マウス モデルにおける注射の静脈内投与と胎嚢内のルートを通して子宮内移植 (IUT) を実行するためのプロトコルについて述べる。このプロトコルを使用するユニークな免疫トレラント胎児環境に細胞、ウイルスのベクトル、およびその他の物質を導入することができます。
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この記事について
サマリー
要約
子宮内移植 (IUT) は、妊娠の早い段階で他の物質やウイルスベクター、幹細胞を導入するための療法のユニークで多彩なモードです。治療目的のための IUT の背後にある理論的根拠は胎児、胎児の免疫学的未熟さ、アクセシビリティおよび増殖性胎児の幹または前駆細胞、病気を治療するために潜在的なまたは症状の発症の小さなサイズに基づいています前に誕生。必要ななく、鎌状赤血球症など先天性の血液疾患を治療するために可能性を秘めて、IUT 胎児、造血幹細胞 (HSC)経由での配信のこれらの通常発達特性の活用破壊的または生後 HSC の移植に必要な免疫抑制をご利用いただけます。同様に、開発中に複数の臓器における前駆細胞のアクセシビリティ潜在的またはゲノム編集する遺伝子治療用ウイルスベクターの IUT 幹/前駆細胞の効率的ターゲティングできます。また、IUT を含む、通常の発達過程を研究するために使用できますが、免疫学的寛容の開発に限定されません。マウスのモデルは、可能性と前臨床試験の大規模な動物実験および最終的な臨床応用の前に IUT の限界を理解するための貴重なかつ手頃な手段を提供します。ここでは、静脈内投与と胎嚢内のルートをマウスの胎児で、IUT を実行するためのプロトコルについて述べる。このプロトコルは、必要な条件と造血幹細胞移植子宮内、寛容誘導、遺伝子治療への子宮内の背後にあるメカニズムを解明する正常に使用されています。
概要
出生前スクリーニングと診断の最近の進歩は、光の十分な出生後の治療法の選択肢を持っていないと重大な罹患率と死亡率は、先天性疾患の数の胎児の治療の可能性に持ち込んでいます。具体的には、子宮内で造血幹細胞移植 (IUHCT) と遺伝子治療・ ゲノム編集血液疾患、免疫、および遺伝的、先天性の治療に胎児の正常発達特性を活用する可能性があります。産後の HSC 移植と遺伝子治療・ ゲノム編集1,2を行うことができますよりもより効率的に障害します。具体的には、胎児のサイズが小さいため、ドナー細胞またはウイルスのベクトル量を最大化できる受信者の重量あたり。さらに、胎児の免疫学的未熟さは、生後移植プロトコルでドナー造血骨髄破壊的と免疫調節せずに注入することが必要なことができます。同様に、遺伝子プロダクトまたはウイルスのベクトルに対する制限免疫応答せず治療遺伝子やゲノム編集技術を運ぶウイルスベクターに注入することができます。最後に、アクセシビリティと胎児幹細胞/前駆細胞の増殖の性質余裕サイクリングを必要とするゲノム編集 (ホモロジー監督修理) モードと同様、ターゲットの前駆細胞のより効率的な情報伝達の可能性効率的に発生する細胞。マウスのモデルは前臨床試験の大規模な動物モデルでみる前に免疫・幹細胞生物学の重要な問題に対処するための洞察力と手頃な手段として提供していますなど、IUHCT と子宮内で主要なモデルを務....
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プロトコル
実験プロトコルは、機関動物ケアおよびフィラデルヒィアの小児病院で使用委員会によって承認されました。
1. インジェクション ピペットの創造
- 垂直マイクロ ピペット引き手を使って 100 μ L マイクロキャピ ラリー ピペット (図 1 a ・ 1 C) を引き出します。> 1 cm 長いテーパー エンドがあるのでマイクロ ピペットの引き手を調整します。
注: 当初、引き手の設定を最適な長さに調整する必要があります。高い熱設定は長く、先端になるし、プルを高く設定、先端の直径を幅を狭くします。 - それは ≥ 1 cm 長いテーパー エンドをカットします。保障、針の先端の内径が 70 μ m ~ 100 μ m、テーパー エンドの長さに反比例します。
注: 内部の直径は、ピペットの引き手の校正によっても異なります。垂直マイクロ ピペットの引き手や最寄りのピペットの引き手タイプの製造元からの指示を参照してください。 - 針が正しい内部直径を有することを確認した後に、ピペット beveller を用いたシャープ ホイール (図 2 a ・ 2 C) ダイヤモンド チップを研ぐことにより 15-20 度の傾斜面を作成します。速報や先端の....
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結果
生存率と生着 IUHCT 実験の成功の重要な措置であります。帝王切開または後天的実験の特定のエンドポイントによって、IUHCT を受けた胎児出生前分析があります。平均では、静脈内注射後の生存率は 75-100% から及ぶ。胎嚢内注射後の生存率は、約 85-100% での静脈注射をより公正な傾向があります。
当研究室では、これらの技術の能力を達成するためにトレーニング プロセスは、約 8-12 ヶ月をかかります。再現性のある方法でこれらの注射を実行するために必要な技能の習得を評価するために研修生は胎児の生存とドナー生セル着、IUT、次短時間の点で監視されます。これは、次の品質管理実験により示しています。具体的には、1 × 107全骨髄細胞は C57BL/6TgN(act-EGFP) OsbY01 から分離されます (「B6 GFP」) マウスは前述5の説明し、妊娠 14 日 Balb/.......
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ディスカッション
子宮内移植は、妊娠の早い段階で診断することができます多くの先天性疾患に対する潜在的な療法です。IUT のマウスモデルでは、研究者胎児環境を探索するか、別の治療法を実験することができます。挿入されると何が目標とされている、に応じて静脈または内羊膜の子宮内移植は望ましい領域に、乳液の信頼できる配信を提供できます。
特定の臓器をターゲットにする場合は、注入の技術と同様、胎児の適切な発生学的年齢を選択することが重要です。E14 で細胞の静脈注射は血液のニッチをターゲットに最適、E16 で胎嚢内注入は肺をターゲットに最適です、これらのオプションだけではありません。たとえば、胎嚢内注射が行えます胎児 E8 早くも超音波ガイダンス8。全身配信も E9 - E1011で超音波ガイド下心臓内注射で E14 まで可能です。胎児の開発のさまざまな段階で注射を実行する可能性を提供しています安全性と遺伝子の転送の効率を調査実験の大きな可能性と発達の基本的な質問の調査だけでなく、.......
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開示事項
著者が明らかに何もありません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 手袋 | Cardinal Health | 2D73DP65 | |
| Adson Forceps w /歯 | ファインサイエンスツール | 11027-12 | |
| Adson Forceps w / o teeth | ファインサイエンスツール | 11006-12 | |
| 湾曲したハサミ | ファインサイエンスツール | 14075-11 | |
| 重いハサミ | ファインサイエンスツール | 14002-13 | |
| ニードルドライバー | ファインサイエンスツール | 12005-15 | |
| Vicryl 2.0 | Ethicon | JB945 | |
| トランスファーピペット | メドライン | GSI135010 | |
| コットンチップ アプリケーター | メドライン | MDS202000 | |
| 50 mL コニカルチューブ | フィッシャー サイエンティフィック | 14-432-22 | |
| テープ | 3M | 1527-1 | |
| アイ潤滑剤 | メジャールブリフレッシュ | 0904-6488暖房 | |
| パッド | K&H | 3060 | |
| 実体顕微鏡 | ライカ | MZ16 | |
| インジェクター | 成重 | HI01PK01 | |
| ガラス毛細管 | キンブル | 71900-100 | |
| 縦型マイクロピペット プーラー | サッター装置 | P-30 | |
| マイクロ電極ベベラー | サッター装置 | BV-10 | |
| IM-300空気圧マイクロインジェクター | 成茂 | IM-300 | |
| インスリン注射器 | BD | ||
| フィルター | ジェネシーサイエンティフィック | 25-244 | |
| Compac5麻酔器 | VetEquip Compac5 | 901812 | |
| イソフルラン | Piramal Critical Care | NDC 66794-017-25 | |
| N2ガス | エアガス | NI 125 | |
| O2ガス | エアガス | OX 125 | |
| Ad-GFPウイルスベクター | ペンベクターコア | H5'.040.CMV.eGFP |
参考文献
- Loukogeorgakis, S., Flake, A. In utero stem cell and gene therapy: current status and future perspectives. European Journal of Pediatric Surgery. 24, 237-245 (2014).
- Vrecenak, J., Flake, A. In utero hematopoieti....
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再版と許可
