Master MixTOYOBOQPK-201本製品は、Taq DNAポリメラーゼベースのリアルタイムPCR用2倍マスターミックスで、SYBR Green Iとのインターカレーションアッセイに適用できます。
分光光度計Ne DropOD-2000+全RNAの濃度の測定
MastercyclerEppendorfAG 22331 ハンブルク遺伝子発現プロファイリング
1

参考文献

  1. Wilson, C. A., et al. Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains. Genetics. 198 (3), 1291-1308 (2014).
  2. Liew, W. C., Orban, L. Zebrafish sex: a complicated affair. Genomics. 13 (2), 172-187 (2014).
  3. Orban, L., Sreenivasan, R., Olsson, P. Long and winding roads: Testis differentiation in zebrafish. Mol. Cell. Endocrinol. 312 (1-2), 35-41 (2009).
  4. Blaser, H., et al. Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish. J. Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).
  5. Wang, X. G., Orban, L. Anti-Müllerian hormone and 11 β-hydroxylase show reciprocal expression to that of aromatase in the transforming gonad of zebrafish males. Dev. Dynam. 236 (5), 1329-1338 (2007).
  6. Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. Germ line control of female sex determination in zebrafish. Dev. Biol. 324 (2), 277-287 (2008).
  7. Uchida, D., Yamashita, M., Kitano, T., Iguchi, T. Oocyte apoptosis during the transition from ovary-like tissue to testes during sex differentiation of juvenile zebrafish. J. Exp. Biol. 205 (Pt 6), 711-718 (2002).
  8. Groh, K. J., Schönenberger, R., Eggen, R. I. L., Segner, H., Suter, M. J. F. Analysis of protein expression in zebrafish during gonad differentiation by targeted proteomics. Gen. Comp. Endocr. 193, 210-220 (2013).
  9. Siegfried, K. R. In search of determinants: gene expression during gonadal sex differentiation. J. Fish Biol. 76 (8), 1879-1902 (2010).
  10. Small, C. M., Carney, G. E., Mo, Q., Vannucci, M., Jones, A. G. A microarray analysis of sex- and gonad-biased gene expression in the zebrafish: evidence for masculinization of the transcriptome. BMC Genomics. 10, 579(2009).
  11. Chiang, E. F., Yan, Y. L., Guiguen, Y., Postlethwait, J., Chung, B. Two Cyp19 (P450 aromatase) genes on duplicated zebrafish chromosomes are expressed in ovary or brain. Mol. Biol. Evol. 18 (4), 542-550 (2001).
  12. Kishida, M., Callard, G. V. Distinct cytochrome P450 aromatase isoforms in zebrafish (Danio rerio) brain and ovary are differentially programmed and estrogen regulated during early development. Endocrinology. 142 (2), 740-750 (2001).
  13. Rodríguez-Marí, A., et al. Characterization and expression pattern of zebrafish anti-Müllerian hormone (amh) relative to sox9a, sox9b, and cyp19a1a, during gonad development. Gene Expr.Patterns. 5 (5), 655-667 (2005).
  14. Krovel, A. V., Olsen, L. C. Expression of a vas::EGFP transgene in primordial germ cells of the zebrafish. Mech Dev. 116 (1-2), 141-150 (2002).
  15. Krovel, A. V., Olsen, L. C. Sexual dimorphic expression pattern of a splice variant of zebrafish vasa during gonadal development. Dev. Biol. 271 (1), 190-197 (2004).
  16. Tzung, K. W., et al. Early depletion of primordial germ cells in zebrafish promotes testis formation. Stem Cell Reports. 4 (1), 61-73 (2015).
  17. Hsiao, C., Tsai, H. Transgenic zebrafish with fluorescent germ cell: a useful tool to visualize germ cell proliferation and juvenile hermaphroditism in vivo. Dev. Biol. 262 (2), 313-323 (2003).
  18. Jorgensen, A., Nielsen, J. E., Morthorst, J. E., Bjerregaard, P., Leffers, H. Laser capture microdissection of gonads from juvenile zebrafish. Reprod Biol Endocrinol. 7, 97(2009).
  19. Chen, S., Zhang, H., Wang, F., Zhang, W., Peng, G. nr0b1 (DAX1) mutation in zebrafish causes female-to-male sex reversal through abnormal gonadal proliferation and differentiation. Mol. Cell. Endocrinol. 433, 105-116 (2016).
  20. Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , Eugene: University of Oregon Press. University of Oregon. (2000).
  21. Liew, W. C., et al. Polygenic sex determination system in zebrafish. PLoS One. 7 (4), e34397(2012).
  22. Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
  23. Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis Exp. (37), (2010).
  24. Arnaout, R., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R. Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications. J. Vis Exp. (94), (2014).
  25. Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis Exp. (54), (2011).
  26. Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), 3157-3165 (1997).
  27. Braat, A. K., Speksnijder, J. E., Zivkovic, D. Germ line development in fishes. Int. J. Dev. Biol. 43 (7), 745-760 (1999).
  28. Huang, H. Y., Ketting, R. F. Isolation of zebrafish gonads for RNA isolation. Methods Mol Biol. 1093, 183-194 (2014).

アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。

再版と許可

タグ

RNAqPCR
幼生ゼブラフィッシュ性腺組織の解剖
お問い合わせ
図書館に推薦する

プライバシー

利用規約

ポリシー

著作権 © 2026 MyJoVE Corporation. 無断転載を禁じます。