全体、高血圧症非血の研究と凝固解析を可能にする生体外モデルを提案します。健康な内皮細胞の自然な抗凝固効果に依存するシステムの抗凝固療法と血管内皮細胞の活性化血液凝固になります。
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この記事について
サマリー
要約
生体内で、内皮細胞は循環血液の自然な抗凝固療法のために重要です。その結果、血管内皮細胞の活性化は、血液凝固をもたらします。この現象は、虚血/再灌流障害、臓器移植、異種移植を含む前もって形成された抗ドナー抗体の存在下でのような多くの臨床状況で観察されます。モデルによると、3 r 基準 (削減、交換・洗練)培養内皮細胞の影響を検討する動物実験を減らすためには、血液凝固活性化は非常に望ましいでしょう。ただし、内皮細胞培養の一般的なフラット ベッド システムは、自然、内皮細胞を介した抗凝固療法の不十分な血の mL あたり内皮の 1 5 cm2の表面に容積比を提供します。マイクロ ・ キャリア ビーズに内皮細胞を培養すると、40-160 cm2/mL に表面・体積比が増加します。この増加率は、抗凝固薬の使用を避けることができるように、全血での「自然な」抗凝固療法を確実に十分です。ここで体外マイクロ ・ キャリア ・ ベース システムは全体、非高血圧症ひと血液の凝固に及ぼすブタ血管内皮細胞の遺伝子組み換えの研究に記載されています。説明アッセイがプライマリ ブタ大動脈の血管内皮細胞、いずれかの野生型 (WT) で遺伝子組み換え人間ありなさい CD46 および、トロンボモジュリンをマイクロ ・ キャリア ビーズ上に成長したて非高血圧症ヒトの血液にさらされるのか。このモデルは、補完性と、血漿中の血液凝固マーカー測定及び活性化と同様に、サイトカインのリリースの定量化できます。さらに、活性化血管内皮細胞および免疫グロブリンの沈着のイメージング、endothelialized ビーズの補完・凝固の蛋白質を行った共焦点顕微鏡。この試金は、血管内皮細胞の活性化や、したがって、凝固を防ぐためになっている薬をテストする使用できます。このような調査に使用される動物の数を減らすには、その可能性の上に説明アッセイは、簡単に実行で一貫して再現可能なです。
概要
血管内皮細胞は、血管の内腔を並べる内皮細胞 (EC) の単分子層で構成されます。生理学的な状態で静止 EC が抗凝固薬および抗炎症環境のメンテナンスを担当です。1これは抗凝固剤および EC 表面抗炎症タンパク質発現によって媒介されます。虚血・再灌流による EC 活性化たとえば、傷害または血管性拒絶反応 (xeno-) の移植臓器プロ凝固と炎症性抗凝固薬および抗炎症状態から内皮細胞表面の変化の結果状態です。1
内皮細胞と血液凝固の要因として模倣の in vitroモデルの魅惑的で複雑な相互作用を研究するには、可能な限り密接に体内の状況が非常に望ましい。凝固検査従来体外を特徴づける共通制限は高血圧症血液凝固性効果の解析を困難になるとの使用と全血のも領域を再現できません。高血圧症以外の新鮮な血液を用いて得られる結果。2以外にも、伝統的なフラット ベッド細胞培養システムで不可能血液量あたり十分な血管内皮細胞表面に到達できないと血管内皮細胞の抗凝固特性を悪用します。ここに提示されたモデル球状マイクロ ・ キャリア ビーズの表面に EC を養殖によるこれらの制限を克服しての EC 表面の血比 > 16 cm2/mL に到達でき、小細動脈や静脈の状況に似ているとこれは血液の「自然な」抗凝固療法を許可する十分な EC 表面によって記述されていた。3,4全血はこの設定で追加された抗凝固剤なし使用ことができます。凝固因子、サイトカイン、実験中に血液サンプルを集めることができると可溶性の補体の活性化マーカーを検出および定量化できます。さらに、EC コーティング マイクロ ・ キャリア ビーズは、共焦点顕微鏡による補体および免疫グロブリン沈着として EC 活性化マーカーの発現を分析することがあります。別の興味深いアプリケーションは、血管内皮細胞の活性化や、したがって、凝固を防ぐためになっている薬物の含まれています。5が、このモデルは、動物実験を完全に置き換えることはできません、それは特定機能仮説ex vivo細胞を使用してテストし、虚血/再灌流に関する基礎的研究に使用される動物の数を減らす方法を提供します。傷害または (ゼノ) の移植。
説明モデルは設定どのブタ大動脈内皮細胞 (PAEC) のマイクロ ・ キャリア ビーズ上に成長したおよび全体、非高血圧症血液で培養した異種を模倣する使用されました。補体系やトロンボモジュリン (hTBM) 凝固系の規則のための規則のためのありなさい CD46 などいくつかのひと遺伝子を運ぶ別のトランスジェニック PAEC は、その抗凝固特性分析しました。血管内皮細胞の活性化、補完、および凝固のシステムは堅く制御され、相互に連結されます。6様々 な形質転換細胞の接着分子の発現やサイトカインのリリースに関して人間の血液への暴露後動作方法を理解することが重要、そのための糖衣と抗凝固の蛋白質の損失を流します。7
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プロトコル
ドイツ ランドレース (野生型トランスジェニック ・地元農家で飼育繁殖動物育種の研究所でバイオ テクノロジー、ルートヴィヒ ・ マクシミリアン大学ミュンヘン、ドイツ)、重さ 30 kg ~ 40 kg の間で使用されていた本研究では。すべての動物は、水や食料 アドリブ で標準的な条件の下で収容されました。ケア、実験動物の使用、スイスの動物保護法の英国動物法 (科学的なプロシージャ) および NIH ガイドに従ってすべての動物実験を行った。すべての動物の研究は到着ガイドラインに遵守します。州の獣医サービス (カントンのベルン、スイス) の動物実験委員会はないすべての動物の手続き、許可を承認しました。BE70/14。実験プロトコルは 3 r の原則によると洗練された、最新の麻酔・疼痛管理は、動物の数を最小限に抑え、実験動物のストレスや痛みへの暴露を減らす使用された
。ベルン大学病院のスイスの司法権および倫理ガイドラインに従ってクローズド システム静脈穿刺による健全な個人から血が描かれました。フレーズ " 非高血圧症血 " 血液の抗凝固剤と扱われていないことを意味します
。無菌条件下で次の手順を実行します。基本の細胞培養生殖不能の技術と知識が必要です
。1 PAEC 分離
注: 6 を 10 cm の大動脈セグメントは 3 〜 6 ヶ月歳 (他の 生体内で 実験に使用)、すぐに安楽死させたドイツ在来種豚から得られた。輸送培地 (DMEM + 1% ペニシリン/ストレプトマイシン) を含む 500 mL ガラス瓶の中に転送します
。- プレコート フィブロネクチン 12.5 μ g/ml の PBS 1 で 6 ウェル プレート x 1 h. の 37 ° C でインキュベーターで配置と
- 滅菌 PBS をあらかじめ温める 1 x および細胞培養培地 (DMEM).
- 輸送培地からのブタの大動脈を取り出す 。
- ポリスチレンの版の大動脈を配置します 。
- 事前優しく温かみのある PBS でフラッシュします 。
- 大動脈を縦にカットし、針で固定します 。
- 内槽表面の暖かい細胞培養液を追加します 。
- フィブロネクチン細胞培養培地を吸引し、新鮮な細胞培養培地 (DMEM 10 %fbs、1% ペニシリン/ストレプトマイシン内皮細胞成長培地補足ミックスの 0.4% と) を追加します 。
- は、細胞培養培地で 1 つの綿棒を浸します。綿棒内側容器表面の一番上綿の芽は優しく、ゆっくりと同じ方向にします 。
- ラウンドでラウンド 6 ウェル プレートのウェル 1 個の細胞をこする 。
- 井戸の残りの部分で同じ操作を行います 。
- 顕微鏡下で細胞を確認し、37 ° c、5% CO 2 インキュベーターで 6 ウェル プレートを配置します 。
- 2 日目媒体を変更し、また 2-3 日おきに変更します 。
- 細胞は合流する予定です、セルを trypsinize、T75 フラスコ (PAEC P1) にそれらを播く 。
2。PAEC 特性
- プレコート フィブロネクチン 12.5 μ g/ml の PBS 1 で 8 ウェル chamberslide x 1 h. の 37 ° C でインキュベーターで配置と
- 5 × 10 4 細胞/ウェルをシードし、37 でインキュベーターで一晩インキュベート ° C
- + + (CaCl 2 MgCl 2 と補われる PBS)、PBS で 2 回細胞を洗って 300 μ L/ウェル 。
- 200 μ L/ウェル、室温で 10 分の 3.7% パラホルムアルデヒドとセルを修正します 。
- 洗浄 3 回 PBS + + 300 μ L/ウェルのセル 。
- PBS 1 x-3_% BSA (ブロック バッファー) の 300 μ L を追加し、室温で 30 分を残しています 。
- 160 μ L/ウェル 1x-1%BSA-0.05% 洗剤 PBS で希釈した一次抗体 (抗 VE カドヘリン、アンチ CD31、抗 vWF) を適用し、室温で 1 時間インキュベートします 。
- PBS + + (200 μ L/ウェル) での 3 回の洗浄です 。
- 二次抗体と 160 μ L/ウェル、洗剤 1x-1%BSA-0.05% PBS で希釈した DAPI を適用し、室温で 1 時間インキュベートします 。
- PBS + + (200 μ L/ウェル) での 3 回の洗浄です 。
- グリセリン ベースの取り付け中のスライドをマウントし、蛍光顕微鏡下で血管内皮細胞マーカー発現を確認します
。 注: 文化ブタ大動脈内皮細胞 90% 合流まで T175 フラスコ (DMEM 低グルコース培地 + 10% FBS 1% ペニシリン/ストレプトマイシン、内皮細胞成長培地補足ミックスの 0.4%) に達する。(密度 1 x 10 6 細胞を播種、90% の合流に対応して約 5 x 10 の 6 セル).
3。マイクロ ・ キャリア ビーズ コーティング
- 42 ml コラーゲン溶液 50 mL チューブ (100 μ g/mL、0.2% 酢酸溶液で希釈) でのマイクロ ・ キャリア ビーズ 7 mL を混合し、室温で 1 時間インキュベートします 。
- ビード PBS pH 7.4 の 25 mL で 2 回洗浄しなさい (25 mL の PBS を追加、ピペットをよく混ぜて、ビーズは、破棄落ち着いて、上澄みと繰り返しまで待つ)、DMEM 培地を 25 mL と 1 時間 。
- カバー 199 10% を添加した培地 10 mL を 50 mL チューブにビーズ 1% 1% ペニシリン/ストレプトマイシン、FBS、L-グルタミン、内皮細胞成長培地補足ミックスの 0.4% とヘパリン (5000 IU/mL) の 25 μ L でき、10 分間の平衡さらに使用する前にします 。
4。細胞を収集
- PAEC を含む T175 フラスコから細胞培養培地を削除し、5 mL の PBS pH 7.4 を追加します 。
- T175 フラスコから PBS を削除します 。
- Trypsin-0.05% EDTA の 5 mL を追加し、37 で 3-4 分間インキュベート ° C
- 細胞培養培地 15 mL でフラスコを洗浄によって細胞を収集し、50 mL のチューブでサスペンションを転送します 。
- 室温で 8 分間 1,200 x g で細胞を遠心分離機、余分な培地を取り除き、細胞培養液 5 mL にペレットを再懸濁します 。
5。撹拌フラスコに細胞を播種
- 細胞懸濁液に細胞培養培地 20 mL を追加し、再懸濁します 。
- 500 mL マグネチックスターラー フラスコ (細胞) を除く 20 mL 細胞培養培地を追加します 。
- ステップ 3.3 から洗浄マイクロ ・ キャリア ビーズにセルを追加し、25 mL の血清ピペット、慎重に混在します 。
- 磁気スピナー フラスコにビーズ/細胞の混合物を転送します 。
- リンスの残りの細胞を収集するために細胞培養培地 10 mL を 50 mL チューブ 。
- スピナー フラスコ細胞培養液の追加 85 mL を追加し、インキュベーター シェーカーで 37 ° C で一晩に配置 (100 × g、混合間隔: 3 分 45 分毎).
- 細胞培養液 50 mL を追加 (合計量 200 mL) とシェーカーで 37 ° C でさらに 24 時間の攪拌を続行 (100 × g、間隔を混合: 3 分 45 分毎).
- 追加無色 RPMI 培地 (10% を添加した政府短期証券の 1%、1% ペニシリン/ストレプトマイシン、L-グルタミン、内皮細胞成長培地補足ミックスの 0.4% とヘパリンの 25 μ L) 容量 320 mL に達するまでです 。
- 媒体を交換して古い媒体のすべての 48 h: 削除 100 mL と 100 mL の新鮮な補われた無色 RPMI を追加します 。
- 5 に 7 日間培養します。時間細胞をコートしたビーズの合流点の状態に依存します 。
- 200 μ L のピペットを使用してセルをコートしたビーズを収集し、ポリプロピレン チューブにそれらを転送します 。
- 600 μ L の PBS 1 にビードを 3 回洗浄しなさい x (PBS を追加傾斜管とミックス ビーズを待つ、細胞の剥離を避けるために優しく落ち着く、PBS を破棄し、繰り返し).
- Parapicric 酸の 200 μ L の追加によって 10 分のビーズを修正します 。
- X. 1 PBS の 600 μ L で 3 回洗浄
- 1 PBS で希釈した追加 DAPI x 10 分間インキュベートし、
- スライド ガラスのビーズを転送し、グリセリン ベース マウント媒体を用いた coverslip を適用します 。
- 共焦点顕微鏡下でビーズを視覚化します 。
7。実験手順
- 10 mL の血清ピペットと (手順は、無菌条件下で行われる持っていない) マグネチックスターラー フラスコからセルをコートしたビーズを外し、12 mL 丸底ポリプロピレン チューブにそれらを転送します 。
- ビーズ (約 1-2 分) 落ち着くと余分なメディアを削除します 。
- すべてのチューブ ビーズの丁度 2 mL になるまでチューブにもっとビーズを追加します 。
- 各管に 5 mL クリア RPMI を追加し、10 mL の血清ピペットを使用して慎重に混ぜる 。
- ビーズ落ち着くと余分なメディアを削除します 。
- 洗浄手順に RPMI 1 つより多くの時間を繰り返し、すべての余分なメディアを削除します 。
8。非高血圧症血液培養
- 慎重に、ゆっくりと健康なボランティアからの血を引くし、9 mL 中立的なポリプロピレン チューブ (ない抗凝固剤) の収集 (ジェットも vacutainers を使用).
- はゆっくりと (総容積は 10 mL になります) セルをコートしたビーズの 2 mL を含むポリプロピレン チューブのそれぞれに 8 mL の血液 10 mL の血清ピペットを転送します。常に血液や EC の早期活性化を避けるためにビーズの乱暴な取り扱いをしないでください。1-2 分を要する
- 等しい混合を確保しパラフィン フィルムとキャップを封血/ビーズ混合物を慎重に傾けます 。
- は、37 ° C の定温器および凝固時間レコード内 (穏やかな傾斜設定のみ) と水平傾斜テーブルにチューブを置きます。
- セットの時間間隔で 例えば 10、20、30、50、70、90 分後血ビーズ混合血清または血漿分析のための少なくとも 1.5-2 mL を削除します
。 注: 6 時間ポイント、セルの 1 つのグループ内で 3 以上の複製を持つため、勧め別管内血液サンプリングが行われる 。
- 血清のコレクション、凝固する血のまま。プラズマを収集する EDTA またはクエン酸 2 mL チューブに血液サンプルを追加する前にします 。
- 氷のチューブを格納、4 ° C で 10 分間 2,500 × g で遠心分離、血清/血漿 80 ° c を使用するまで格納します
。 メモ: テーブルの材料 の材料の詳細については、提供されて
- セットの時間間隔で 例えば 10、20、30、50、70、90 分後血ビーズ混合血清または血漿分析のための少なくとも 1.5-2 mL を削除します
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結果
スピナー フラスコ (図 1) の文化の 7 ~ 10 日後セルが合流、マイクロ ・ キャリア ビーズ (図 2) の全体の表面を覆います。合流の状態の検証、ミクロ粒子のニキビトリートメントに EC の非合流単層凝固時間の著しい減少につながるので重要なステップですが、ビーズの表面は強くプロ凝集剤、マイクロ ・ キャリア (凝固時間: 4 ± 1 分) (図 3)。
注意を必要とするもう一つの重要なポイントは、傾斜板の速度です。血液凝固高傾斜速度を高めます。EC の単分子膜があればマイクロ ・ キャリア ビーズの表面に凝固時間の延長を観察できます。GalTKO/hCD46/hTBM トランスジェニック PAEC を使用は、WT PAEC (
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ディスカッション
ここで紹介するモデルは凝固に適して関連の研究凝固と理事会との相互作用のさまざまな側面の分析が可能8異種移植研究でヒトの血液9の孵化後異なる遺伝子組み換え豚 ECs の抗凝固特性をテストするための便利なシステムです。
プロトコルの最も重要な手順、実験を開始する前に、マイクロ ビーズの完全なセル範囲 (密度) を確保、それらおよび早産を避けるために非高血圧症全血の取り扱いに関する注意のコレクション血液を収集する vacutainers を使用する場合に発生する可能性があります高のせん断応力による血小板活性化。10は、それにもかかわらず、このシステムは循環クローズド システムの有無を含む、いくつかの制限とほうが生理学的な剪断応力がない場合は、生体内で条件を表します。
これらの制限にもかかわらず現在に比べて説明モデルの提供の重要な利点は既存モデルです。マイクロ ・ キャリア ...
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
謝辞
本研究は、スイスの全米科学財団 (SNSF、グラント号 320030_156193) によって支えられました。著者は、Biosilon マイクロ ・ キャリア ビーズを提供を博士 Benoît Werlen をありがちましょう。私たちはまたマイクロ ・ キャリア ビーズ モデルの設定のヘルプについて教授ハンス ・ ピーター ・ コーラーと教授アンドレ ・ Haeberli をありがちましょう。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| PAEC | 当研究室のブタ大動脈から単離 | ||
| マイクロキャリアビーズ(バイオシロン) | サーモフィッシャーサイエンティフィック | 160-250 | |
| コラーゲン I、ウシ | Gibco | A10644-01 | |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| ミディアム 199 | Sigma | M7528 | |
| RPMI | Gibco | 32404-014 | |
| 中性チューブ | Sarstedt | 02.1726.001 | |
| ポリプロピレンチューブSimport | T406-2A | ||
| スターラーフラスコ | Tecnomara | ||
| 生物学的スターラー | ブラウ | ワーMCS-104S | |
| ラットアンチCD31 | R&D Systems | MAB33871 | 希釈 1:100 |
| ヤギ抗ラット IgG-Cy3 | ジャクソン免疫研究 | 112-166-003 | 希釈 1:500 |
| ヤギ抗 VE-カドヘリン | サンタクルス | sc-6458 | 希釈 1:100 |
| ウサギ抗 vWF | DAKO | A0082 | 希釈 1:100 |
| Dk 抗 Gt IgG –Alexa 488 | Molecular Probes | A11055 | 希釈率 1:500 |
| ヤギ アンチ ウサギ - FITC | Southern Biotech | 4050-02 | 希釈率 1:500 |
| DAPI | Sigma | 32670-25MG-F | 希釈率 1 & マイクロ;g/mL |
| 0.05% トリプシン-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | 濃度:細胞培養培地中の10% |
| アダプター | Sarstedt | 14.1205 | |
| 共焦点顕微鏡 | カールツァイス | LSM 710 | |
| 画像解析ソフトウェア | Image J | https://imagej.net | |
| で無料入手可能内皮細胞増殖培地サプリメントミックス | プロモセル | C-39216 | 2 mL 500 mL の DMEM |
| ペニシリン ストレプトマイシン | Gibco | 15140-122 | 濃度: 1% 細胞培養培地 |
| L-グルタミン | Gibco | 25030-024 | 濃度: 1% 細胞培養培地 |
| Heparinun natricum | Drossa Pharm AG | ストック濃度: 5000 U.I./ mL | |
| Chamberslides | Bioswisstec AG | 30108 | |
| CaCl2 x 2H2O | メルク | 2382.0500 | |
| MgCl2 x6 H2O | メルク | 1.5833.1000 | |
| Tween 20 | Axon Lab AG | 9005-64-5 | |
| ウシ血清アルブミン (BSA) | Sigma | A7030 | |
| グリセルゲル実装用メディウム | Dako | C0563 |
参考文献
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