セノ治療薬同定のためのSA-β-ガラクトーシダーゼベーススクリーニングアッセイ

サマリー

細胞老化は、慢性加齢病理の発症における重要な因子である。老化細胞を標的とする治療薬の同定は、健康な老化を延長する約束を示す。ここでは、単一細胞における老化関連β-ガラクトシダーゼ活性の測定に基づくセノセラピューティクスの同定をスクリーニングするための新規アッセイを提示する。

要約

細胞老化は、健康寿命に悪影響を及ぼすと知られている老化の特徴の一つである。細胞培養において特異的に老化細胞を殺すことができる薬物は、セノリティックと呼ばくことができ、生体内の老化細胞の負担を軽減し、健康寿命を延ばすことができる。HSP90阻害剤、Bcl-2ファミリー阻害剤、ピペロングミン、FOXO4阻害ペプチドおよびダサチニブ/ケルセチンの組み合わせを含む複数のクラスのセノリティックスが同定されている。増加したリソソームpHでのSA-β-Galの検出は、老化細胞の検出のための最良の特徴付きマーカーの一つである。蛍光基質C12 FDGを用いて老化関連β-ガラクトシダーゼ(SA-β-Gal)活性のライブ細胞測定を、DNAインターカレートホエヒト色素を用いて全細胞数の決定と組み合わせることで、その可能性を開く。老化細胞の死化(セノリティクス)またはSA-β-Galおよび他の発せ子細胞(セノモルフィック)の他の現象を抑制することによって、全体的なSA-β-Gal活性を低下させるセノセラピューティクス薬のスクリーン。高含有量の蛍光画像取得および分析プラットフォームを使用することで、SA-β-Gal、細胞形態および細胞数に対する影響に対する薬物ライブラリーの迅速かつ高スループットスクリーニングが可能になります。

概要

細胞老化はレナード・ヘイフリックとポール・ムーアヘッドによって初めて説明され、正常細胞は培^養1で増殖する能力が限られていることを示した。老化細胞は、栄養素、成長因子および接触阻害の欠如にもかかわらず増殖に失敗するが、代謝^活性2のままである。この現象は複製性老化として知られており、主にテロメア短縮に起因し、少なくともヒト^細胞3で起こった。さらなる研究は、細胞が発癌性ストレス(腫瘍遺伝子誘発老化、OIS)、DNA損傷、細胞傷害薬、または照射(ストレス誘発老化、SIS)などの他の刺激に応答して老化を受けるように誘導できることを示しています^4,5,6.テロメア浸食を含むDNA損傷に対応して、細胞は老化、制御されていない細胞増殖を開始するか、損傷を修復できない場合はアポトーシスを受ける。この場合、細胞老化は腫瘍抑制的な方法2で作用するとして有益であると思^われる。対照的に、老化はDNA損傷を含む細胞損傷の蓄積による老化と共に増加する。老化細胞はサイトカイン、メタロプロテイナーゼおよび成長因子を分泌することができるので、老化関連分泌表現型(SASP)と呼ばれる、この加齢依....

プロトコル

動物の使用は、スクリプスフロリダ機関動物ケアと使用委員会によって承認されました.

1. 老化マウス胚性線維芽細胞(MEF)の生成 – 12-15日

1. 前述^の33日に胎児13日目(E13)で妊娠中の雌マウスから野生型およびErcc1-/-MEFを分離する。
   注:以下のすべてのステップは、無菌条件下で組織培養フード内で行われ、滅菌器具を使用しています。
2. 胚の頭を目の上に切除する。
3. 赤い組織(心臓と肝臓)を取り除き、必要に応じてジェノタイピングに使用します。
4. ダルベッコの改変イーグルミディアム(DMEM)とハムのF10の1:1混合物の500 mLを10%の胎児ウシ血清、1x非必須アミノ酸、ペニシリン、ストレプトマイシンを成長培地として準備し、使用前に37°Cまで約15分間温めます。成長培地を4°Cに保存します。
5. 胚の残りの部分を0.25%トリプシン/EDTAで10分間インキュベートします。
6. 胚を1mmの部分にミンチし、ティッシュを上下に数回ピペットする。
7. 直径10cmの細胞培養板につき1個の胚の増殖培地およびプレート組織の10mLを添加する(経積0)。
8. 37 °C、3% O 2、5% CO₂で細胞を培養します。....

結果

SA-β-Gal活性は、複製的な疲労、遺伝子毒性および酸化ストレスから、発癌活性化23、25、38まで様々な方法で老化するように誘導される細胞において検出することができる。Ercc1-欠損マウス胚線維芽細胞を用いた現行モデルでは、ノルモキシック増殖条件(20%O2)は、それらをいくつかの通路で培養した後に細胞老化を誘導するのに十分であった。野生型MEFも老化を受けるが、20%O₂で追加の通路を必要とする。図1は、Ercc1-欠損マウス胚からの一次MEF細胞の単離から始まり、酸化ストレスによる細胞老化の誘導に始まり、最後に顕微鏡データの分析に始まるスクリーニングアッセイのワークフローを示す。高含有蛍光顕微鏡で得られる。

ディスカッション

SA-β-Galは、Dimriらによって最初に発見された細胞老化のための明確に定義されたバイオマーカーである。(1995)老化したヒト線維芽細胞が増殖細胞と比較してpH6²³でアッセイした場合のSA-β-Galの活性を増加させたことを示す。一方、SA-β-Galに対するインビトロおよびインビボアッセイは、異なる細胞型および組織25、39、40に対して確立されている。このプロトコルに記載の生細胞中のSA-β-Galを測定する蛍光ベースの単細胞法は、細胞老化に影響を与える薬物に対する優れた一次スクリーニングツール^{である17。}しかし、SA-β-Galは老化細胞検出のための最も便利なマーカーの一つと考えられているが、細胞周期レギュレータp16^Ink4Aおよびp21⁴¹の検出のよう.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
DMEMの	コーニング	10-013-CV	ミディアム
ハムズ F10	ギブコ	12390-035	ミディアム
ウシ胎児血清	組織培養 生物製剤	101	血清
1x 非必須アミノ酸	コーニング	25-025-Cl	アミノ酸
バフィロマイシン A1	シグマ	B1793	リソソーム阻害剤
C12FDG	セタレバイオテック	7188	b-Gal基質
ヘキスト33342	ライフテクノロジー	ズH1399DNA	インターカレーション剤
17DMAG	セレックケミカルLLC50843		HSP90阻害剤
InCell6000細胞イメージングシステムGE	ヘルスケア		ハイコンテントイメージングシステム