幼生ゼブラフィッシュ性腺組織の解剖

サマリー

ここでは、ゼブラフィッシュの性分化とメンテナンスの調査を容易にするであろう幼虫のゼブラフィッシュの生殖腺組織を単離するためのプロトコルを提示します。

要約

野生のゼブラフィッシュは、ZZ / ZWセックス決意システムを有するが、飼いならされたゼブラフィッシュは、性染色体を失っています。彼らは、ゲノム全体に分布するいくつかの遺伝子は、まとめて、個々の魚の性同一性を決定多遺伝子性別決意システムを利用します。現在、生殖腺の発達の調節に関与する遺伝子とその仕組みは、とらえどころのないまま。通常、生殖腺組織を分離することは、セックスの発生過程を調べるための最初のステップです。ここでは、ゼブラフィッシュの幼虫DPF 17 DPF（日受精後）と25からの性腺組織を分離するための手順を提示します。単離された生殖腺組織は、その後、形態学および遺伝子発現プロファイリングによって調べることができます。

概要

野生のゼブラフィッシュ4染色体の主要な女性セックス行列は^、1（ すなわち 、共通の実験室株）を紛失したり、飼いならされたゼブラフィッシュに変更されます。代わりに、彼らは、温度、低酸素症、食品の可用性と人口密度などの環境要因を伴う多遺伝子のセックス決意システムを持っています。ゼブラフィッシュのセックス開発の詳細なメカニズムは完全には理解されていません。プライマリ性別決意信号（単数または複数）/何であるか、そのようなゼブラフィッシュ性別決意が発生した場合のように基本的な質問は、であり、遺伝子は、生殖腺の変換の最初のステップは^{、3 2 に}答えされずに残って調節います。

ゼブラフィッシュのセックス、開発の過程では、いくつかの重要な段階では認識されています。開発の初期段階では、4 HPF（時間後に受精）始原生殖細胞（始原生殖細胞）仕様を受け、から出発して生殖隆起に移動および増殖。 PGC番号と生殖細胞と体細胞間の相互の相互作用は、生殖腺の分化⁴のために重要です。 13 DPF（日受精後）では、生殖腺は、未分化段階にあります。 17のDPFすることにより、生殖腺は、将来、女性と男性の両方における双方向性卵巣へと発....

プロトコル

ゼブラフィッシュ実験は、復旦大学施設内動物管理使用委員会によって承認されました。ゼブラフィッシュは、標準的な手順²⁰に従って上昇させて飼育しました。

1.準備

1. 幼虫のゼブラフィッシュDPF 17 DPFと25を育成
   1. 交差前日午後遅く交差タンクに移し2のオスとメスの2大人のゼブラフィッシュ（、3〜6ヶ月、健康的な実験室アブ・ストレイン）。バリアで男性と女性を分離します。翌朝、タンクの水をリフレッシュし、それらが交尾できるようにするために障壁を取り除きます。受精後1〜2時間、100ミリメートルペトリ皿に卵を収集します。
   2. 初期の開発期間（4日間）の間に28.5°Cで40 mLの胚培地（EM）と100mmのプレートで約40胚を保ち、一日二回EMをリフレッシュ。 1 Lタンク（300 mLのシステム水40幼虫）に幼虫を移し、5 DPF後生ワムシ（全電源、一日二回）で供給。10 DPFの後にライブブラインシュリンプの代わりに、ワムシの食事を養います。 ²¹ DPF 14に再循環水システムの中に魚を転送します。
   3. 17 DPF又は25 DPFまで再循環水システムにおける幼虫ゼブラフィッシュを上げます。明/暗サイクルを保証するシステムの水の14/10時間およびpH値は約7.2です。 17 DPF（5.5 6.8ミリメートル）の体....

結果

生殖腺の解剖は、アブ・ストレイン幼虫のゼブラフィッシュで行われました。 図1は、17 DPF、25 DPFにおける幼虫のゼブラフィッシュの典型的な性腺組織を示しています。まず、皮膚や腹部の片側の筋肉は内臓を露出するように切断されます。臓器の質量を除去した後、一緒に生殖腺を有する水泳膀胱トランクに残ります。生殖腺は、水泳膀胱（ 図1B 'の矢印）の腹側に取り付けました。 17のDPFでは、生殖腺は、双方向性卵巣段階にありました。単離された生殖腺は、左右の生殖腺を含有し（ 図1C）、半透明でした。ほとんどの場合、それは、上皮組織とprotonephridium（ 図1Cの矢印）に囲まれました。性腺DPF 25でしばしば脂肪組織（ 図1D）で.......

ディスカッション

ゼブラフィッシュは、強力なモデルとなっており、広範囲の開発と疾患関連研究に使用されています。例えば、脳、心臓、生殖腺、腎臓などのアダルトゼブラフィッシュにおける臓器の単離のための方法は、ウェル^{23、24、25を}文書化されています。小型及び幼虫のゼブラフィッシュにおける生殖組織の動的再造形に、生殖腺組織の単離は困難な作業です。幼虫の生殖腺^26を検査するためにEGFPベースの細胞選別とレーザーマイクロダイセクション：これまでの研究では、全体の解剖トランク組織またはトランスジェニック脈を使用します。栽培中の第4染色体の改変は、家畜ゼブラフィッシュにおける性別決意謎を行います。ここで説明する私たちの方法は、性決定メカを探索するために役立つことができ、さらに形態学的および分子検査のために、比較的きれいで、早期の生殖腺の製剤を提供することができますanisms。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
細胞培養皿 100 mm	コーニング	430167	胚インキュベーション用
20x EM			必要な1 Lの場合:17.5 g NaCl、0.75 g KCl、2.9 g CaCl·2H<サブ>2O;次に、0.41 gのKH2PO4、0.412 gのNa2HPO4無水および4.9 gのMgSO4·を追加します。7H2O.
1x EM			蒸留水で20x EMを希釈
AGAROSE G-10	遺伝子	121985	2%寒天プレートの調製用
Trizol 試薬	Invitrogen	15596-026	RNA単離
用 メーターガラス	シェンボー	250 ml	2%寒天プレートの調製用
電子レンジ	Midea	M1-211A	AGAR
の加熱用ピンセット デュモン#5INOX	ワールド精密機器		解剖用
500341 実体顕微鏡	Motic	SMZ168	解剖用
純水装置	ミリポア
リンガー'			Lの溶液が必要な場合:6.78 g NaCl、0.22 g KCl、0.26 g CaCl2、および1.19 gのHepesを追加します。pHを7.2に調整します。ろ過により滅菌し、オートクレーブ滅菌した透明なポリカーボネート容器に保管してください。
トランスファーピペット	Samco	202, 204
Metal bath	QiLinbeier		Model GL-150
Microscope	Leica	M205 FA	顕微鏡写真用
遠心分離機	Eppendorf	5417R
マイクロスケール RNA 単離キット	Ambion	AM1931	生殖腺組織からのRNA単離用
Dnase I	Sigma	AMPD1-1KT	RNA溶液中のDNA消化用
RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit	Thermo Scientific	#K1631	First-strand cDNA合成用
Rnase H	Thermo Scientific	#EN0202	cDNA溶液中の残留RNAを消化します。
SYBR Green Realtime PCR Master Mix	TOYOBO	QPK-201	本製品は、Taq DNAポリメラーゼベースのリアルタイムPCR用2倍マスターミックスで、SYBR Green Iとのインターカレーションアッセイに適用できます。
分光光度計	Ne Drop	OD-2000+	全RNAの濃度の測定
Mastercycler	Eppendorf	AG 22331 ハンブルク	遺伝子発現プロファイリング

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