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方法論記事

細胞および組織におけるコエンザイムAの定量

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DOI：

10.3791/60182

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2019年9月27日

 ,  ,  , 
1Department of Infectious Diseases, St. Jude Children's Research Hospital

この記事について

サマリー

この方法は、培養細胞および動物組織からのサンプル調製、試料中のコエンザイムAの抽出および誘導体化、続いて誘導体化されたコエンザイムAの精製および定量のための高圧液体クロマトグラフィーを記載する。吸光度または蛍光検出。

要約

新しい研究は、細胞補酵素A(CoA)供給が成長、代謝および生存に有害な影響で制限されることができることを明らかにしました。細胞CoAの測定は、その比較的低い存在量と、順番に、多数の代謝反応に関与するCoAチオエステルへの自由CoAの動的変換による課題です。サンプル調製中に潜在的な落とし穴をナビゲートし、多くの生物医学研究室での使用に適した幅広い線形検出でアッセイを得る方法が記載されています。

概要

コエンザイムA(CoA)は、すべての生物に不可欠な共因子であり、パントテン酸(パントテン酸の塩)またはビタミンB5とも呼ばれるパントテン酸から合成されます。CoAは、酢酸やコハク酸などの短鎖酸を含む有機酸の主要な細胞内担体であり、プロピオン酸やメチルマロン酸などの分岐鎖酸、パルミテートやオレエートなどの長鎖脂肪酸、非常に長鎖脂肪酸等多価不飽和脂肪酸、及びバルプロ酸などの異生物製剤。有機酸は、中間代謝1における100以上の反応における基質としての使用を可能にするために、CoAと酵素的にチオスターリンケージを形成する。CoAチオエステルはまた、アロステリックレギュレータおよび転写活性化剤である。細胞全体のCoA供給が3、4を規制されていることは今では2を評価されています。したがって、CoAの利用可能性は制限され、CoAの欠乏は、CoA生合成5に影響を与える遺伝的障害によって例示されるように、壊滅的なことができます。パントテナテキナーゼは、CoA生合成(図1)およびパントテナテキナーゼ関連神経変性、PKANと呼ばれる、PANK2遺伝子6の突然変異によって引き起こされる第一歩を触媒する。COASYN遺伝子によってコードされるCoA合成酵素は、CoA生合成(図1)およびCOASYタンパク質関連神経変性(CoPAN)の最後の2つのステップを触媒し、COASYN遺伝子7の突然変異によって引き起こされる。PKANとCoPANの両方は、脳内の鉄蓄積に関連する神経変性疾患とCoA欠乏症の下で疾患病理の下に継承されています。

全CoAの細胞レベルは組織8によって異なり、全CoAは様々な生理学的、病理学的および薬理学的状態の下で増加または減少することができる。肝臓CoAは、給餌状態から断食状態9への燃料切り替え中に増加し、レプチン欠損肥満マウス10では肝臓CoAレベルが異常に高い。肝臓CoAは、慢性エタノール摂取に応答して減少する 11.Pank2ノックアウトマウスモデルにおける脳CoAレベルは周産期中にうつ病化されるが、成人期の後の脳CoA含有量は野生型レベルと同等であり、開発12の間に適応的CoA応答を示す。トランスジェネシスまたは遺伝子送達法による組織CoA含有量の操作は、代謝および神経機能に影響を与える13,14,15.PKANまたはCoPANのための潜在的な治療法の前臨床開発は、有効性の指標として細胞または組織CoA測定を含む16,17,18,19,20.これらすべての条件とその代謝または機能的結果の評価には、CoA全体の測定のための定量的方法が必要です。

生物学的サンプル中のCoAを測定するための正確で信頼性の高いアッセイは、多くのラボで技術的な課題です。残念ながら、無傷の細胞におけるCoAまたはCoAチオエステルを評価または定量化するためのプローブはないが、天然CoAチオエステルの類似体は、酵素21を利用したCoAエステルの研究において機械的プローブとして広く用いられている。CoAの変換は、遊離スルフヒドリル(-SH)部分を用いて、CoAチオエステル(またはその逆)に対して、異なる環境への転移中および細胞リシス中に細胞または動物組織において急速である。多数のアシルCoA合成酵素およびアシル-CoAチオエステラーゼは、CoAプール内の相互変換を仲介し、CoAチオエステルを基質として利用する追加の酵素は、化学的または物理的に消毒されるまで生物学的サンプルにおいて活性を維持する。手段。アシルトランスフェラーゼによるCoAからカルニチンへのアシル基のオフロードは、CoA/CoAチオエステル分布を変化させることができる反応のネットワーク内の一例です。放射性トレーサーは、細胞内のCoA合成率を測定するために使用することができます。生体試料中のCoAおよびCoA誘導体を測定するための現在の方法は22を検討され、結合酵素分光光アッセイ、高圧液体クロマトグラフィーおよび質量分析ベースの手順が含まれる。しかし、これらの方法は、多くの場合、特定のCoA分子種に焦点を当てており、全CoAプールの変動に盲目である。結合された酵素アッセイは、一般に、検出感度が低いため、より大量の入力材料を必要とし、線形性の範囲が限られています。

当研究室では、培養細胞および動物組織におけるCoA全体の定量化に関する信頼性の高い手順を開発しました。この戦略には、CoA種のスペクトル全体を維持および分析する努力をするのではなく、サンプル調製中に無料のCoAのみを得るために、すべてのCoAチオエステルの加水分解が含まれます。この手順は、高圧液体クロマトグラフィー(HPLC)に続くサンプル調製、CoA誘導体化、精製および同定、および吸収性による導出CoAの定量化のための個々の公開方法をまとめたものである。蛍光検出23,24,25.この手順を用いて得られたCoAの決定は、CoA規則の理解とCoA欠陥の治療のための治療アプローチの開発を可能にしました。

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プロトコル

このプロトコルで言及された動物の手順は、プロトコル323および556に従って行われ、特にセントジュード小児研究病院機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。

1. ソリューションの準備

注:すべての溶液に対して、および手順に記載されている場合は、超純水を使用してください。

  1. 水中に水酸化カリウム(KOH)1mを調調します。
  2. 水に0.25 M KOHを準備します。
  3. 水中で1 M Trizma-HClを準備し、pH 8.0に調整します。
  4. アセトニトリル(オプティマグレード)で100mMモノブロブロビマン(mBBr)を調調します。mBBrのストック溶液は、光への暴露がビマネ26にモノブロボビマンを光線化することができるので、暗闇の中で保たれれば、何ヶ月も-20°Cで安定している。
  5. 固相抽出(SPE)カラム用洗浄バッファーを調味する:50%メタノール(オプティマグレード)+2%酢酸。
  6. SPEカラム用溶出バッファーを調用:50mMアンモニウムを含む95%エタノール(HPLCグレード)。

2. CoA-ビマネ規格の作成

  1. 評判の良いソース(例えば、アバンティ極性脂質社)から高品質のCoA規格を購入します。
  2. 20 mMトリス、pH 8でCoAの高濃度ストック溶液を調調します。高濃度ストック中のCoAの量はλ260nm(μ=16,800 M-1∙cm-1)の分光光光度で決定または確認される。mBBrの4倍モル過剰を追加します。10sの高い渦。たとえば、バッファー内の 10 mM CoA の場合は、40 mM mBBr を追加します。mBBr は、すべての CoA が派生していることを確認するために過剰に追加されます。
  3. mBBrでCoAを誘導するために揺れることなく、暗闇の中で4時間室温でインキュベートする。mBBrはCoAのチオール基と反応し、pHおよび温度依存性27である。mBBrの添加は、CoAを水溶性蛍光(または紫外線吸収剤)CoA-ビマネ(CoA-ビマネ)に変換します。図 2)
  4. 100 μL 酢酸と渦を10sの高さで加えて反応を止める。
  5. 2,000 x gで15分間遠心分離機を使用して、沈殿物を除去します。
  6. SPEカラムを使用して上清をクリーンアップし、未反応のmBBrを除去する(後述)。SPEカラムクリーンアップ後の溶出物の濾過および遠心分離は必要ありません(セクション5.8)。
  7. 予め計量されたチューブにCoA-bimaneを含むSPEカラムから溶出液を収集し、窒素ガスの下で乾燥し、重量を量り、CoA-bimaneの既知の量で標準的な校正曲線を構築します。
    1. hPLCによる純度のCoA-bimane規格(下記参照)は、λ260(アデニン部分参照)とλ393(ビマネ部分)の両方で吸光度検出を行い、クロマトグラムの両方のピークの一致を確認してください。
    2. 高濃度ストックにおけるCoA-ビマネ規格の量を確認する (λ = 16,800 M-1∙cm-1)。
  8. CoA-ビマネ規格を使用して実験サンプルでCoA-bimaneを同定するためのHPLC保持時間を登録します。
  9. 光から保護され、最大2年間-20°Cで保存されたCoA-bimane規格の高濃度ストックのアリコートを保存します。解凍を繰り返し、凍結を繰り返さないようにしてください。

3. 培養細胞におけるCoAの抽出と誘導体化

  1. 後期サブコンフルエント密度に近づくと培養中の付着細胞を収穫する。例えば、ヒトHepG2/C3A細胞は、6-8 x 106の密度に成長するか、またはHEK 293T細胞は100mm皿当たり〜1.3 x 107の密度に成長する。
    1. CoA 判定には、重複カルチャまたは三部培養を日常的に使用します。サンプル細胞培養と並行して別々の培養皿をインキュベートし、生存可能な細胞数を決定する。HPLC精製後の106-107細胞当たりのCoA量を算出する。
  2. 料理から培養媒体を吸引する。冷たいリン酸緩衝生理食べ物(PBS)で皿の上の細胞を素早く洗い流し、残留培地を取り除き、皿からPBSを吸引します。氷冷水で細胞を素早く洗い、残留PBSを除去し、皿から水を素早く吸引します。PBSまたは水を添加する際に付着細胞を乱さないようにしてください。
  3. 培養皿に氷冷水1mLを加えます。皿の冷たい水に細胞をこすり、0.25 M KOHの400 μLおよび1.5 mLの水を含むガラス試験管に細胞懸濁液を移す。
    1. 10秒間、渦で激しく懸濁液を混ぜます。その後、パラフィンフィルムでしっかりと覆い、水風呂で振ることなく1時間55°Cでインキュベートします。試料のpHは≥12でなければなりません。高pHはCoAチオエステルを加水分解するために重要であり、必要に応じてKOHの追加のアリコートで調整することができる。
  4. 低速で遠心分離により懸濁液中で増殖する培養細胞:4°Cで6分間136xg。 氷冷PBSで一度洗い、冷たい水でもう一度洗い直し、最後に2.5 mLの冷たい水と400 μL 0.25 M KOHで再度再水を行います。上述したように、強く混合し、55 °Cでインキュベートします。
  5. 1 M Trizma-HCl の 160 μL と 100 mM mBBr の 10 μL を加え、高い渦で 10 s を混合します。これにより、pHは約8にをもたらし、自由CoAでmBBr反応を支持する。mBBrがCoAのチオールと反応するために、暗闇の中で2時間室温でサンプルをカバーし、インキュベートします。
  6. 酢酸の100 μLを追加し、反応を停止するために10sの高い渦で混合
  7. 2,000 x gで15分間遠心分離機を使用して、沈殿した細胞の破片を除去します。
  8. 以下に説明する SPE カラムクリーンアップ用のガラス試験管に上清を取り外して保存します。

4. 組織におけるCoAの抽出と誘導化

  1. 動物の組織片を直径約0.5cm以下で解剖し、吸収性紙上で一時的に(1-2秒)ブロットし、液体窒素中でフラッシュ凍結し、処理するまで-80°Cで保存します。組織内のCoAは、フラッシュ凍結しない場合、加水分解またはチオエステルに変換されます。このステップは、組織におけるCoAの最大収率を得るために重要である。
  2. 分析を開始する前に、凍結組織片(5~60mg)を素早く計量し、各サンプルの重量を記録します。この湿量決定は、HPLC精製後のCoA含有量の計算に使用されます。組織片の完全な解凍を避けてください。
  3. プローブの挿入とロータステータホモジナイザーによる組織破壊のために運命づけられたガラス試験管に1mM KOHの2 mLを追加します。使用するまでチューブを氷の上に置いてください。これは、サンプルが低温で均質化され、均質化時に発生する熱によってCoAが破壊されないようにするために行われます。
  4. 30 s.組織の完全な解凍を避けるために、ガラス試験管(冷たい1 mM KOHを含む)に組織(30 - 40 mg)を移送し、均質化します。
  5. 0.25 M KOHの500 μLを加えます。渦は10sの高さにあり、すべてのサンプルが均質化されるまで氷の上に保つ。これは、12以上のサンプルのpHをもたらし、CoAチオエステルを加水分解して合計CoA(無料CoA+加水分解CoAチオエステスター)を得る。
  6. 加水分解をサポートするために振ることなく、水浴中で55°Cで2時間サンプルをインキュベートします。
  7. 1 M Trizma-HCl の 150 μL と 100 mM mBBr の 10 μL を追加します。渦は10秒間高く上がった。これにより、pHを約8にし、遊自由CoAでmBBr反応を支持する。
  8. すべてのCoAがmBBrで導出されることを保障するために暗闇の中で2時間の室温でサンプルをインキュベートする。
  9. 100 μL の酢酸と渦を10sの高さで加えて反応を止める。
  10. ペレット沈殿細胞破片に15分間2,000 x gで遠心分離機。
  11. SPEカラムクリーンアップ用のガラス試験管に上清を取り外して保存します(後述)。

5. 固相抽出(SPE)カラムを使用したサンプルクリーンアップ

  1. 室温で、各使い捨て2-ピリジル-エチルシリカゲルカラム(1mLサイズ)を1mLのウォッシュバッファーで平衡化し、ピリジル機能基がプロトン化され、アニオン交換器として機能することを確認します。2-(2-ピリジル)-エチルシリカゲルは、塩基pHでCoA-ビマネに最適な弱いアニオン交換器です。2-(2-ピリジル)-エチルシリカゲルは6のpKaを有し、溶出はpH≥7を行う。
  2. カラムにサンプル上清(ステップ4.11)を追加し、溶出物を収集します。
  3. 1 mLの洗浄バッファーでカラムを2回洗浄し、保持されていない種を除去します。
  4. 1mLの水でコラムを1回洗います。
  5. 1 mLの溶出バッファーでカラムを別のガラス試験管(12mm x 75mm)に2回洗浄し、CoA-bimaneを回収します。
  6. 窒素ガス下のチューブ中のCoA-bimaneサンプルを乾燥させます。乾燥した試料は、さらに使用するまで室温で安定しています。シールし、チューブとストアを完全にカバーします。
  7. HPLC分析の準備ができたら、300 μLの水でサンプルを再中断し、10秒間高い渦で激しく混合します。
  8. 再懸濁サンプルを遠心管フィルター(0.22 μmセルロース酢酸塩、2 mLサイズ)に移し、遠心分離機を10分間5,000 x gで10分間取り除き、沈殿物を除去します。
  9. HPLC注入に適したガラスバイアルに濾過されたサンプルを移す。

6. CoA-ビマネのHPLC精製と測定

  1. バッファーを準備します。バッファ A: 50 mM KH2PO4,pH 4.6;バッファB:アセトニトリル(オプティマグレード)。
  2. HPLC システムの電源を入れします。
    注:私たちの実験室のHPLCシステムは2489紫外線可視(UV-Vis)吸光器およびEmpower 3ソフトウェアによって制御される2475蛍光検出器が装備されているウォーターズe2695分離モジュールである。システムに自動化されたサンプル注入器がある。
  3. Gemini C18、3 μm 100 Å、4.6 mm x 150 mm カラムの各サンプルを0.5 mL/minの流量で表1に注入します。カラム温度は25°Cです。λ393 nmでのUV/可視検出器の吸光度を測定し、λex = 393 nm、λem = 470 nmで蛍光検出を測定します。保持時間は、サンプルの各セットの前にCoA-bimane標準曲線を実行することによって決定されます。
  4. 各サンプルの CoA-ビマネピークの下の領域を記録し、標準曲線と比較して、HPLC カラムに注入された CoA-ビマネの pmol を計算します。CoA-ビマネ吸光度標準曲線は組織サンプルに使用され、CoA-ビマネ蛍光標準曲線は組織培養サンプルに使用されます。
  5. CoA-ビマネ値は各サンプルのCoAの合計を表すので、培養サンプルの生存細胞数を正規化するか、組織試料に対してmg湿潤重量を測定する(図6)。または、各サンプルの DNA またはタンパク質含有量に正規化した後の CoA 値の合計を計算します。DNAまたはタンパク質含有量は、KOH添加前に試料調製中に除去されるサンプルアリコートを用いて別々に決定することができる。

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結果

培養細胞および組織における全CoAの検出のための比較的高速かつ信頼性の高い方法は、mBBrを用いてCoAのチオールを蛍光剤に誘導し、その後、逆相HPLCを用いて誘導体化CoA-バイマンを精製することによって開発された。標準曲線が最初に生成され、CoA-bimane標準の既知および増加量が個別に注入され、CoA-bimaneクロマトグラムのピーク下の領域が入力CoA-bimaneの関数としてプロットされます(図4)。CoA-bimaneはλ393 nMで吸光度最大を有し、代表的なHPLCプロファイルは、表1の溶出プログラムを使用してC18 HPLCカラム(図3)上のCoA-bimane規格の保持時間を示しています。吸光度または蛍光単位を測定することによって検出されたCoA-bimaneの代表的な標準曲線を、それぞれ図4Aおよび図4B

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ディスカッション

ここでは、吸光度または蛍光出力検出器を備えたHPLCを持つ多くのラボでアクセス可能な幅広い線形検出を持つ細胞および動物組織の全CoAを定量するための信頼性の高いステップバイステップの手順を示します。あるいは、質量分析はCoAおよびCoAチオエステルを評価するための一般的な技術であるが、計測器のコストとデータの方法論および解釈の開発に必要な専門知識のために広く利用できない。質量分析における自由CoAの定量化のための内部標準として使用するのに適した同位体標識CoAは市販されていない、と自由CoAは、アセチルCoAなどのCoAチオエステルと同じ感度を持つ器具によって検出されません。したがって、自由なCoAレベルは、出力データがCoA標準キャリブレーション曲線と比較されない限り、質量分析によって大きく過小評価されることがよくあります。

我々は、以前に私たちの研究室で使用された別の方法でここに記載された方法を比較し、マウス肝臓からのより大きなCoA回復を発見しました, 123.4 ± 7.9 pmol/mg湿式重量, この現在の方法は、酵素アッセイを使用して〜80 pmol/mg湿式重量と比...

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開示事項

MWF、CS、SJは論文を書き、MWFとCSはデータと数字を提供し、CORは実験を設計し、原稿を批判的にレビューしました。SJとCORは、この記事で参照されているPZ-2891化合物をカバーするセントジュード小児研究病院が保有する特許出願中の特許出願(PCT/US17/39037)「パントテネートキナーゼの小分子変調器」の発明者です。

謝辞

著者らは、BridgeBio LLCの子会社であるCoAセラピューティクス社、国立衛生研究所補助金GM34496、およびアメリカのレバノン・シリア関連慈善団体が提供する研究に対する資金提供を認めている。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
2-(2-ピリジル)-エチルシリカゲルSPEカラムMillipore-Sigma54127-U
補酵素AAvanti Polar Lipids870700
Gemini C18 3 μm 100 & アリング;HPLCカラムPhenomenex00F-4439-E0
モノブロモビマンThermoFisher ScientificM-1378
Omni-Tip プローブ 組織破壊器Omni International32750H
ParafilmFisherS37440
PowerGen 125 電動ローター ステーター ホモジナイザーThermoFisher ScientificNC0530997
Spin-X遠心分離管フィルターCoStar8161
Trizma-HClフィッシャーT395-1
ウォーターズ 2475 蛍光検出器ウォーターズ2475
ウォーターズ 2489 UV-Vis検出器ウォーターズ2489
ウォーターズ e2695 分離モジュールウォーターズe2695

参考文献

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