方法論記事

脳スライスにおける GABA のパフ アプリケーションによって引き起こされる全細胞の流れ

DOI：

10.3791/56387

⸱

2017年10月12日

 ,  ,  , 
1School of Psychology, South China Normal University, 2School of Life Sciences, South China Normal University, 3Brain Science Institute, South China Normal University, 4Center for Studies of Psychological Application, South China Normal University, 5Guangdong Key Laboratory of Mental Health and Cognitive Science, South China Normal University

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

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薬理学的試薬が全細胞パッチ ・ クランプ記録中に投与することができ、その成功に不可欠な機能のさまざまな側面を強調、パフの手法について述べる。

要約

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薬理学的管理は、全細胞パッチク脳スライス内の記録を行う場合に通常使用されます。電気生理学的記録中に新薬承認申請の最善の方法の 1 つは、パフの技術は、薬理学的試薬の脳スライスにおける神経活動に及ぼす影響を研究するためです。パフ アプリケーションの最大の利点はこのように膜受容体の脱感作を防止記録サイト中薬物濃度が急速に増大します。パフのアプリケーションの使用の成功は、次の要素に注意: 薬の濃度、パフ マイクロ ピペット、パフ ピペットと記録、ニューロンの先端と期間の間の距離のパラメーターとパフを運転圧力 (1 平方インチあたりポンド psi)。この資料では、γ-アミノ酪酸 (GABA) 前頭皮質スライスのニューロンに息を切らしによって引き起こされる全細胞の流れを記録するためのステップバイ ステップの手順を説明します。特に、海馬、線条体など他の頭脳区域、細胞培養などの異なる製剤にもマイナー変更と同じ手順を適用できます。

概要

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パッチ ・ クランプの技術、神経細胞の電気信号を調査するための主要なツールは、1970 年代の1,2で開発されました。この手法の主な利点は、どのように特定の治療法の知識を提供すること (例えば、薬理学的) 神経機能やリアルタイムに3チャンネルに変更可能性があります。全細胞脳スライス内の記録の中に神経細胞の機能薬理学的評価には、記録されているニューロンにアゴニストまたは特定の受容体の拮抗薬などの薬物のアプリケーションが必要です。このメソッドは、次のニューロン4の生理学的および病理学的特性のよりよい理解につながる特定の薬剤のアプリケーションに発生する神経の変化の識別を許します。薬理学的管理は、5またはパフ6を灌流といずれかを介して行うことができるが、後者より優れたテクニックです。特に: アプリケーションを急速にパフ (i) 増加薬濃度レベルに記録されたニューロンの膜受容体の脱感作を防止; その(ii) パフ薬物の量は非常に低く、したがって脳のスライスに投与された化学物質の任意の望ましくない影響を軽減入浴ソリューションで少し効果があるよう(iii) パフのプロトコルは、設定、保存、作る実験を非常に正確に再現。(パフ iv) アプリケーションは、アゴニスト/拮抗薬、特に、このような試薬が高価なまたは入手困難の経済的な使用を表します。

ここでは、鋭く準備脳スライス、比較的保存状態の良い脳の回路の利点は、準備で GABA を吹き込むことによって引き起こされる細胞流れを記録に焦点を当てます。パフ誘発抑制電流7を行う方法は、この資料に記載されます。セシウム (Cs+) を使用して-0 でニューロンを押しベースの内部ソリューション、mV、GABA パフ誘発を紹介する適切な技術的な詳細と抑制性シナプス電流 (eIPSCs)。リポ多糖 (LPS) 注入8、我々 は、eIPSC を示す誘発性うつ病のマウスモデルを用いた GABA パフにより誘発される振幅が大幅に車両のコントロールと比較して組合を注入したマウスのスライスで減少します。我々 の意図は、この資料ではパフ手法は脳スライスにおける神経活動の化学物質や化合物の薬剤効果の評価を目的とした研究に広く適用できる方法を表示する必要がありますです。

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プロトコル

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動物飼育および南中国師範大学、国立研究所によって確立された動物のケアのためのガイドラインによると動物の研究のための倫理委員会によって承認された手続きに従って実験を行ったすべての動物健康.

1 です。 ソリューションの準備

  1. 表 1 に記載されている当社の出版された仕事の 7 で説明したコンポーネントを含む人工の標準の脳脊髄液 (アプライド) の準備 500 mL。
    1. 使用きれいなガラス ビーカーを脱イオン水新鮮なアプライド溶液を調製します。脱イオン水でへらをきれいにし、NaCl、KCl、NaH を追加する使用する前に乾燥 2 PO 4 NaHCO 3 MgSO 4、D-グルコース、95% O 2/5% ソリューションを持つバブル後 CaCl 2 を追加、CO 2 脱イオン水 500 ml (としての詳細な表 1) 〜 20 分のための混合物。完全に溶解するまで攪拌します
      2. 。 任意の沈殿せずオフに
    2. 、アプライドは完全にことを確認します。7.2 7.4 に pH を調整します。95% O 2 と 5% CO 2 〜 20 分のための混合ガス気泡
  2. スライス切断溶液について、表 2 の化学物質 7 250 mL を準備します。
    1. KCl、MgCl 2 NaH 2 PO 4 NaHCO 3 choline·Cl、D-グルコースを追加し、最後 250 mL の脱イオン水を 1.1.1 に示すように CaCl 2 を追加、1.1.1、1.1.2 で説明されているように溶解します
      2. 。
    2. 95% O 2/5% をバブル後の CO 2、冷たいと凍結切削ソリューションになるように 15 ~ 20 分冷凍庫にソリューションを配置します
      。 注: 我々 は 1-2 か月からのスライスを作るときこの切削ソリューションを使用-古いマウス;2 か月より古いマウスの式が異なる場合があります
      3. 。
    3. エンドトキシン等張生理食塩水に溶解することにより準備組合ソリューション (0.9 %nacl)。LPS は腹腔内投与 (0.5 mg/kg)、2 h を後で記録を開始します
      4. 。

2。前頭野スライスの準備

  1. 冷凍庫から切削ソリューションを取るし、スラッシュを取得するホモジナイズしてください。氷上ソリューションを配置し、常にバブルの 95% O 2/5% CO 2.
  2. 大規模な鋭いはさみを使用して、すばやく説明 9 としてマウスの首をはねるし、すぐに氷が入ったビーカーに頭を入れて (0-4 ° C) 切削ソリューションです
    3. 。
  3. 高級はさみで鼻尾側方向に正中線に沿って頭蓋骨の上部を切り取り、外側頭蓋部分を削除します。冷たい切削ソリューションに高級ヘラとドロップで脳を削除します
    。 メモ: 手順 2.2 2.3 急速に実行する必要があります (理想的には < 1 分) です
    4. 。
  4. は、氷を入れた 9 cm シャーレの蓋の脳を配置します。冷たい切削ソリューションで脳をすすいでください。小脳およびかみそりの刃と嗅球切断します
    5. 。
  5. 試料へ適用シアノアクリ レート系接着剤、vibratome のホルダーです。慎重に、吻側側の接着剤のドロップに脳ブロックを配置し、すぐに冷たい切削溶液に浸します
    6. 。
  6. 水平平面と 15 度の角度に vibratome のブレード ホルダーを調整し、コロナ脳スライス 350 μ m を準備 (翼振動周波数 = 85 Hz、速度 0.1 mm/s を =).
  7. 定数バブルで 95% O 2/5% (RT) で 1 時間インキュベート アプライド、満ちている回復室にスライス転送ピペットを使用して、CO 2.

3。全細胞パッチ記録

  1. 作るガラス ホウケイ酸用マイクロ ピペットについて電極として使用または引き手操作マニュアルの特定のガイドラインに従ってマイクロ ピペットをパフします。電極、チップ抵抗は 4-6 M の範囲の Ω、パフ用マイクロ ピペットは、2-5 μ m 範囲の先端の直径を持っている
    2. 。
  2. は、ブロック高速 Na + チャネルおよびこうして活動電位、アプライドに + Na チャンネル遮断薬 (TTX、1 μ M) を追加し、商工会議所に蠕動ポンプによって録音室で 2-3 mL/分のこの溶液の一定流量を維持それを吸引。バブルのアプライド 95% O 2/5% CO 2 スライスの存続させるため常にします
    3. 。
  3. は、スライスのサイズに合わせてカットされた微細先端変更したパスツール ピペットを使用して録音室に脳スライスを転送します。間隔の並列ナイロン スレッドでプラチナ スライス アンカーでスライスをカバー ≥ プラットフォーム上のスライスを保持するために 2 mm を離れてします
    4. 。
  4. 記録マイクロ ピペットを詰めて内部ソリューション 7 (表 3)、10 の μ M、50 μ M、100 μ M (アプライドで解散) や車両制御としてアプライドで GABA とパフ マイクロ ピペットを埋める
    5. 。
  5. の破片との閉塞を防ぐために、アプライドに記録電極を浸す前に 1 mL の注射器を使用して光の肯定的な圧力を適用されます。顕微鏡 (4 x 対物レンズ)、マイクロマニピュレーターを使用してヒント ( 図 1 A) のモニターで、ビデオ画像の中央に表示されるように記録電極とパフのマイクロ ピペットを置きます
    6. 。
  6. はパフ マイクロ ピペットを徐々 に削減しながら顕微鏡焦点 (40 x 対物レンズ) を調整し、45 ° の角度で記録ニューロン上に配置します。パフ マイクロ ピペットの先端と 20-40 μ m ( 図 1 B) 間に記録されたニューロンとの間の距離を保ちます。ゆっくりと慎重に記録電極を神経細胞にアプローチし、肯定的な圧力を離します。ギガ オーム シールを作成する電極ホルダーに接続されているチューブを弱いと簡単な吸引を適用します
    7. 。
  7. 維持 0 時電圧 mV。ギガ オーム シールの形成後、高速を補うため、手動でまたは自動的に容量を低下します。全体セル モードに入る上記チューブを介して簡潔で強力な吸引を適用します
    8. 。
  8. 電圧クランプのレコード eIPSC モード。マスター 8 ステップ電圧によって制御される Picospritzer を使用してシングルまたはペアの GABA のパフ ( 図 2) を実現するパフ ピペットに低ガス圧 (窒素、4-6 psi) を適用します
    9. 。
  9. ベスト eIPSC 結果 ( 図 3) を取得し、LPS 誘導性うつ病モデル ( 図 4) で eIPSC を測定パフ期間を変更します
    10. 。

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結果

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パフ テクニックは、薬の特定の神経細胞の表面に特定の受容体に及ぼす影響の研究に研究できます。この記事では、GABA 受容体を介した電流に着目します。パフと録音用のマイクロ ピペットを図 1に示します。パフは、アプライドによって生成された物理的な圧力の記録されたニューロンに影響を排除するために、ショ糖パフ (図 2A) がコントロールとして使用されます。一方、図 2Bに示すように、アプライド ウォッシュ アウト (ブルー) によって基準状態を回復できます、報告10、ピクロトキシンなどの GABA 受容体阻害剤による GABA パフ (黒) による応答をブロックできます。特に、アプライドもショ糖パフ誘発応答、GABA パフ反応は生理学的な記録された細胞の表面にある GABA 受容体を介...

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ディスカッション

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パフ アプリケーション シナプス後受容体機能3,4、7の評価に広く使用、各実験では正確なコントロールが必要です。GABA パフ前頭皮質脳スライスの Ips (すなわち、eIPSCs) の誘導を示す細胞パッチクを含む手順をご紹介します。記録電極の抵抗が約 5 MΩ、パフ用マイクロ ピペットの先端の直径は 2-5 μ m パフ圧力 4 6 psi 間は: この範囲は重要なより低い圧力で発生する可能性より高い圧力は神経の損傷を引き起こす可能性がありますシナプスの GABA 受容体の不十分な活性化。記録されたニューロンにパフ ピペットの先端からの水平距離については 20-40 μ m (1-2 神経細胞の直径)、およびパフ マイクロ ピペットとスライス面の間の角度は約 45 °。パフ ピペットの先端がスライス (z 軸) 上垂直方向に 20-40 μ m です。パフの期間は上記の状況では、10-50 μ M の GABA のパフの下 10 150 さんは適切な...

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開示事項

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著者が明らかに何もありません。

謝辞

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著者は以下の組織を感謝したい: 国家自然科学基金、中国の (31171018、31171355)、科学技術広東部 (2013KJCX0054)、広東省の自然科学基礎 (2014A030313418、2014A030313440)、広州科学と技術局 (201607010320)。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ガラスホウケイ酸マイクロピペットシャッター器具BF150-86-10外径1.50mm、内径0.86mm
マイクロピペットプーラーシャッター器具MODEL P-97 フレーミング/ブロウマイクロピペットプーラー
マイクロマニピュレーターシャッター計器MP-285
コンピュータ制御アンプ   Molecular DevicesMulticlamp 700B
デジタルアクイジションシステム モレキュラーデバイスDigidata 1440A
イメージングカメラニコン 2115001検査装置
顕微鏡 ニコン エクリプス FN1 
マスター 8A.M.P.I.マスター-8 パルス刺激装置
ビブラトームスライサーライカVT 1000S
カミソリ刃ジレット74-SFLYING EAGLE
ビデオモニターパナソニックWV-BM 1410
502 グルーデリ7146シアノアクリレート接着剤
蠕動ポンプ上海 JIA PENG CorporationBT100-1F
ビデオカメラOlympus America MedicalOLY-150
Transfer PipetsBiologix30-0138A1

参考文献

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  1. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
  2. Sakmann, B., Edwards, F., Konnerth, A., Takahashi, T. Patch clamp techniques used for studying synaptic transmission in slices of mammalian brain. Q J Exp Physiol. 74 (7), 1107-1118 (1989).
  3. Eyo, U. B., et al. Neuronal hyperactivity recruits microglial processes via neuronal NMDA receptors and microglial P2Y12 receptors after status epilepticus. J Neurosci. 34 (32), 10528-10540 (2014).
  4. Dickinson, G. D., Parker, I. Factors determining the recruitment of inositol trisphosphate receptor channels during calcium puffs. Biophys J. 105 (11), 2474-2484 (2013).
  5. Lee, J., et al. Columnar distribution of activity dependent gabaergic depolarization in sensorimotor cortical neurons. Mol Brain. 5, 33(2012).
  6. Glykys, J., Mody, I. The main source of ambient GABA responsible for tonic inhibition in the mouse hippocampus. J Physiol. 582, (Pt 3) 1163-1178 (2007).
  7. Chen, M., et al. APP modulates KCC2 expression and function in hippocampal GABAergic inhibition. Elife. 6, (2017).
  8. Dunn, A. J., Swiergiel, A. H. Effects of interleukin-1 and endotoxin in the forced swim and tail suspension tests in mice. Pharmacol Biochem Behav. 81 (3), 688-693 (2005).
  9. Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J Vis Exp. (117), (2016).
  10. Wondolowski, J., Frerking, M. Subunit-dependent postsynaptic expression of kainate receptors on hippocampal interneurons in area CA1. J Neurosci. 29 (2), 563-574 (2009).
  11. Yang, L., Wang, Z., Wang, B., Justice, N. J., Zheng, H. Amyloid precursor protein regulates Cav1.2 L-type calcium channel levels and function to influence GABAergic short-term plasticity. J Neurosci. 29 (50), 15660-15668 (2009).
  12. Huo, Q., et al. Prefrontal Cortical GABAergic Dysfunction Contributes to Aberrant UP-State Duration in APP Knockout Mice. Cereb Cortex. , (2016).
  13. Zhou, W. L., Gao, X. B., Picciotto, M. R. Acetylcholine Acts through Nicotinic Receptors to Enhance the Firing Rate of a Subset of Hypocretin Neurons in the Mouse Hypothalamus through Distinct Presynaptic and Postsynaptic Mechanisms. eNeuro. 2 (1), (2015).

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