この方法は、培養細胞および動物組織からのサンプル調製、試料中のコエンザイムAの抽出および誘導体化、続いて誘導体化されたコエンザイムAの精製および定量のための高圧液体クロマトグラフィーを記載する。吸光度または蛍光検出。
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この記事について
サマリー
要約
新しい研究は、細胞補酵素A(CoA)供給が成長、代謝および生存に有害な影響で制限されることができることを明らかにしました。細胞CoAの測定は、その比較的低い存在量と、順番に、多数の代謝反応に関与するCoAチオエステルへの自由CoAの動的変換による課題です。サンプル調製中に潜在的な落とし穴をナビゲートし、多くの生物医学研究室での使用に適した幅広い線形検出でアッセイを得る方法が記載されています。
概要
コエンザイムA(CoA)は、すべての生物に不可欠な共因子であり、パントテン酸(パントテン酸の塩)またはビタミンB5とも呼ばれるパントテン酸から合成されます。CoAは、酢酸やコハク酸などの短鎖酸を含む有機酸の主要な細胞内担体であり、プロピオン酸やメチルマロン酸などの分岐鎖酸、パルミテートやオレエートなどの長鎖脂肪酸、非常に長鎖脂肪酸等多価不飽和脂肪酸、及びバルプロ酸などの異生物製剤。有機酸は、中間代謝1における100以上の反応における基質としての使用を可能にするために、CoAと酵素的にチオスターリンケージを形成する。CoAチオエステルはまた、アロステリックレギュレータおよび転写活性化剤である。細胞全体のCoA供給が3、4を規制されていることは今では2を評価されています。したがって、CoAの利用可能性は制限され、CoAの欠乏は、CoA生合成5に影響を与える遺伝的障害によって例示されるように、壊滅的なことができます。パントテナテキナーゼは、CoA生合成(図1)およびパントテナテキナーゼ関連神経変性、PKANと呼ばれる、PANK2遺伝子6の突然変異によって引....
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プロトコル
このプロトコルで言及された動物の手順は、プロトコル323および556に従って行われ、特にセントジュード小児研究病院機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. ソリューションの準備
注:すべての溶液に対して、および手順に記載されている場合は、超純水を使用してください。
- 水中に水酸化カリウム(KOH)1mを調調します。
- 水に0.25 M KOHを準備します。
- 水中で1 M Trizma-HClを準備し、pH 8.0に調整します。
- アセトニトリル(オプティマグレード)で100mMモノブロブロビマン(mBBr)を調調します。mBBrのストック溶液は、光への暴露がビマネ26にモノブロボビマンを光線化することができるので、暗闇の中で保たれれば、何ヶ月も-20°Cで安定している。
- 固相抽出(SPE)カラム用洗浄バッファーを調味する:50%メタノール(オプティマグレード)+2%酢酸。
- SPEカラム用溶出バッファーを調用:50mMアンモニウムを含む95%エタノール(HPLCグレード)。
2. CoA-ビマネ規格の作成
- 評判の良いソース(例えば、アバンティ極性脂質社)から高....
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結果
培養細胞および組織における全CoAの検出のための比較的高速かつ信頼性の高い方法は、mBBrを用いてCoAのチオールを蛍光剤に誘導し、その後、逆相HPLCを用いて誘導体化CoA-バイマンを精製することによって開発された。標準曲線が最初に生成され、CoA-bimane標準の既知および増加量が個別に注入され、CoA-bimaneクロマトグラムのピーク下の領域が入力CoA-bimaneの関数としてプロットされます(図4)。CoA-bimaneはλ393 nMで吸光度最大を有し、代表的なHPLCプロファイルは、表1の溶出プログラムを使用してC18 HPLCカラム(図3)上のCoA-bimane規格の保持時間を示しています。吸光度または蛍光単位を測定することによって検出されたCoA-bimaneの代表的な標準曲線を、それぞれ図4Aおよび図4B
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ディスカッション
ここでは、吸光度または蛍光出力検出器を備えたHPLCを持つ多くのラボでアクセス可能な幅広い線形検出を持つ細胞および動物組織の全CoAを定量するための信頼性の高いステップバイステップの手順を示します。あるいは、質量分析はCoAおよびCoAチオエステルを評価するための一般的な技術であるが、計測器のコストとデータの方法論および解釈の開発に必要な専門知識のために広く利用できない。質量分析における自由CoAの定量化のための内部標準として使用するのに適した同位体標識CoAは市販されていない、と自由CoAは、アセチルCoAなどのCoAチオエステルと同じ感度を持つ器具によって検出されません。したがって、自由なCoAレベルは、出力データがCoA標準キャリブレーション曲線と比較されない限り、質量分析によって大きく過小評価されることがよくあります。
我々は、以前に私たちの研究室で使用された別の方法でここに記載された方法を比較し、マウス肝臓からのより大きなCoA回復を発見しました, 123.4 ± 7.9 pmol/mg湿式重量, この現在の方法は、酵素アッセイを使用して〜80 pmol/mg湿式重量と比.......
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開示事項
MWF、CS、SJは論文を書き、MWFとCSはデータと数字を提供し、CORは実験を設計し、原稿を批判的にレビューしました。SJとCORは、この記事で参照されているPZ-2891化合物をカバーするセントジュード小児研究病院が保有する特許出願中の特許出願(PCT/US17/39037)「パントテネートキナーゼの小分子変調器」の発明者です。
謝辞
著者らは、BridgeBio LLCの子会社であるCoAセラピューティクス社、国立衛生研究所補助金GM34496、およびアメリカのレバノン・シリア関連慈善団体が提供する研究に対する資金提供を認めている。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2-(2-ピリジル)-エチルシリカゲルSPEカラム | Millipore-Sigma | 54127-U | |
| 補酵素A | Avanti Polar Lipids | 870700 | |
| Gemini C18 3 μm 100 & アリング;HPLCカラム | Phenomenex | 00F-4439-E0 | |
| モノブロモビマン | ThermoFisher Scientific | M-1378 | |
| Omni-Tip プローブ 組織破壊器 | Omni International | 32750H | |
| Parafilm | Fisher | S37440 | |
| PowerGen 125 電動ローター ステーター ホモジナイザー | ThermoFisher Scientific | NC0530997 | |
| Spin-X遠心分離管フィルター | CoStar | 8161 | |
| Trizma-HCl | フィッシャー | T395-1 | |
| ウォーターズ 2475 蛍光検出器 | ウォーターズ | 2475 | |
| ウォーターズ 2489 UV-Vis検出器 | ウォーターズ | 2489 | |
| ウォーターズ e2695 分離モジュール | ウォーターズ | e2695 |
参考文献
- Abiko, Y. Metabolic Pathways. Greenburg, D. M. 7, Academic Press, Inc. Ch. 7 1-25 (1975).
- Leonardi, R., Zhang, Y. -M., Rock, C. O., Jackowski, S. Coenzyme A: Back in action. Progress in Lipid Research. 44, 125-153 (2005).
- Jackowski, S., Rock, C. O.
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再版と許可
