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方法論記事

GPCR-β-アレストリン1/2リアルタイムリビングシステムにおける相互作用をモニタリングし、創薬を加速

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DOI：

10.3791/59994

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2019年6月28日

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1Graduate School of Medicine, Korea University

この記事について

サマリー

GPCR-β-アレスチン相互作用は、GPCR創薬における新興分野である。このような生きたシステムの相互作用を監視するには、正確で正確で簡単に設定する方法が必要です。我々は、リアルタイム生細胞におけるGPCR-β-アレスチン相互作用を監視する構造補体アッセイを示し、あらゆるGPCRに拡張することができる。

要約

Gタンパク質結合受容体(GPCR)とβ-アレスチンとの相互作用は、非常に重要な生理学的意味を持つ重要なプロセスである。現在、β-アレスチンおよび他のサイトソールタンパク質との相互作用に対する新薬の特性評価は、特にGPCRバイアスアゴニズムの研究においてGPCR創薬の分野において非常に貴重である。ここでは、リアルタイムの生体系における受容体β-アレスチン相互作用を正確に監視する新規な構造補体アッセイの応用を示す。この方法は、単純で正確であり、目的の任意のGPCRに容易に拡張することができ、また、各ベクター系に存在する低発現プロモーターの存在による非特異的相互作用を克服するという利点を有する。この構造補体アッセイは、受容体β-アレスチン相互作用の正確かつ正確なモニタリングを可能にする重要な特徴を提供し、GPCR系の偏ったアゴニズムとGPCR c-terminus'リン酸化の研究に適しています。異なるGPCR-キナーゼ(GRK)と受容体β-アレスチン複合体を安定または不安定化させるアレチンの翻訳後修飾によって書かれたコード。

概要

GPPCは、市場における現在の薬剤の約35%の目標を表し、2、その薬理学の明確な理解は、新規治療薬3の開発において重要である。GPCR創薬における重要な側面の1つは、特に偏ったアゴニストの開発中に、受容体β-アレスチン相互作用4およびβ-アレチン相互作用に対する新規リガンドの特徴付けである。クラトリン5として.

β-アレスチン依存シグナル伝達は、双極性障害、大うつ病、統合失調症6などの神経障害において重要な役割を果たし、モルヒネ7などの一部の薬物においても重篤な副作用を有すると報告されている。

これらの相互作用を監視するために使用される現在の方法は、通常、研究におけるタンパク質の実際の内因性レベルを表すものではなく、場合によっては弱いシグナル、光漂白、およびGPCRに応じて8を設定することは技術的に困難である可能性があります。この新しい構造補体アッセイは、内因性の生理学的レベルを模倣するために低発現プロモーターベクターベクターを使用し、現在の方法9と比較して高い感度を提供する。このアプローチを用いて、ガラニン受容体β-アレスチン1/2およびβ-アレスチン2-クラトリン相互作用10を容易に特徴付けさせられた。この方法論は、β-アレスチンが主要な生理学的機能を果たすか、またはそのシグナル伝達がいくつかの疾患に関連する特定の関心のあるGPCRに広く使用することができる。

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プロトコル

1. プライマー設計戦略

  1. pBiT1.1-C [TK/LgBiT]、pBiT2.1-C[TK/SmBiT]、pBiT1.1-N[TK/LgBiT]、pBiT2.N[TK/LgBiT]ベクターに対象遺伝子を導入する設計プライマー。
  2. 図 111に示すように、マルチクローニング 部位を分割するフレーム内停止コドンの存在に起因する方向クローニングに必要な 2 つの固有の制限酵素の 1 つとして、これらの 3 つのサイトのうちの少なくとも 1 つを選択します。
  3. 表1に示すように、ヌクレオチド配列をプライマーに組み込み、表211に赤色で示すリンカー残渣をエンコードする。
  4. pBiT1.1-C [TK/LgBiT] および pBiT2.1-C [TK/SmBiT] ベクトルの場合、5 のプライマーに ATG コドンと強力なコザックコンセンサス シーケンス (GCCGCCACC) が含まれていることを確認します。
  5. pBiT1.1-N [TK/LgBiT] および pBiT2.1-N [TK/SmBiT] ベクトルの場合は、3/4 プライマーにストップ コドンが含まれていることを確認します。
    注:各ベクターは、非特異的な関連を最小限に抑え、実験アーティファクトを減少させるためにHSV-TKプロモーターを含有し、また、各ベクターは、細菌中のアンピシリン耐性のための発現カセットを有する。

2. PCR

  1. ステップ1から設計されたプライマーを使用して目的の遺伝子の挿入DNAを増幅するためにPCR反応を設定して実行する。変異を最小限に抑えるためには、高忠実度のDNAポリメラーゼを使用することが重要です。
  2. PCR反応の50 μLを調出すには、以下の順序で正確に使用してください。蒸留水の35.5 μL、10xポリメラーゼバッファーの5 μL、dNTP混合物の5 μL(各2.5 mM)、プラスミドテンプレートの1μL(200 ng/μL)、1.25 μLのフォワードおよびリバースプライマー(10 μM)、高忠実度ポリメラー(5 μL)を加えます。
  3. サーモサイクラーを用いて、以下のDNA増幅プログラムを設定する。
    1. 95°Cで5分間変性する。
    2. 次の熱サイクルを25回繰り返す:30sの場合は95°C、1分間60°C、増幅する1kbpあたり2分の72°C。
    3. 72 °Cで10分間最終延長を実行します。
    4. サーモサイクラー内の4°Cでサンプルを保持します。
      注:特に長い配列の増幅中に起こる点の突然変異を最小限に抑えるために、高忠実度のポリメラーゼを使用することを強くお勧めします。アンプリコンが長くなるにつれて、DNAの複製における精度の程度が低下する。PCR反応の場合、オリゴがDNAテンプレートと直接ハイブリダイズし、プライマーのすべての配列とハイブリダイズする領域の溶融温度に基づいてアニーリング温度を選択します。
  4. PCR製品精製
    1. PCR製品を、好み12のメーカーからキットを使用してPCR反応の残りの部分から分離する。PCR 製品は、制限消化の準備ができました。

3. DNA消化

  1. PCR産物消化については、以下のように50μLの消化反応を調出する。
    1. 1.5 mLチューブを使用して、蒸留水の12 μLを追加します。
    2. 両方の制限酵素との最適な互換性を持つ10倍バッファの5 μLを追加します。
    3. ステップ 2.4 から PCR 製品の 30 μL を追加
    4. 最後に、各制限酵素の1.5 μLを追加します。
    5. 渦で簡単に混合し、一晩37.5 °Cでインキュベートします。
  2. レシピエントプラスミド消化のために、次のように消化反応の50 μLを調調します。
    1. 1.5 mLチューブを使用して、蒸留水の23 μLを追加します。
    2. 両方の制限酵素との最適な互換性を持つ10倍バッファの5 μLを追加します。
    3. レシピエントプラスミドの15 μLを加えます(200 ng/μL)。
    4. 各制限酵素を1.5μL添加します。
    5. 渦で簡単に混合し、一晩37.5 °Cでインキュベートします。
      注:DNAアガロースゲル精製後に十分な材料を得るためには、3μgのレシピエントプラスミドを使用することが重要です。また、高いクローニング効率を得るために両方の酵素を使用して一晩DNA消化を残すことも関連しています。

4. DNAアガロースゲル精製とクローニング

  1. 消化されたDNAプラスミドを実行し、挿入し、対応するバンドをカットするために1%アガロースゲルを準備します。対応するベクターおよびインサートバンドが精製されると12、分光光度計を用いてDNA濃度を決定する。
  2. DNAライゲーションを行い、インサートをレシピエントプラスミドに融合させる。
  3. プラスミドベクターの50ngを含む全DNAの約100ngのライゲーション反応を調記する。
  4. 約1:3のレシピエントプラスミド挿入率を設定します。ベクトル挿入電卓13を使用して計算することができます。
  5. 負のコントロールを並列に設定します。例えば、挿入なしのレシピエントプラスミドDNAのライゲーションは、未消化または自己凝結性レシピエントプラスミドのどのくらいの背景が存在するかについての情報を提供する。

5. クローンの変換

  1. -80 °Cで冷凍庫からDH5α有能な細胞のチューブを置き、すぐに20分間氷の上に移します。
  2. その後、DH5α有能な細胞の55 μLを取り、ライゲーション反応の4 μLを追加し、チューブをフリックして45分間氷の上に保存することによって混合します。
  3. 42°Cで48°Cで温めた水浴にチューブを入れ、すぐに別の3分間氷の上にチューブを戻します。
  4. ルリアブロス(LB)培地の600μLを37.5°Cで温め、200rpmで1時間振ってインキュベートします。
  5. アンピシリン100μg/mLを含む寒天板に200μLを移し、液体で表面に穏やかに広がれ、ほとんどが吸収されます。
  6. 翌朝、コロニーを見るために一晩プレートをインキュベートします。インサートプレート上のレシピエントプラスミドは、レシピエントプラスミド単独プレートよりも有意に多くのコロニーを持っている必要があります。

6. 完成したプラスミドの単離

  1. 3-10個の細菌コロニーを選び、アンピシリン(100μg/mL)を含むLB培地の1mLに移し、6時間インキュベートします。
  2. 200 μLの細菌懸濁液を取り、ステップ6.1と同じ濃度のアンピシリンを含むLB培地の5 mLに移し、200rpmで振盪して37.5 °Cで一晩インキュベートする。
  3. ミニプレップDNAキット精製を用いて、製造元の指示14に従って一晩成長したLBの5mLを用いてミニプレップDNA精製を行う。
  4. 成功したライゲーションを識別するために、ステップ6.3から得られたDNAを最初のPCRの間にセクション2と同じプライマーを持つテンプレートとして使用してセクション2と同様にPCR反応を設定します。正のクローンは、対応するサイズのPCR製品を生成します。
  5. 陽性クローンの大きな準備DNA精製後、クローニング工程中に使用される酵素で精製DNA500ngの診断制限消化を行い、消化産物を1%アガロースゲルで実行します。ベクトルのサイズと新しいインサートのサイズの 2 つのバンドが必要です。
  6. 次のプライマーを使用してシーケンスを行ってコンストラクトシーケンスを確認します: Forward 5'- aaggtgacgcgtgtcccgaacaac-3' と逆 5'-gcatttttttttttcatctagttttttttatctagtttttttttttttttt-3'
    注:PCRを用いてDNAを複製する場合、高忠実度ポリメラーゼを使用する場合でも増幅中にエラーが発生する可能性が常にあるため、最終的な構造体を配列することは非常に重要です。

7. トランスフェクションとタンパク質発現

  1. 以前にポリL-リジンコーティングされた白い96ウェルプレートで、ダルベッコの改変イーグルの培地を使用して、トランスフェクションの1日前に2.5 x 104細胞で細胞播種を行い、胎児牛血清の10%、100 U/mLペニシリンG、および100g μ/mLストレプトマイシン。
  2. 60 の内側のウェルのみを使用して、プレート全体の熱勾配と蒸発によるエッジ効果の可能性を最小限に抑えます。36の外井戸に200 μLの無菌蒸留水を加え、井戸の間のスペースに150 μLを加え、37.5 °CとCO2の5%で一晩インキュベートします。
  3. 翌朝、全DNA100ng(各構成要素50ng)を用いてトランスフェクションを行う。
  4. 図2bに従って4つの異なるプラスミドの組み合わせ(受容体:β-アレスチン)を設定する。
  5. プラスミドの組み合わせごとに、ウェルあたり0.3 μLの脂質トランスフェクション試薬を使用してHEPESでバッファリングされた変更されたイーグルの最小必須メディアの20 μLを使用します。
  6. 各ウェルに脂質トランスフェクション試薬-DNA混合物の20 μLを追加し、10sの円でプレートを混合します。
  7. 37.5 °Cおよび5%CO2で6時間後のインキュベーション後に新鮮な培地を変更する。
  8. 37.5 °Cで24時間プレートをインキュベートし、5%CO2.

8. HEK293細胞における受容体β-アレスチン1/2相互作用のモニタリング

  1. 吸引媒体を吸引し、各井戸にHEPESでバッファリングされた変更されたイーグルの最小必須メディアの100 μLを追加し、プレートがRTで10分間安定させます。
  2. フリマジン基板を19巻のLCS希釈バッファー(20倍希釈)11と100x基板を組み合わせて調製し、細胞培養培地と混合する5倍のストックを作成する。
  3. 各ウェルに5xフリマジンの25 μLを追加し、10sの円で穏やかに混合します。
  4. RTでの信号安定化のために10分間の発光を測定します。
    注:このベースライン信号を使用して各ウェルの応答を正規化することにより、ウェル当たりの細胞数の違い、トランスフェクション効率の違いなどによって生じ得られる変動性を低減するのに役立ちます。一度計算された、所定の薬物治療のための複製ウェルからの正規化された応答を平均する。
  5. HEPESでバッファリングされた変更されたイーグルの最小必須メディアで13.5xリガンド溶液を準備します。
  6. 13.5xリガンド添加の10 μLで室温での実験の場合は、インジェクターまたはマルチチャンネルピペットを使用して化合物を追加し、手でまたは軌道シェーカー(200 rpmで20s)を使用してプレートを混合します。
  7. 13.5xリガンド添加の10 μLを持つ37.5 °Cでの実験では、インジェクターを使用して化合物を分配し、計器軌道シェーカーを使用して混合します。インジェクターを使用しない場合は、ルミノメーターからプレートを取り出し、リガンドを追加し、手でまたは軌道シェーカー(200rpmで20s)を使用してプレートを混合します。
    注: 検出装置内でインジェクタとシェーカーを使用して、ルミノメーターからプレートを取り外す場合の温度変動を最小限に抑えます。標準的なベンチトップの照明計はこのアッセイのために使用することができる。0.25~ 2 s の積分時間を使用します。

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結果

ここで提示される手順を用いて、原型GPCRと2つのβ-アレスチンアイソフォームとの相互作用をモニターした。グルカゴン様ペプチド受容体(GLP-1r)の構築物は、NheIおよびEcoRI酵素制限部位を含むプライマーを用いて作製し、ベクターpBiT1.1-C[TK/LgBiT]およびpBiT2.1-C[TK/SmBiT]にクローニングしたが、β-ア逮捕状の場合は2つの追加ベクターが挙げられた。β-アレストイン2およびNheIおよびXhoIの場合は、β-アレストイン2およびNheIおよびXhoIの場合に酵素制限部位BgIIIおよびEcoRIを用いたpBiT1.1-N[TK/LgBiT]およびpBiT2.1-N[TK/SmBiT]を用いた。HEK293細胞を50ngのGLP-1r-LgBiT/SmBiTおよび50ngのβ-アレスチンをN-またはC末端でLgBiTまたはSmBiTでタグ付けしてトランスフェクトした。4つの異なるプラスミドの組み合わせ(図3)をスクリーニングし、さらに実験のために最も高い発光信号を持つものを選択した(図4)。

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ディスカッション

ここで提示される方法を用いて、任意のGPCRとβ-アレストリン1/2との相互作用は、このGPCR-β-アレストリン構造補体アッセイを用いてリアルタイムの生体系で監視することができる。この点に関して、GLP-1r(原型BGPCR)による2つのβ-アレスチンアイソフォーム間の微分β-アレスチン募集を観察することができ、最大値に達してから数分後に受容体β-アレスチン複合体の解離も観察した。発光信号。

構造補体アッセイシステムで最高の感度を持つために、受容体と各β-アレスチンアイソフォームとの間の4つの異なる空間的向きをスクリーニングし、後部に最も高い発光シグナルを用いたものを用いた。線量応答刺激曲線などの研究 (図4)この方法論を用いて、糖尿病15等の内分泌疾患において高い治療価値のGPCRを用いて受容体β-アレスチン相互作用を特徴付け可能であった。同様に、この戦略は、C末端でLgBiTまたはSmBiTで関心のあるGPCRを簡単にタグ付けし、ここで説明するβ-arrestin1/2...

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開示事項

著者は、競合する利益を宣言しません。

謝辞

本研究は、科学・ICT・未来計画省が出資する韓国国立研究財団(NRF)の研究プログラム(NRF-2015M3A9A7029172)の助成金によって支援されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
抗生物質 ペニシリン ストレプトマイシンWelgeneLS202-02ペニシリン/ストレプトマイシン
細菌インキュベーターJEIO TechIB-05Gインキュベーター(エアジャケット)、基礎
細胞培養培地WelgeneLM 001-05DMEM 細胞培養培地
細胞培養トランスフェクション培地Gibco31985-070Optimem 1X 細胞培養培地
CO2インキュベーターNUAIRENU5720直接加熱 CO2インキュベーター
デジタルウォーターバスラボテックLWB-122Dデジタルウォーターバス ラボテック
DNAポリメラーゼプルーフリーディングELPIS BiotechEBT-1011PfU DNAポリメラーゼ
DNA精製キットCosmogenetechCMP0112miniprepLaboPass 精製キット プラスミド Mini
DNA Taqポリメラーゼ酵素P750nTaq DNAポリメラーゼ
酵素制限 BglIIニューイングランドバイオラボR0144LBglII
酵素制限バッファーニューイングランドバイオラボB72045CutSmart 10X バッファー
酵素制限 EcoRIニューイングランドバイオラボR3101LEcoRI-HF
酵素制限 NheIニューイングランドバイオラボR01315NheI
酵素制限 XhoIニューイングランド BiolabsR0146LXhoI
ウシ胎児血清ギブコ カナダ12483020ウシ胎児血清
ゲル/PCR DNA MiniKitリアルバイオテックコーポレーションKH23108HiYield ゲル/PCR DNA MiniKit
リガーゼELPIS BiotechEBT-1025T4 DNA リガーゼ
光学顕微鏡オリンパスCKX53SFCKX53 顕微鏡 オリンパス
脂質トランスフェクション試薬Invitrogen11668-019リポフェクタミン 2000
ルミノメーターBiotek/Fisher Scientific12504386Synergy 2 マルチモード マイクロプレートリーダー
NanoBiT システムPromegaN2014NanoBiT PPI MCS スターターシステム
ナノルシフェラーゼ基板PromegaN2012Nano-Gloライブセルアッセイシステム
PCR サーマルサイクラーエッペンドルフ6336000015マスターサイクラー Nexus SX1
ポリ-L-リジンSigma AldrichP4707-50MLポリ-L-リジン溶液
Trypsin EDTAGibco25200-056Trysin EDTA 10X
White Cell culture 96 well platesCorning3917Assay Plate 96 well plate

参考文献

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