方法論記事

患者の生体流体における腫瘍関連循環DNAの検出とモニタリング

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DOI:

10.3791/59721

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2019年6月8日

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1Center for Genetic Medicine, Children's National Health System, 2Institute for Biomedical Sciences, The George Washington University School of Medicine and Health Sciences, 3Dana-Farber Cancer Institute, 4Department of Neurology, University of California San Francisco, 5DIPG Centre of Expertise Zurich, Universitats-Kinderspital Zurich

この記事について

サマリー

ここでは、患者の生体液(生体流体)に存在する循環DNAにおける腫瘍体細胞変異を検出するプロトコルを提示する。当社の液滴デジタルポリメラーゼ連鎖反応(dPCR)ベースの方法は、腫瘍変異アレーリン周波数(MAF)の定量化を可能にし、腫瘍応答の診断および時間的モニタリングに最小限に侵襲的な補体を促進する。

要約

前頭部および繰り返し外科組織サンプリングに関連する合併症は、治療に対する腫瘍応答の分子サブ分類および時間的モニタリングが可能な最小限に侵襲的なプラットフォームの必要性を提示する。ここでは、患者の生体流体で容易に利用できる細胞外DNA(cfDNA)における腫瘍体細胞変異の検出のためのdPCRベースの方法について説明する。各アッセイでテストできる変異の数は限られていますが、この方法は高いレベルの感度と特異性を提供します。MAFによって計算された突然変異の豊富さのモニタリングは、治療に対する腫瘍応答の評価を可能にし、それによって放射線画像に非常に必要なサプリメントを提供する。

概要

分子分析のための腫瘍組織の利用可能性の限界のために、血漿、血清および脳脊髄液(CSF)を含む患者の生体流体における腫瘍体細胞変異を検出することができる高感度な方法の開発の必要性がある。.例えば、小児拡散中線神経膠腫(DMG)は、その神経解剖学的位置に起因する課題を提示する。過去10年間にわたり、DMG組織標本の分子プロファイリングは、この腫瘍タイプ1のドライバ変異を明らかにし、変異の空間的および時間的な不均一性を明らかにし、疾患内の患者を特徴付けるのに必要な生検を行った。サブグループと分子標的治療の促進2.したがって、臨床試験は、事前診断3、4、5、6で腫瘍分子プロファイリングのための外科生検を統合することを提唱する。治療中、DMGにおける治療応答のモニタリングはMRIに限られており、小さな変化や腫瘍ゲノムの進化を検出する感受性を欠いている。MRIはまた、疑似進行を検出する傾向があり、画像化上の真の進行を模倣し、腫瘍応答7の誤った解釈を模倣する腫瘍の部位における一過性炎症7。したがって、DMGは、腫瘍変異を検出し、臨床応答を監視する代替的で最小限に侵襲的な手段の必要性が高い腫瘍型を表す。これらのニーズに対応するために、中線神経膠腫8の小児の血漿、血清およびCSFからのcfDNAにおける腫瘍変異を検出し、定量するためのプロトコルを開発し、最適化した。小児期のDMGがしばしばあることを考えると(>80%)ヒストン変異体H3.1(H3.1K27M、症例の20%)またはH3.3(H3.3K27M、症例の60%)の位置にある体性リジン-メチオニン変異を抱えている1、これらおよび他の変異はDMG(すなわち、ACVR1、PIK3R1)に対して特徴的であった。cfDNA8を用いた変異対立遺伝子定量このアッセイは、配列特異的プライマーおよびプローブを使用して他の腫瘍タイプのホットスポット変異を検出するように調整することができる。このアプローチの多様性はcfDNAベースの診断用具および治療的モニタリングの統合から利益を得るさまざまな癌に適用可能にする。

cfDNAの低ア列周波数変異を敏感に検出するために、液滴デジタルPCR(dPCR)ベースのアプローチを採用しています。この方法では、PCR反応混合物は、dPCRプラットフォーム(例えば、RainDance)を使用して理論上最大1,000万液滴に分割され、PCR当たり7〜900万滴が実験的によく見られる。サンプルのパーティショニングの度合いが高いため、各液滴には、せいぜい1~2個のDNA分子しか存在できません。PCR増幅および配列特異的蛍光プローブハイブリダイゼーションは、数百万の反応が起こるように、各液滴で起こりうる。これは感受性を最大にし、そうでなければ野生型DNAの背景に対して検出されないかもしれないまれな変異性ア列の検出を可能にする。ロックされた核酸(LNA)プローブの利用は、不一致のハイブリダイゼーションを制限し、正確な変異検出9、10、11をサポートすることにより、アッセイの特異性を高めます。ここでは、サンプル処理、cfDNA抽出、標的アレルのプリアンプ化、dPCRおよびデータ解析の方法について説明します。

プロトコル

ここに記載されているすべての方法は、カリフォルニア大学サンフランシスコ校(カリフォルニア州サンフランシスコ)の機関審査委員会によって承認されています。IRB #14-13895)と子供の国民保健システム(ワシントンD.C.;IRB #1339)検体は、患者または患者の保護者からインフォームド・コンセントを得た後に収集され、研究された。

1. 生物標本の採取と保管に関するIRBプロトコルに従った患者の同意

  1. 各患者または患者の保護者から書面による同意を得た後、臨床試験に参加したり、それぞれの機関レビュー委員会によって承認されたバイオレポジトリに関する書面による同意を得た後に患者サンプルを収集します。
    1. 本研究に含まれる患者は、脳腫瘍と放射線で診断された。除外基準は使用されませんでした。検体は、患者または患者の保護者からインフォームド・コンセントを得た後に収集され、研究された。

2. 血漿または血清の採取と分離

  1. 採血管に10.0mLの引き込みで血液サンプルを採取する。血漿用の血液を採取する場合は、K2-またはK3-EDTAチューブ、ヘパリンまたはcfDNA採血管を使用してください。血清用の血液を採取する場合は、血栓活性化剤とゲルを含むゲルバリアチューブを使用して血清を分離します。
    注:反復実験を可能にするためには10 mLが推奨されますが、最低でも3mLで十分です。
  2. 採取管を慎重に10回反転させ、血液サンプルを回収管試薬と混合します。
  3. 血清を室温で30分間採取して血液を凝固させる血液サンプルを残します。血漿を得るために血液を処理する場合は、直ちにステップ2.4に進みます。
    注:プラズマ用に処理されるサンプルは、遠心分離の前に最大2時間氷上に保持され得る。しかし、血液採取から処理への急速な移行は、cfDNAの劣化を最小限に抑えます。
  4. 遠心分離管は2,000 x gで、遠心分離機で15分間、4°Cに設定し、血漿または血清を白血球層と赤血球層から分離します。
  5. 白血球層(上部血漿/血清層とパックされた赤血球の下層との間に細い線を形成する)を邪魔しないように注意し、血漿/血清の最上層(透明、黄色、またはピンク色)を1mLのアリコートで均等にピペットする滅菌ポリプロピレンねじキャップクライオビアルに。
  6. 被験者識別番号、検体タイプ(血漿または血清)、および回収日を凍結物のラベルに記録します。
  7. 使用するまで-80°C冷凍庫に凍結液を保管してください。-80 °C冷凍庫が利用できない場合は、最大1週間-20°Cでサンプルを保管してください。

3. CSFの収集と処理

  1. シャント、腰椎穿刺、または手術からCSFを収集します。
    注:このような手順は、臨床医が必要と認めた場合にのみ行われるべきです。臨床使用に必要な余分なサンプルは、研究目的で使用することができます。
  2. 収集されたCSFの体積を測定し、その色(血まみれ、黄色、透明)を書き留める。
  3. 回収管を10,000 x gで遠心分離し、4°Cで10分間、細胞の破片をペレット化します。
  4. CSF上清を500μLアリコートで均等にポリプロピレンスクリューキャップクライオビアルに移します。
  5. 被験者識別番号、検体の種類、および標本収集の日付を、クライオビアルのラベルに記録します。使用するまで-80°Cで保管してください。

4. 液体試料からのcfDNAの抽出

  1. cfDNA抽出キットハンドブック12の指示に従って、cfDNA抽出プロトコルを実行します。
    1. 10%の漂白剤および70%のエタノールでベンチスペースおよび装置をきれいにする。
      注:PCRフードの使用、手袋の定期的な交換、10%の漂白剤と70%のエタノールを備えたベンチスペースと機器の頻繁な除染は、サンプル汚染を避けるために重要です。
    2. 試薬のアリコート(例えば、洗浄バッファー)を抽出キットから準備して、クロスコンタミネーションを避けます。
  2. 抽出を開始する前に氷上の患者サンプルを解凍する。プラズマ/血清の場合は、サンプルの1 mLアリコートを解凍します。CSFの場合は、サンプルの500μLアリコートを解凍します。
    注:抽出プロトコルのLysisステップ(4.5-4.8)は血漿/血清とCSFの間で異なりますが、ステップ4.9以降では、プロトコルは両方のタイプの生体流体で同一です。
  3. リシス工程(4.6)中に使用するために、加熱ブロックを60°Cに設定します。
  4. 15 mLチューブにライシスバッファーおよびキャリアRNA混合物を調べ、5.6μLのキャリアRNAと0.9mLのライシスバッファーをサンプル12当たり添加する。
  5. 血漿/血清の場合、100 μLのタンパク質ナーゼK、1mLのサンプル、および0.8 mLのリシスバッファー/キャリアRNA混合物を標識された2.0 mLチューブに加えます。高速12で30sのパルス渦によって混合する。
    1. CSFの場合は、125 μL のタンパク質ナーゼ K、サンプルの 500 μL、1 mL のリシス バッファー/キャリア RNA 混合物、および 250 μL 組織リシス バッファーを 2.0 mL チューブに追加します。1xリン酸緩衝生理食べ物(PBS)の125 μLを加えることによって、2 mLまでの完全な容積を持って来なさい。高速12で30sのパルス渦によって混合する。
  6. 加熱ブロック12で60°Cで30分間サンプルをインキュベートする。
  7. 加熱ブロックからサンプルを取り出し、温度を56°Cに下げます。サンプルをベンチに戻し、ライサートを新しいラベル付き15 mLチューブに移します。
  8. 血漿/血清の場合、パルス渦12によって30sの核酸結合バッファーとミックスの1.8 mLを追加する。
    1. CSFの場合は、3.6mLの核酸結合バッファーを追加し、パルス渦12で30sに混合する。
  9. 氷12で5分間サンプルをインキュベートする。
  10. カラムを真空コネクタに挿入します。列を開き、20 mL チューブ エクステンダーを列12に挿入します。
  11. チューブエクステンダーの底部に直接15 mLチューブの内容物をピペットし、チューブエクステンダーの壁に液滴を残さないようにします。
  12. 真空コネクタのスイッチを閉じた状態で、真空ポンプをオンにします。圧力が900 mbarに構築されたら、真空コネクタのバルブを開きます。これで、サンプルが列を通過します。
  13. すべてのリセートがカラムから排出されたら、ポンプをオフにし、圧力勾配を緩和し、真空コネクタにトラップドアを開きます。圧力が0mbarに達したら、真空コネクタとトラップドアのバルブを閉じます。
  14. 20 mLチューブエクステンダーを取り外し、サンプルをクロス汚染する可能性があるため、隣接するカラムの上に1つのカラムのエクステンダーを通過しないように注意してください。チューブエクステンダーを廃棄します。
  15. 列12に最初の洗浄バッファーの600 μLを加えます。
  16. チューブの蓋を開いたままにして、真空ポンプをオンにします。圧力計が900mbarに達し、真空コネクタのスイッチを開いた位置に回し、洗浄バッファをカラムに引き出します。
  17. 真空ポンプをオフにし、トラップドアを開けて圧力を解放し、圧力を0mbarに緩和します。真空コネクタのバルブを閉じた位置に回します。
  18. カラムに750 μLの2番目の洗浄バッファーを追加し、手順を繰り返します 4.16-4.1712.
  19. カラムにMBグレードのエタノールの750 μLを追加し、手順を繰り返します 4.16-4.1712.
  20. カラムの蓋を閉じ、新しい2.0 mLコレクションチューブ内にカラムを入れます。真空コネクタ12を廃棄する。
  21. 室温12で3分間20,000 x gのカラムでチューブを遠心分離します。
  22. カラムを新しいコレクションチューブに入れ、チューブの蓋を開けます。上に実験室のティッシュを置き、10分12のために56 °Cでインキュベートする。
  23. カラムをクリーンな1.5 mL PCRクリーンチューブに入れ、溶出バッファー(または分子生物学グレードH2O(MBH2O))のピペット100 μLをカラムの中央に直接入れます。ピペット先端でカラムに触れないでください。蓋を閉め、室温で3分間放置します。
  24. 室温で20,000 x gの遠心分離機を1分間、cfDNA12を溶出させる。
  25. 溶出物をカラムに戻し、室温で3分間インキュベートします。
  26. (メーカーの推奨に従って)収率を上げるため、cfDNAを2回溶出させるために、1分間フルスピードで遠心分離を繰り返します。
  27. cfDNAをラベル付きDNase/RNaseフリーPCRクリーンチューブに4°Cで保管するか、ステップ5に直接進みます。

5. cfDNAの真空濃度

  1. 真空濃縮器のホルダーに、eluted cfDNAを含むチューブを挿入し、バランスを取ります。チューブのふたを開きます。真空濃縮器の温度を23°Cに設定します。
  2. 真空濃縮器をオンにし、蒸気トラップをオンにします。遠心分離機サンプルは40分間、または10.5-11 μLの最終容積に達するまでです。
    1. 体積が10.5 μL未満の場合は、DNA懸濁液バッファーまたはMB H2 Oを追加して、最終的な体積10.5 μLに達します。
  3. 残留DNA断片を除去するために、チューブの壁に沿って完全なボリュームをピペット。
  4. 簡単に遠心分離機の上のサンプルを遠心分離し、チューブの壁に液滴を収集します。
  5. 予備増幅工程(ステップ8)に直接進むか、4°Cでサンプルを保存します。
    1. 実験室用フィルムにチューブのふたを巻き付け、後で使用するために保管する場合は汚染を避けてください。

6. プライマーとプローブの設計と準備

  1. 目的のターゲットに対して、前方および逆プライマー、およびワイルドタイプおよび変異型 LNA プローブを設計します。商業的に凍結乾燥プライマーおよびプローブを発注する(材料の表を参照)。
    注:H3F3A p.K27Mおよび小児中線神経膠腫に対する他の標的変異を標的とするプライマーおよびプローブの配列は、パンジタラトナら2018 8の補足表3に見出すことができる。
  2. 凍結乾燥プライマーとプローブを開く前に、チューブを簡単に遠心分離します。製品仕様シートに記載されているように、適切な量のDNA懸濁液バッファーまたはMB H2Oを添加し、凍結乾燥プライマーおよびプローブを100μMの濃度に再懸濁させる。
  3. 穏やかに渦、ピペット上下に数回、卓上遠心分離機を使用してプライマーとプローブを混合し、簡単に遠心分離機を使用します。
  4. DNA懸濁液バッファーまたは MB H2O の 90 μL に 10 μM ストックの 10 μL を加えて、プライマーおよびプローブの 10 μM アリコートを調べ取ります。
  5. 前方および逆プライマーの1 μMアリコート(プリアンプ化に使用)を調べ、10 μMプライマーの10μLをDNA懸濁液バッファーまたはMB H2Oの90 μLに加えて調べます。
  6. プライマーとプローブを気密性の高い暗い容器に4°Cに保管してください。実験室用フィルムを蓋の周りに巻いて汚染を防ぐと、光にさらされるのを避けるためにアルミホイルでプローブを覆います。定期的に使用されていない場合は、-20°Cでプローブを保管して長期保存してください。

7. ポジティブコントロールの選択

  1. 既知のDNA濃度を有する腫瘍組織ゲノムDNA(gDNA)サンプルを選択し、これは正の対照として使用される既知のアジェリル周波数で目的の変異を収容する。
    1. 前増幅工程で0.025ngの陽性対照腫瘍組織DNAを使用する(ステップ8)。
      注:このDNA入力は、必要なサンプルの量を最小限に抑えながら、dPCR上で強い陽性シグナルを提供します(H3F3A p.K27M変異8を収容する腫瘍組織gDNAの連続希釈を行うことによって決定されます)。

8. ターゲットアレルの事前増幅

注:プリアンプ化プロトコルは、ジャクソンら、201613.

  1. 10%の漂白剤および70%のエタノールでベンチスペースおよび装置をきれいにする。
  2. 1 μM前方およびリバースプライマー、cfDNAサンプル、gDNA陽性コントロール、およびDNAポリメラーゼマスターミックスを取得し、氷上にセットします。
  3. シングルプレックスまたは多重プリアンプ化のいずれかについて、所望のcfDNAサンプル数と陽性制御をプリ増幅するために必要な試薬の量を次のように計算します。
    1. シングルプレックスプリアンプ化(目的の単一変異に対してワイルドタイプおよび変異アレルをプリ増幅する)については、DNAポリメラーゼマスターミックスの17.5 μLを加えてPCR反応混合物を調べ、サンプル13当たり3.5μLの前方プライマーとリバースプライマー(100 nM)を調べます。
    2. 多重前増幅(目的の2つの変異に対して2組のワイルドタイプと変異対立遺伝子をプリ増幅する)の場合、DNAポリメラーゼマスターミックスの17.5 μLとサンプルあたりのフォワードおよびリバースプライマー(50 nM)の各セットの1.75 μLを加えることによってPCR反応混合物を調作する13.
      注:サンプル数に十分なPCR反応混合物を準備し、ピペッティングエラーを考慮して10%余分にします。
  4. 8ウェルPCRストリップチューブ13の各ウェルにPCR反応混合物の24.5 μLを分配する。
  5. 10.5 μLのDNAサンプルを適切なウェルに分配し、総反応量を35 μL13にします。ミックスする10回、フルボリュームをゆっくりとピペット。
  6. 98 °CでPCR増幅を3分間行います。10 sのための98 °Cの9サイクル、3分のための焼化温度、30sのための72 °C;そして2分13のための72 °Cの延長。
  7. 予備増幅された製品の全容積を標識されたDNase/RNaseフリーPCRクリーンチューブに移し、140 μL TE DNA懸濁液バッファー(pH 8.0)13で希釈します。
  8. 実験室用フィルムでチューブのふたを包みます。予お増幅製品を4°Cに保管してください。長期保存のため、-20°Cで保管してください。

9. dPCRを用いた標的DNAの検出と定量

  1. 10%の漂白剤および70%のエタノールでベンチスペースおよび装置をきれいにする。
  2. 10 μMプライマーとプローブ、ジェノタイピングマスターミックス、および氷上のDNAサンプルを設定します。液滴安定化油を室温で保管してください。
  3. 穏やかに渦と簡単に液滴安定化油を除くすべての試薬を遠心分離します。
  4. 液滴発生器に取り付けられた圧縮窒素ガスボンベと定量計(材料表)が90psiに設定されていることを確認します。
  5. ドロップ生成インストゥルメントとインストゥルメントソフトウェアを使用してコンピュータの電源を入れます。ソフトウェアを起動し、[初期化の開始] をクリックします。
    1. 1 週間以上使用されていない場合は、ドロップ生成装置に高圧フラッシュを実行します。
  6. PCRストリップチューブの8ウェルに対してdPCR反応混合物を準備し、10%余分に、ジェノタイピングマスターミックスの220 μL、10 μMワイルドタイプと変異プローブの各8.8 μL、10 μM前方および逆プライマーの39.6 μL、および17.6 μLの液滴安定化オイル14μLを追加します。>.
  7. dPCR反応混合物を10~20回上下にピペッティングしてゆっくりと混合します。液滴安定化油を反応混合物に添加した後は渦や遠心分離機を行わな。
  8. PCR 8ウェルストリップチューブを取得し、各ウェル14の底部に直接dPCR反応混合物の38 μLを分配する。きれいなピペットの先端で任意の気泡を削除します。
    注:連動または密に詰め込まれたPCRストリップチューブは、静電気電荷を引き起こし、dPCRデータを分析する際に合体およびノイズの多い信号を引き起こす可能性があります。これを避けるために、アリコートストリップチューブを別々のバイオハザードバッグに入れ、袋の過剰梱包を避け、チューブが一緒にこすれないようにしてください。
  9. PCRストリップチューブの適切なウェルに12 μLのプリアンプ化されたDNAサンプルを追加します。負のコントロールの場合は、MB H2O の 12 μL を追加します。
    注:複製ウェルでcfDNAサンプルを分析します。CSFの場合は、少なくとも複製して分析し、プラズマ/血清については各サンプルを三極化で分析します。
  10. 反応混合物をDNAサンプルと混合するために、10回上下にフルボリュームをゆっくりとピペットします。
  11. 新しい液滴発生インストルメントチップを入手し、PCRストリップチューブのウェル1~8からチップ内の対応するチャンネルA-Hにフルボリュームをピペットします。ピペット先端でチャンネルの底部に触れないようにしてください。
  12. 新しいクリーンなPCRストリップチューブを入手し、液滴発生器に挿入します。インストゥルメントコンピュータ上のソフトウェアに液滴生成インストルメントチップIDをスキャンまたは手動で入力します。8 チャンネルごとに名前を入力します。[実行を開始]をクリックして、サンプルの液滴化を開始します。
  13. 液滴化が完了したら、PCRストリップチューブを取り外し、ストリップチューブキャップを適用します。
  14. ストリップチューブをサーマルサイクラーに移し、ウェルあたり80 μLの水を含む別のストリップチューブとバランスを取ります。
  15. 熱循環条件14を10分間95°Cにプログラムします。2つの温度の45サイクル:30sのための95 °Cおよび2分のためのアニーリング温度;98 °C 10 分;10°Cで保持します。
    1. ランプレートを0.5 °C/sに設定し、サンプル体積を80 μL14に設定します。
  16. サーマルサイクリングが完了したら、ストリップチューブを取り外し、定量計器に移します。PCRストリップキャップを取り外し、高速キャップに交換してください。
  17. 定量計器と接続されたコンピュータを計測器ソフトウェアでオンにします。計測器ソフトウェアを起動し、[実行のセットアップ]をクリックします。
  18. ストリップチューブを定量装置に入れます。
  19. 新しい定量計チップを取得し、スキャンするか、手動でチップIDを計測器に入力します。チップをマシンに挿入します。
  20. 金属シールドをチップの上に置き、器具の蓋を閉じます。
  21. コンピュータ ソフトウェアで、dPCR 実行の名前と 8 チャンネル (A-H) の名前を入力します。高速モード(高速キャップで使用する必要があります) を選択し、[開始] をクリックして定量化を開始します。
  22. 定量が完了したら、金属シールド(保存して再利用)を取り外し、PCRストリップチューブとチップを廃棄します。計測器コンピュータでは、実行ログに各実行の結果ファイルが含まれます。各サンプルの .fcs ファイルを使用して、アナリスト ソフトウェアを使用して分析します。

10. データ分析

  1. アナリスト ソフトウェアを起動し、.fcs ファイルを開いて生のスペクトル データを分析します。[解析ビュー] で、[そのまま]を選択します。[サンプル ビュー] で、各ボックスにチェック マークが表示されるように、8 つのサンプルの横にあるボックスをクリックします。ソフトウェアは、それぞれX軸とY軸に沿って変異体(FAM)とワイルドタイプ(HEX)の対向性の信号をプロットします。
  2. 計算されたマトリックス関数を使用して、製造元の指示15に従って、無傷の液滴のスペクトル補正を適用します。
  3. [軸オプション] の下で軸設定を調整します。X 軸を最小 0 と最大 30,000 に設定し、Y 軸を最小 -5,000 と最大 10,000 に設定します。液滴クラスターが識別された場合は、軸を調整してグラフ内の空き領域を減らします。
    注:変異型クラスターと野生型クラスターの位置は、使用されるプローブ、蛍色素およびその濃度によって異なります。
  4. 陽性コントロール腫瘍組織gDNAに対応するサンプルを選択して、負(原点に最も近いクラスター)、変異体(x軸に最も近いクラスター)、およびワイルドタイプ(Y軸に最も近いクラスター)ゲートを設定します。成功したアッセイでクラスターが明確かつ容易に識別されていることを確認します。
  5. 正のコントロール サンプルを右クリックし、選択したサンプルにすべての設定を適用するオプションをクリックして、すべてのサンプルに正のコントロールのゲート設定を適用します。
  6. グラフィカルビューで、[複数のサンプル]タブをクリックして、選択したすべてのサンプルのプロットを表示します。イメージを としてエクスポートします。TIF ファイル。
  7. 画面の左上にある[ワークスペース]タブで、[分析のエクスポート(csv)] を選択し、分析されたデータ ファイルを .csv ファイルとして保存します。
  8. スプレッドシート ソフトウェアで .csv ファイルを開き、各サンプルの負、ワイルドタイプ、および変異型の液滴数を表示します。ポアソン補正変異体液滴数をポアソン補正変異体の合計と、各サンプルのワイルドタイプ液滴数の合計で除算してMAFを計算します。
    注:ポアソン統計は、陽性液滴が標的DNAの1つ以上のコピーを含む可能性があるため、ポアソン補正カウントを使用して、陽性液滴を合計すると正確なカウント16を得ない可能性があります。

結果

図1は、DMGを有する2人の小児からの予め増幅された血漿(左上パネル)およびCSF(右上パネル)cfDNAにおけるH3F3A p.K27M変異の正常な検出に関する代表的な結果を示す。cfDNAサンプルを反復で分析したが、サンプルタイプごとに1つの代表的なグラフのみが示されている。dPCRプロットは、PCR当たり7〜900万滴(そのほとんどは標的DNAを含まない負の液滴)で、液滴生成が成功したことを示しています。PCRあたりの最小700万滴は、液滴化が成功したことを示し、700万未満はアッセイの失敗を示し、その場合、ユーザーはデータ分析を進めるべきではない。図 1は、それぞれ x 軸と Y 軸に沿った変異型クラスターとワイルドタイプ クラスターの明確な分離を示しています。堅牢な野生型クラスターは、テンプレートDNAが存在するため、cfDNA抽出が成功したことを示しています。変異クラスターは、プラズマおよびCSFサンプルに対してそれぞれ1.60%および39.92%のMAFを示し、変異の陽性検出を実証する。これらの患者に対して、dPCR結果は、腫瘍変異状態に従って、生検腫瘍組織8のゲノム解析によって確認される。陰性対照(左下パネル)は、0変異体および0野生型液滴を示し、PCR反応混合物の汚染が無かっていることを示す。陽性対照腫瘍組織gDNA(右下パネル)は、選択された特定の腫瘍試料に対する期待されるアレルギー周波数で検出されている変異を示す。

図2では、DMGを有する小児からの血漿cfDNAにおける目的の変異、H3F3A p.K27Mの検出に失敗した代表的な結果が示されている。 腫瘍組織8のゲノム解析により変異状態を確認した。2つの複製PCRウェルからの代表的な結果が示されている(トップパネル)。負の液滴を含む液滴の総数は、PCR当たり7〜900万個の間であり、液滴化が成功したことを示している。Y軸に沿ってプロットされた野生型クラスターは、血漿cfDNAに対してPCR当たり約7〜8,000個の野生型液滴を示し、cfDNA抽出に成功した(サンプル中に標的野生型DNAがあるので)。しかし、プラズマサンプルでは0つの変異液滴が検出されます。左下のパネルには、ワイルドタイプまたは変異液滴のない負のコントロール(MB H2O)が表示されます。そして右下のパネルは肯定的な突然変異の検出と陽性の制御前増幅腫瘍組織gDNA(0.025 ng)を示す。この図に示すように、血漿中の変異検出の欠如は、必ずしも患者が目的の変異に対して野生型であることを意味するわけではなく、偽陰性が8が生じる。場合によっては、先行生検で採取された血漿中に変異が見逃されると、後の時点で同じ患者から得られた血漿中で検出される。

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図 1: の検出に成功H3F3A中線神経膠腫の小児からの予め増幅された血漿およびCSF cfDNAにおけるp.K27M変異。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図 2: 目的の変異を抱えることを知っている患者からの予知血漿cfDNAサンプルの分析から得られた偽陰性結果、H3F3A腫瘍内のp.K27M。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

ここでは、患者の液体生検からcfDNAにおける腫瘍変異のア列周波数を検出・定量化する方法を紹介した。我々は、事前分析サンプル処理、cfDNA抽出、PCRアッセイ設計、データ分析など、この方法の成功のための重要なステップを強調します。使用するサンプル量を制限するために、cfDNAは1mLのプラズマから抽出されますが、CSFの500 μLのみが抽出されます。CSFから抽出する場合、製造業者の勧告に従って、1mLの尿からの抽出のためのプロトコル(cfDNA抽出キットハンドブック12に従って)が使用される。血漿とCSFの間に必要なサンプル体積の違いは、脳腫瘍を有する患者のCSFと比較して血漿中の腫瘍特異的cfDNAのレベルが低いためであり、変異検出のためにより大きなサンプル体積を必要とする8。サンプルが利用可能な場合、より高いDNA収率を生成するためにから1mL以上の血漿を抽出してもよい。しかし、小児患者の場合、放射線治療を受けているがん患者にとっては、血液採取などの簡単な手順でさえ、可能な限り使用される血液量を最小限に抑えることが重要です。プラズマの1 mLアリコートからの抽出は、アッセイを繰り返すことができるように複製抽出を可能にします(例えば、DNA抽出またはサンプル汚染の失敗の場合)。

厳密に必要でないサンプルの使用を減らすために、cfDNAは通常定量されません。しかし、プラズマとCSFでは、それぞれ0.2-2 ng/μLと0.6-13 ng/μLの間のcfDNA濃度の範囲を見出しました。cfDNAの量が少なく、腫瘍特異的変異性アレルが低周波で存在するという事実を考えると、dPCRに使用される同じプライマーを用いたプリ増幅工程は、サンプル中の標的DNAの量を大幅に増加させる必要がある。突然変異検出8.DNA懸濁液バッファーで増幅前の製品を希釈すると、技術的な反復に十分な量を提供し、真陽性の区別に役立ちます。変異液滴の数は少ない場合(例えば、血漿サンプル中の0~2変異液滴の間)、技術的な反復を含めることは、変異状態を解決するための鍵となります。一方のPCRウェルは0個の変異液滴を得ることができますが、他の2つは三量体で分析された単一のプラズマサンプルに対して1-2を得ることができます。したがって、反復を含めることで、突然変異状態を決定する際の精度が向上します。MAF は、反復値の平均として計算されます。

多重化プリ増幅(目的の2つの変異の前増幅ワイルドタイプおよび変異アレル)は、同じ開始材料を使用して2つの変異をテストするために使用することができるので、単一のサンプルの有用性を増加させる。重要なのは、ここで説明するように、多重プリ増幅産物は、dPCR中にシングルプレックスで分析できるため、より簡略化できます。ただし、プリアンプ化 PCR と dPCR の両方が多重化されてもよい。多重化の場合、プライマーとプローブの両方のセットに対して条件を最適化する必要があります:プライマーアニーリング温度はPCR増幅で一緒に実行するように類似する必要があり、プローブは(蛍光シグナルに基づいて)異なるクラスターを生成するように設計する必要があります。強度)。新しいプライマーとプローブのセットを検証する場合は、アニーリング温度勾配を実行して、製造元が提案する範囲に基づいて最適なアニーリング温度を決定します。患者cfDNA標本のプローブをテストする前に、異なる入力(すなわち、最大10ng)の合成DNA構築物および/または腫瘍組織gDNAを使用してそれらを検証します。

標的DNAへのプローブのハイブリダイゼーションにおけるより大きな特異性と減少したミスマッチを伴う変異性アレンの検出のために、ロックされた核酸(LNA)プローブが使用される。LNAは、リボースリング9の2'-酸素と4'-カーボンを接続するメチレンブリッジを持つ核酸アナログです。メチレンブリッジは、柔軟性を制限し、熱二重安定性を高め、DNA10、18を標的とするプローブハイブリダイゼーションの特異性を向上させる堅い二極構造に核酸をロックします。19.LNAプローブとテンプレートDNAの間に単一の塩基不一致が存在する場合、プローブとターゲット間の二重形成は不安定になります。そのため、LNAプローブはプローブ結合の特異性を向上させ、信号対雑音比11を高くする。非CNS病の小児患者からの血漿およびCSFの分析は、H3F3A p.K27Mを標的とするLNAプローブを用いて我々のアッセイの特異性を確立し、0.001%以下のアレール周波数が偽陽性であると判断した。8.GC含有量、アンプリコンサイズ、プローブレポーター染料、およびクエンチャーを含むプローブおよびプライマーの設計を最適化するための追加の考慮事項については、dPCR製造元ガイドライン14,17を参照してください。この方法は RainDance システムでの使用に最適化されていますが、プロトコルは他の dPCR プラットフォームでの使用に適しています。

ここで提示される方法は、cfDNAのまれな腫瘍変異を検出するための選択のプラットフォームであり続けるdPCRによって達成される高感度および標的濃縮から強さを引き出す。強力ですが、dPCRは単一のアッセイでテストできる変異の数に制限されています。dPCRに代わりは、多くの遺伝子にわたって複数の変異を検出し、単一のサンプルの有用性を高める次世代シーケンシング(NGS)です。NGSは、脳幹神経膠腫20を有する患者のCSFおよび血漿中の変異を検出できるが、現在、cfDNAにおける腫瘍変異の検出においてdPCRよりも感受性が低く、検出限界はPCRベースのアプローチ21の0.001%と比較して0.1〜10%MAFである。.dPCRはまたNGSより速いターンアラウンド時間を達成し、目的の突然変異の急速な検出を可能にする。PCRアプローチは、がんの種類にまたがって適用可能であり、ホットスポット変異およびメチル化cfDNA22を検出するために拡張することができる。

液体生検は確かにその幼児期であり、特定の疾患に合わせてさらなる開発が必要になります。腫瘍進化の文脈における腫瘍モニタリングは、高感度で新たな変異を検出できるプラットフォームが必要となる次の課題です。さらに、様々な生体分子(ペプチド、サイトカイン、RNA)を検出できるプラットフォームは、治療に対する腫瘍応答を評価し、パーソナライズされた臨床介入を進める上で非常に有益です。

開示事項

この原稿に記載されている方法は、ジャワド・ナザリアン&エシニ・パンディタラトナによる国際特許出願「がんバイオマーカーの検出方法」に含まれています。

謝辞

著者は、すべての患者とその家族の寛大さを認めしたいと思います。この研究は、スマッシング・クルミズ財団(ミドルバーグ、VA)、V財団(アトランタ、ジョージア州)、ガブリエラ・ミラー・キッズ・ファースト・データ・リソース・センター、小児国立臨床・翻訳科学研究所()5UL1TR001876-03)、ムセラ財団(ヒューレット、ニューヨーク)、マシューラーソン財団(フランクリンレイク、ニュージャージー州)、小児脳癌研究のためのライラビーン財団(シルバースプリング、MD)、小児脳腫瘍財団(ドイツタウン、MD)、小児脳腫瘍組織コンソーシアム(フィラデルフィア、PA)、および小児がん研究のためのラリー財団(アトランタ、ジョージア州)。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
10 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTA DNA 懸濁液バッファー (pH 8.0)TeknovaT0227
BD Vacutainer K2-EDTA 7.2 mg 採血チューブ (10 mL)Becton Dickinson Diagnostics367525血漿採取用
BD Vacutainer プラスチック血清チューブ、赤色 BD ヘモガード クロージャー付き (10 mL)クトン ディッキンソン ダイアグノスティック367895血清採取用
漂白剤一般ラボサプライヤー
バッファー ATLQiagen19076
無細胞 DNA 採血チューブStreck218961cfDNA 採血チューブ (オプション)
CentriVap コンセントレーターLabconco7810010
Forward PrimerIntegrated DNA Technologies, Inc.カスタムデザイン
MiniAmpサーマルサイクラーサーモフィッシャーサイエンティフィックA37834
分子生物学グレード無水エタノール(200プルーフ)一般的なラボサプライヤー
ミュータントプローブ統合DNAテクノロジーズ株式会社カスタムデザイン
PAXgene血液ccfDNAチューブPreAnalytiX768115cfDNA採血チューブ(オプション)
PCR 8ウェルストリップチューブキャップVWR10011-786
PCR 8ウェルストリップチューブAxygenPCR-0208-C
ピペット(p20、p200、p1000)一般ラボサプライヤー
ピペットフィルターチップ(p20、p200、p1000)一般的なラボサプライヤーQ5
ホットスタートハイファイ2xマスターミックスニューイングランドバイオラボ株式会社M0494S
QIAamp循環核酸ハンドブック QiagencfDNA抽出キットハンドブック(2013年版)
QIAamp Circulating Nucleic Acid KitQiagen55114cfDNA抽出キット(プロトコールステップ4) 
QIAamp MinEluteウイルススピンキットQiagen57704小さな(<または=200 µL) サンプル量
Qiavac 24 PlusQiagen19413QIAamp Circulating Nucleic Acids キットで使用するため
Raindance 消耗品キットBio-Rad20-04411液滴発生装置チップ、定量装置チップ、高速キャップを含む PCR ストリップキャップ、液滴安定化オイル
Raindance Sense 装置バイオ・ラッド定量装置 (プロトコールステップ9)
Raindanceソース機器Bio-Rad滴発生装置(プロトコールステップ9で使用)
RainDrop Analyst IIソフトウェアRainDance Technologiesアナリストデータ解析用ソフトウェア(プロトコールステップ10)
冷蔵蒸気トラップSavantRVT5105-115
Reverse PrimerIntegrated DNA Technologies, Inc.カスタムデザイン
Smartblock 2 mLEppendorf05 412 506
TaqMan Genotyping Master MixThermofisher Scientific4371353
Thermomixer CEppendorf14 285 562PM
WT ProbeIntegrated DNA Technologies, Inc.カスタムデザイン
ベス 液

参考文献

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