Method Article

超常磁性鉄酸化物ナノプローブの合成、特性解析、応用による肺外結核検出

DOI:

10.3791/58227

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February 16th, 2020

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1Department of Pulmonary and Critical Care Medicine, Taipei Medical University-Shuang Ho Hospital, 2Department of Research and Department of Dentistry, Taipei Medical University / Shuang-Ho Hospital, 3Department of Pathology, Taipei Medical University, 4Department of Urology, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 5McLean Imaging Center, McLean Hospital/Harvard Medical School, 6Department of Physical Medicine and Rehabilitation, School of Medicine, College of Medicine, Taipei Medical University, 7Department of Medicine, Mackay Medical College, 8Department of Biological Science and Technology, National Chiao Tung University, 9Graduate Institute of Clinical Medicine, Taipei Medical University

In This Article

Summary

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結核菌抗原の血清学的診断試験を改善するために、肺外結核を検出する超常磁性鉄ナノプローブを開発しました。

Abstract

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超常磁性鉄酸化物(SPIO)ナノ粒子と結核菌表面抗体(MtbsAb)を含む分子イメージングプローブを合成し、肺外結核(ETB)のイメージング感度を高めた。SPIOナノプローブを合成し、MtbsAbと共役した。精製されたスピオ・ムトブアブナノプローブをTEMおよびNMRを用いて特徴付けた。プローブの標的化能を決定するために、SPIO-MtbsAbナノプローブをインキュベートしたインビトロイメージングアッセイ用に、Mtb接種マウスに注入し、磁気共鳴(MR)を用いたインビボ検査を行った。Mtb細胞およびTHP1細胞の磁気共鳴画像(MRI)のコントラスト増強減少は、SPIO-MtbsAbナノプローブ濃度に比例することを示した。Mtb感染マウスへの静脈内SPIO-MtbsAbナノプローブ注射の30分後、肉芽腫部位のシグナル強度は、PBS注射を受けたマウスと比較してT2加重MR画像で14倍増加した。MtbsAbナノプローブは、ETB検出のための新しいモダリティとして使用することができます。

Introduction

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世界的に、肺外結核(ETB)は結核(TB)のかなりの割合を表す。それにもかかわらず、ETB診断は、その陰湿な臨床プレゼンテーションと診断テストのパフォーマンスの低下のためにしばしば見逃されたり遅れたりします。偽りの結果は、酸速いバチルに対する痰の塗抹標本、組織病理学上の肉芽腫組織の欠如、または培養性結核(Mtb)の欠乏を含む。典型的な症例に比べて、ETBは頻繁に起こりにくく、Mtbバチルの解放をほとんど伴う。さらに、通常は、リンパ節、胸膜、および骨関節領域1などのアクセスが困難な部位で局在化している。従って、細菌学的確認を危険で困難にする適切な臨床検体を得るための侵襲的な手順は、2、3、4に必須である。

ETBの市販の抗体検出テストは、その広い範囲の感度(0.00-1.00)と特異性(0.59-1.00)を組み合わせたすべての肺外部位に対して、臨床検出にとって信頼性が低い。インターフェロンγ、培養濾液タンパク質(CFP)、および初期分泌抗原標的(ESAT)の酵素結合免疫スポット(ELISPOT)アッセイは、潜在的および活性な結核を診断するために使用されている。しかし

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Protocol

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動物実験に関するすべてのプロトコルは、国立実験動物の管理および使用に関する衛生ガイドライン(第8版、2011)に従って、実験動物の繁殖のための標準的な操作手順に従い、によって承認されています制度的な動物のケアと使用委員会。

1. SPIOナノ粒子合成

  1. デキストランコーティングされた酸化鉄磁性ナノ粒子を調製するには、デキストランT-40(5mL;50%w/w)と水性FeCl3×6H2O(0.45 g;2.77 mmol)およびFeCl2×4H2O(0.32 g;2.52 mmol)溶液を室温で激しく攪拌する。
  2. NH4OH (10 mL; 7.5% v/v) を迅速に追加します。
  3. さらに1時間黒懸濁液をかき混ぜます;その後、17,300 x gで10分間遠心分離し、凝集物を取り除く。
  4. ゲル濾過クロマトグラフィー20によって、結合されていないデキストランT-40から最終的なSPIO製品を分離します。
  5. 反応混合物(総体積=5 mL)を2.5cm×33cmカラムにロードし、pH 7.0で0.1M NaAcetateと0.15M NaClを含む緩衝液を用いて溶出させます。
  6. 精製デキストランコーティ....

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Results

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SPIO-MtbsAbナノプローブ合成と特性評価
SPIOナノ粒子は、MtbsAbと共役するように設計された。SPIOナノ粒子の表面上で安定化されたデキストランをエピクロロヒドリンにより架橋した。SPIOナノ粒子は、その後EDBEと組み込まれ、デキストラン末端で一次アミン官能基を活性化した。その後、SAを共役してSPIO-EDBE-SAを形成した。カップリング剤の存在下で、SPIO-EDBE-SAを用いたMtbsAbのコンジュゲーションを通して最終ステップで形成されたSPIO-MtbsAbナノプローブ。SPIO-MtbsAbナノプローブのTEM画像(図1)は、SPIO-MtbsAbナノプローブが良好に分散した外観を持っていたことを示しています。SPIO-MtbsAbナノプローブコアの平均サイズは3.8±0.4nm(200粒子計算)であった。

水溶液中で、緩和率値r1およびr2は、ナノプローブの23±3およ.......

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Discussion

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関連する研究と同様に、SPIO-MtbsAbナノプローブに関する我々の知見は、Mtb27,28に対して有意な特異性を示した。皮下Mtb肉芽腫は、マウスモデルにおいて結核注射の1ヶ月後に発見された。典型的な結核肉芽腫性の細胞学の所見は、リンパ球浸潤、上皮性マクロファージの存在、および新血管新生を含んでいた。酸速いバチル菌を結核病変に散乱し、MtbsAb免疫賦菌所見を裏付けた。これは、Mtb表面抗原とMtbsAbとの間の免疫学的反応を示した。ベルリンブルーはMtbsAbと同じ領域を強調し、酸速いMtbとの結合のためのプローブの特異性を裏付けました。

特に、Mtbおよび単球THP1細胞に対するMRIに対する陰性のコントラスト増強の程度は、SPIO-MtbsAbナノプローブ濃度に比例していた。Mtb肉芽腫を有するマウスをSPIO-MtbsAbナノプローブを投与した場合、肉芽腫部位での14倍のシグナル低下が、PBS注射を伴う対向部位と比較してT2加重MR画像に注目された。これ.......

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Disclosures

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著者の誰も、この研究で調べた材料に独自の関心を持っていません。

Acknowledgements

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著者らは、台湾経済省(NSC-101-2120-M-038-001、MOST 104-2622-B-038 -007、MOST 105-2622-B-038-004)からの資金援助に感謝しています。この原稿はウォレス・アカデミック・エディット編集編集によって編集されました。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
(ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ) トリピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロリン酸Sigma-Aldrich
1-ヒドロキシベンゾトリアゾールSigma-Aldrich
デキストラン(T-40)GE Healthcare Bio-sciences AB
epichlorohydrin, 2,2'-(エチレンジオキシ)ビス(エチルアミン)Sigma-Aldrich
塩化第二鉄六水和物フルーカ
第一鉄四水和物ーカ
ヒト単球THP-1
M.ボビスBCGパスツールMérieuxConnaughtひずみ;ImmuCyst Aventis
MRIGEメディカルシステム3.0-T、Signa
NH4OHFluka
NMRリラクソメーターBrukerNMS-120 Minispec
Sephacryl S-300GE Healthcare Bio-sciences AB
Sephadex G-25GE Healthcare Bio-sciences AB
SPECTRUM 分子多孔質膜チューブ、12,000 -14,000 MW カットオフSpectrum Laboratories Inc
TB 表面抗体 - ポリクローナル抗体 - MtbAcris Antibodies GmbHBP2027
透過型電子顕微鏡JEOLJEM-2000 EX II
塩化フル

References

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  1. Small, P. M., et al. Treatment of tuberculosis in patients with advanced human immunodeficiency virus infection. New England Journal of Medicine. 324, 289-294 (1991).
  2. Alvarez, S., McCabe, W. R. Extrapulmon....

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