方法論記事

共焦点顕微鏡を用いた可視化マクロファージ細胞外トラップ

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DOI：

10.3791/56459

⸱

2017年10月19日

 ,  ,  ,  , 
1Monash Lung and Sleep, Monash Medical Centre, 2Monash University

この記事について

サマリー

マクロファージ細胞外トラップは、新しく記述されたエンティティです。この資料に共焦点の顕微鏡検査方法に集中して体外と体内の肺検体から可視化方法します。

要約

好中球細胞外トラップ (網) の存在を定義するために使用する主な方法は、共焦点顕微鏡です。確立された共焦点顕微鏡によるマクロファージ細胞外トラップ (メッツ) を可視化する方法を変更しました。これらの細胞外のトラップは、顆粒プロテアーゼ、シトルリン化ヒストン ペプチジル アルギナーゼ アルギニンデイミナーゼ (PAD) などの他のコンポーネントの共発現細胞クロマチンの存在によって定義されます。メッツの式は一般的に刺激への暴露後に測定し、非刺激のサンプルと比較しています。サンプルは背景とアイソタイプ コントロールの含まれています。細胞を分析するには、明確に定義された画像解析ソフトを用いてします。メッツの存在を定義する共焦点顕微鏡を使用することがあります体外と体内の肺組織の両方。

概要

好中球細胞外トラップ (ネット)、最初ブリンクマンらによって記述されていた1彼らは (特に細菌) への感染への応答で主に作り出され、ホストの防衛1,2で重要な役割を持っています。彼らは、非感染性疾患、血管炎、全身性エリテマトーデス (SLE); などへの応答で発生することも記載されています。・ マイトジェン ホルボール 12 myrisate 13-アセタート (PMA)2,3。最近、他の細胞型が大食細胞を含む細胞外のトラップを生成しても認識されています。マクロファージ細胞外トラップ (メッツ) はまだ文学4,5で明確に定義されたエンティティではありません。メッツの存在を検出するためのメソッドも確立の in vitroとin vivoの6,7。この記事でメッツの共焦点顕微鏡を用いた測定が表示されます。

(アポトーシス8) など他の細胞細道からそれを区別する NETosis の主な機能はクロマチンと組み合わせての押出: ヒストン (H3Cit)9のシトルリン (1)、(2) 顆粒プロテアーゼ10 の共発現、ペプチジル アルギニン アルギニンデイミナーゼ (PAD) 4 の (3) の関与11,12。マクロファージはまた H3Cit、顆粒プロテアーゼおよびパッドを表現し、メッツの存在を定義するこれらの機能を使用することができます。

メッツは、肺胞と肺の気道内に存在の支配的な細胞のマクロファージで、感染症/炎症細胞性免疫応答を監督の初期のロールとして、肺の特に重要な役割があります。また、肺の大部分は空スペース (例えば肺胞内) が、メッツは空き領域、固形臓器とは対照的に拡大する可能性があること。

共焦点顕微鏡は網の存在を定義する最も広く使われている方法です。まだでは、メッツを測定する明確に定義された方法はないです。ネットの測定法は、このプロトコルではメッツの存在を測定に適応されています。このメソッドの主な要件は、共焦点の顕微鏡検査および適切なイメージング ソフトウェアにアクセスし分析。

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プロトコル

このプロトコルに続く承認実験: (1) 倫理委員会のモナッシュ医療センター、および (2) メルボルン大学の倫理委員会の動物による人間

。

1 気管支肺胞洗浄 (BAL) マクロファージ

  1. 肺マクロファージを取得する使用バル: (1) 人間は気管内吸引を用いた気管支鏡検査 6、および (2) マウスで科目 13。.
    注意: マクロファージの獲得は一般にこれらの細胞のいくつかの活性化を引き起こします。マクロファージは潜在的な健康上の問題を調査するため, 気管支鏡検査が必要な患者から得られた、すべての科目はメッツ (これは個々 のプロジェクトごとに決定する必要があります) の解析に適したあります。
    1. フォーム ペレットにバル ソリューションとスピンダウン (500 x g で 10 分間) を取る、培 (ロズウェル パーク記念研究所中 (RPMI) 1% と 5% 牛胎児血清 L-グルタミン) 室内温度で 2 回洗浄し、文化メディ 4 ml を希釈してum
      2. 。
    2. に応じて、要求の形式的な差分カウント; 細胞の大部分 (一般に > 80%) マクロファージ 6 になります
      。 注: この一般にによって実行されます異なるセル タイプ 6 の形態学上の外観を使用して臨床的組織学サービス
      3. 。
    3. 実行可能なマクロファージ細胞はトリパン ブルー色素排除と診断使用してバル ソリューションにカウントします
      。 注: 手順 1.1 で述べたようにバル ソリューション、人間およびマウスから取得されます
      4. 。 37 ° C で 24 ウェル プレートに 500 μ L の培地も、残すあたりで coverslips に 10 x
    4. 追加 1 4 5 マクロファージ一晩; セルは、coverslips に固執します。人間のサンプル追加抗生物質 (例えば ペニシリン、ストレプトマイシン、10 4 U/mL) 細菌汚染を防止する
      5. 。

2。バル マクロファージの免疫蛍光ラベリング/顕微鏡的

注: 細胞がカバーガラス上守られている上記のよう

。
  1. は培養培地を削除し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で一度セルを洗浄します。10 分の 2% パラホルムアルデヒド/過ヨウ素酸/リジン (PLP) の定着剤でセルを修復する
  2. 簡単に PBS のセルを洗浄し、0.2% permeabilize 20 分 PBS でトゥイーン 20
  3. 10% 5% ウシ血清アルブミン (BSA) を 30 分 PBS で希釈した鶏血清と細胞をブロック
    4. 室温 37 (テーブルの材料 でより具体的な詳細表示) 1: 100 の濃度で 1 時間
  4. 加温プライマリおよびアイソタイプ コントロール抗体 ° C
    注: バル サンプル大食細胞の特異的マーカーは通常必要ありません
    5. 。
  5. 一次抗体の添加後、PBS のセルを洗浄し、さらに室温で 40 分間対応する二次抗体とインキュベートします
    6. 。
  6. PBS およびレーザー励起 405、488、561 647 nm と 40 X (前述) 共焦点顕微鏡を用いた可視化のメディアを DAPI ベース マウントをマウント内のセクションを洗って、1.0 NA 石油目的
    7. 。

3。肺組織検体

注: 体内 の肺組織の研究に、関連するばく露後サンプルの研究 (例えば、前述の o ' サリバン ら 7). この実験に最も適切な露出が伝染性の微生物、特に細菌。このメソッドに使用できるマウス系統は C57BL/6 または BALB/c マウス、10-12 週齢、体重 25-30 g、男性

。
  1. (400 mg/kg) ケタミン ・ キシラジン (40 mg/kg) の腹腔内注射での安楽死マウス。胸腔内を開き、肺と心臓手術用鉗子、はさみを使用して公開します。
    1. 30 の血管から血液を洗浄する右心室に 21 ゲージ針を使用して温かみのある PBS を吹き込む s、30 の 2 %plp 固定液 10 mL を注入 (右心室) に s.
    2. を使って開いて胸腔洗浄暖かい PBS (42 ° C)。21 g 針と大きさに切った 0.8 mm チューブを気管挿管し、800 μ L (42 ° C) に予め温めておいたを注入、低融点アガロース溶液の 3% をポイントします
      3. 。
    3. ネクタイは、編みシルク (4.0 USP) と気管をオフします。スレッド、カニューレの挿入ポイントのすぐ下の気管の周りに置き、シンプルなオーバーハンド ノットを介して固定します。Agarose を固める、肺の周りの氷冷 PBS を管理します。肺と心臓をはさみと鈍的切離を使用して胸腔内からブロックとして削除します。個別に各肺を削除し、2 の 16 h のため修正 %plp またはホルマリン 4 ° C
    4. は PBS の標本をティッシュまで 4 ° C で保存します。肺組織を取得するこれらのメソッドは、上記 13 きた
      5. 。
  2. 肺組織を準備するサンプルは、次の手順を使用します。
    1. 室温で 24 時間 10% 天然緩衝ホルマリンで修正肺組織 (3.1 の手順で切除)。75% エタノールに転送し、入れてティッシュ プロセッサ (2.5 h 75% エタノール、無水エタノールで 3 h、3.5 h 溶剤 3 b、パラフィンで 3 h) 12 時間サイクルで
      2. 。 室温で保存されているホルマリン固定のパラフィン埋め込まれたの (FFPE) ブロックを作成する標準的なパラフィンで
    2. 埋め込み
      。 注: この段階でそれは一般に標準的なスライドの肺のセクションをカットする便利な
      3. 。
    3. ミクロトームを使用して 4-5 μ m の厚みで FFPE 肺セクションをカットし、充電されると、スライドに塗った O で前述のようにマウント ' サリバン ら 7
    4. スライドをマウント、coverslips 60 × 24 mm (サイズ 1.5) にメディアをマウントの 3 滴を入れ、上のスライドを反転、余分なメディアを押し出します。密閉マニキュアで密封し、常温で保存します
      5. 。

4。肺組織のサンプルの準備/顕微鏡

  1. デ ワックス、水分補給、抗原検索ソリューションの FFPE 肺の組織サンプルを前処理します。
    1. 乾燥オーブン、FFPE スライド 60 ° C で 60 分室温で 5 分間 70% エタノール溶液に 30 分と転送のキシレン溶液でスライドを置きます。水道水でリンスします
      2. 。
    2. 場所耐熱ラップであり、10 で 10 分間圧力鍋で HIER 抗原検索 m/mol/L トリス、1 モル/EDTA pH 9.0。20 分洗浄 5 分にロッカーの上、一度 PBS でロッカーの水道水の 2 倍のために涼しい
      3. 。
    3. ブロック 5% 10% 鶏血清中の部屋の温度で 30 分間 BSA/PBS
      4. 。
  2. 組織を染色します。
      マクロファージにおけるメッツを定義、1% の一次抗体 (MMP 9、H3Cit、および F4/80) を追加
    1. BSA/PBS (抗体量に関する特定の詳細は 表の資料 に記載されて) 1/100 倍希釈液を 4 ° C で 16 時間。ロッカー上で 5 分間 PBS で 2 回洗って
      2. 。
    2. 対応するセカンダリと孵化によって達成する蛍光検出抗体 1 %bsa/PBS 室温で 40 分。抗体: (1) 鶏反マウス 488 (緑)、(2) 鶏の反やぎ 594 (赤) とロバ (3) 抗マウス (遠赤) 647
      3. 。
    3. PBS および DAPI 含むクロマチンの汚損のためメディアをマウントをマウント内のセクションを洗うです
      4. 。
  3. 頭倒立顕微鏡に接続を走査型共焦点レーザーによる蛍光画像を取得します。
    1. エキサイト 405, 488, 561, 647 と準備 nm のレーザーです。線順次をクリックして単一の平面の 512 x 512 ピクセルの画像をキャプチャ、20 X 0.1 を使用して (2 ラインの平均) ボタンを平準化 NA 空気と 40 X 1.0 NA オイル目標
      2. 。
    2. それぞれの結果 (すなわち、10 高出力フィールドの (HFOV) コントロールのビュー、刺激のサンプルのため など、それぞれのマウスの 10) のデータと分析のセクションごとの少なくとも 10 のフィールドの表示を取得します
      。 注: フィールド全体の代表的なサンプルを得るためには、マトリックス システム使用できますにフィールドが分割にさまざまなセクションと同じ行列を使用してビューのフィールドを選択各別のサンプルのため (例えば フィールドは 9 セクションに分けることができ、2 つ HFOV の撮影中心、4 つのコーナーから).

5。三次元 (3 D) 画像のメッツ

注: メッツは 3次元構造、複数 z スタックで、再構成、画像は貴重な情報を与える可能性があります

。
  1. 1.8 mm、0.1 から 0.5 の速度振幅で、vibratome を使用して 200 μ m でのパラフィン ブロックから肺標本をセクション mm/s.
  2. それぞれ血清 (10% 牛胎児血清と 10% 鶏血清) の 20% に肺組織をブロックし、補われる PBS で 3.75 %permeabilize 穏やかな動揺の下で室温で 7 h のトリトン X 100 です
    3. 。
  3. (抗体濃度は 表の資料 に記載されて) マイクロ遠心チューブ用の 200 μ L のボリュームに関連する一次抗体 (MMP 9、H3Cit、および F4/80) 4 ° C で 16 時間のセクションを染色します
    4. 。
  4. Pbs は、1 時間室温で関連する二次抗体とインキュベートする前に 10 分の 3 回のセクションを洗う
  5. PBS でスライドを顕微鏡にカバー スリップを追加する前に 20 分のためのソリューションの DAPI (1:5, 000) のため肺のセクションを染色します
    6. 。
  6. 倒立共焦点顕微鏡 (40 × 1.3 NA) 405 装備を用いた蛍光画像を取得 440 nm nm、473 nm、543 nm ・ 635 nm レーザー
    7. 。
  7. 40 × 1.3 NA 石油目的のための最適な z 区分と 0.54 μ m の厚みの 3-D z スタックを記録します
    。 注: 個々 の顕微鏡によって使用されるソフトウェアが異なります。補足ファイル 1 で 1 つの顕微鏡のためのソフトウェアの使用方法の例を提供します
    8. 。

6。画像解析

注: 試料の分析は特定のイメージング解析ソフトウェアの使用を必要とし、材料表 の例のとおりです。記載されている以下の点が重要な結果の分析に使用される特定のプログラムに依存している間です

。
  1. バル分析サンプル DAPI の青のチャネルを選択し、セルの最小サイズを割り当てることによって
    1. マクロファージ数の定義 (例えば、> 直径 18 μ m)。フィールドごとの大食細胞の総数を測定関連のソフトウェアを使用しています
      2. 。
    2. は、他のマーカー (例えば MMP12、PAD2、および H3Cit) の共発現で DAPI によって検出された細胞のクロマチンの存在によって、メットの特徴を持つセルの数をカウントします
      。 注: 分析できるマーカー数利用できるレーザーの数によって異なりますが、理想的な DAPI、に加えて他の少なくとも 2 つのマーカーを含めるべき。他以下の MET の過剰発現 (例えば, 細胞クロマチンと拡大核細胞数) のための特定のパラメーターを使用できます
      3. 。
    3. バルで、MET の過剰発現を比較する (コントロール、煙、煙/DNase 処理グループと)、サンプル分析サンプルあたり 100 バル マクロファージの最小します
      4. 。 二次抗体とアイソタイプを測定する
    4. 蛍光性のレベルを制御; 各サンプルの蛍光性のための 100 のセルの最小値を測定します。(例えば H3Cit) の各マーカーの蛍光バック グラウンドの平均レベルを測定標準のソフトウェアを使用しています
      5. 。 MET の式を定義する
    5. (例えば H3Cit、MMP9 の共発現と細胞のクロマチン) 典型的な表現型と細胞をカウントし、各 MET の (例えば H3Cit、MMP9) マーカーの蛍光性のレベルを測定します。背景とアイソタイプ コントロールの上ではなかった自分を汚す場合メッツを産生する細胞を除外します
      6. 。
    6. 人間のバル サンプルのメッツをするマクロファージの割合については各サンプルの 100 セルの最小値を分析します。マウスのサンプルの細胞は小さく、メッツを定義するは難しいと分析 (例えば、200 のマクロファージ) の各サンプルに対して細胞の大きい数
      7. 。
  2. 肺組織検体の解析
    1. 肺組織のメッツの存在を決定する F4/80 など特定の大食細胞のマーカーを使用します
      2. 。
    2. 肺組織のセクション 6.1 を参照に記載されている他のパラメーターと細胞クロマチンを発現する細胞の F4/80 の共局在を使用してメッツの存在を定義します
      3. 。
    3. は、二次抗体とサンプルの背景の蛍光性のレベルおよびアイソタイプ コントロールを決定します。メッツを背景の上は解析から除外します
      4. 。

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結果

メッツは、バル サンプル、肺組織、3次元画像でより厚い肺セクションからビジュアル化する可能性があります。メッツ バル サンプルの可視化の例は、図 1に示すです。メッツの形態は、成熟の段階によって異なります。顕微鏡の最初の検出機能は、セルの端に核の運動です。その後に、H3Cit と顆粒のプロテアーゼなどの他の共発現メディエーターの細胞クロマチンが続きます。以前の段階でセルはまだ表現される細胞外トラップでほぼ球形の形に。後の段階で会った形成は細胞体の伸びが特徴です。

肺組織メッツは図 2のとおりです。肺は、肺のアーキテクチャを定義する流体に水増しは、メッツは、肺胞の壁に対して一般的にプッシュされます。メッツの形態は、カットされた面組織によっても異なります。肺組織検体に使用される標準的な断面は、厚さ 4-5 μ m です。厚い切片がべきであ...

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ディスカッション

このレビューで説明している手法はネット14の存在を定義するために使用しました。マクロファージは、バルのサンプルで支配的なセルの種類とコレクションのこのメソッドは、メッツを勉強するために最適です。赤血球が、バルの存在する場合、これらの細胞は塩化アンモニウムを使用して分離する必要があります。バル プロシージャが一般にマクロファージをアクティブにし、メッツ非刺激のサンプル中に存在すると期待されます。バル マクロファージは通常非常に付着です。バル マクロファージ一般的に必要はありません特定のマーカーとしてこれらの細胞支配的なセルの種類は、その形態によっても区別することができます。バル、80% の細胞がマクロファージ (と好中球が 5% 未満) より大きいの通常、洗浄後、一般的に付着性の白血球の (すなわちマクロファージ) の6まま。ヒトの好中球とマクロファージを区別する能力に疑問がある場合好中球エラスターゼなど好中球マーカーを使用することがあります。肺組織、大食細胞は他の細胞の種類を区別することは困難、特定のマクロファージのマーカー...

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開示事項

著者はこの作品に関して開示があります。

謝辞

この作品は、モナッシュ大学、国民の健康および医学研究評議会とモナッシュ肺と睡眠研究所からの助成金によって賄われていた。著者は共焦点の顕微鏡検査の映像とヘルプのモナッシュ健康、ジュディ ・ キャラハン、アレックス Fulcher、Kirstin Elgass、カムデン Lo のモナッシュ マイクロ イメージング (MMI) で臨床免疫学のスタッフを感謝したいし、著者認める MMI 設備モナッシュ大学。著者は、施設、モナッシュ組織プラットフォームの科学的な技術的な支援を認めます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
ヒトサンプル: Primary antibodies
Rabbit anti-human H3Cit (Citrulline R26)AbcamAB510310 ug/ml
Rabbit anti-human MMP12Novus BiologicalNB110-572141:100 concentration not quantifiable
Mouse anti-human MMP9Novus BiologicalAB1199061:200 腹水、濃度なし
与えられたウサギの抗ヒトPADI2 / PAD2カムAB164787 ug / ml
マウス抗ヒトPADI4 / PAD4カムAB12808610.1 ug / ml
ヒツジ抗ヒトNEライフスパンバイオサイエンスLS-B424425 ug / ml
名前会社カタログ番号コメント
マウスサンプル: Primary antibodies
Goat anti-mouse MMP9AbcamAF90910 ug/ml
Rabbit anti-mouse H3Cit (Citrulline R26)AbcamAB510310 ug/ml
Rat anti-mouse F4/80In-house (hybridoma)In house20 ug/ml
Sheep anti-human Anti-HNE /NEサファイアバイオサイエンスLS-B424425 ug / ml
マウス反人間­&シャイ;&シャイ;&シャイ;PADI4/PAD4アブカムAB12808610.1 ug/ml
スーパーフロストプラススライドメンゼルS41104A
ダピ-プロロングゴールドモレキュラープローブP36931
トリトン-X 100シグマ-アルドリッチ85111
塩化アンモニウムグマ-アルドリッチE9434
名前会社名カタログ番号コメント
二次抗体
チキン抗ウサギAF 488/ライフテクノロジーズ A-21441
チキン抗ウサギAF 594ライフテクノロジーA-21442
チキン抗ヤギAF 594技術A-21468
ニワトリ反ネズミ AF488生命技術A-21200
ロバ反ヒツジ AF 594生命技術A-11018
ニワトリ反ネズミ AF 647ライフテクノロジーA-21463
ロバ反ヒツジ AF 594ライフテクノロジーA-11016
アイソタイプ制御
ウサギIgGインハウス
ウサギIgGハウス
IgG1BDバイオサイエンス550878
ウサギIgGインハウス
マウスIgG2aBioLegend400201
羊IgGハウス
名前Companyカタログ番号コメント
Software Programs
ImarisBitplane
Image JNIH
蛍光色素の平均強度には、Microsoft Excelなどの標準的なオフィスアプリケーションを使用できます
名前会社カタログ番号<strong>コメント
顕微鏡
C1 共焦点走査顕微鏡ニコン
FV1200 共焦点走査顕微鏡オリンパス
名前会社カタログ番号コメント
組織ソース
モナッシュメディカルセンターの
気管支鏡検査スイートからのヒトBALサンプルメルボルン大学薬理学部のマウスBALサンプルと肺組織。
名前会社カタログ番号コメント
Media
RPMISigma-Aldrichr8758
子牛胎児血清Sigma-AldrichF0926
L-グルタミンSigma-AldrichG7513
Name企業名カタログ番号コメント
その他の試薬
スーダンブラックSigma-Aldrich199664
パラホルムアルデヒド/過ヨウ素酸塩/リジン(PLP)固定剤Sigma-Aldrich27387
キシレンSigma-Aldrich214736
ケタミンSigma-AldrichK2753
天然ホルマリンSigma-Aldrich42904
パラフィンSigma-Aldrich327204
アガローSigma-AldrichA2576
溶剤 3BHi-Chem2026
カバースリップ 12 mlSigma-AldrichS1815
カバースリップ 60 x 24 mlSigma-AldrichC6875
NameCompanyカタログ番号コメント
マウス
c57 黒 6モナッシュ動物研究プラットフォーム (MARP)
BALB/cMARP
アブアブ シズ ライフインマウスス

参考文献

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
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  3. Jorch, S. K., Kubes, P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease. Nat Med. 23 (3), 279-287 (2017).
  4. Cheng, O. Z., Palaniyar, N. NET balancing: a problem in inflammatory lung diseases. Frontiers immunol. 4, 1(2013).
  5. Boe, D. M., Curtis, B. J., Chen, M. M., Ippolito, J. A., Kovacs, E. J. Extracellular traps and macrophages: new roles for the versatile phagocyte. J Leukoc Biol. 97 (6), 1023-1035 (2015).
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