方法論記事

液体クロマトグラフィーとタンデム質量分析法を用いたサッカロミセス・セレビシエ細胞リピドームの定量的解析

DOI：

10.3791/60616

⸱

2020年3月8日

 ,  ,  , 
1Department of Biology, Concordia University, 2Department of Chemistry and Biochemistry, Centre for Biological Applications of Mass Spectrometry, Concordia University

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

サッカロミセス・セレビシエの主要な細胞脂質を同定し定量するために、タンデム質量分析と相まって液体クロマトグラフィーを用いたプロトコルを提示する。酵母細胞内の主要な脂質クラスの定量的評価のための記載された方法は、汎用性、堅牢、および感受性である。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脂質は、水に不溶性の構造的に多様な両型分子です。脂質は、生体膜の組織と機能、エネルギー貯蔵および生産、細胞シグナル伝達、タンパク質の静脈輸送、オルガネラ生物新生、および調節された細胞死に不可欠な貢献者です。出芽酵母サッカロミセス・セレビシエは、分子解析を徹底するのに適した単細胞真核生物であるため、モデル生物としての使用は、脂質代謝と細胞内輸送を真核細胞内の複雑な生物学的プロセスに結びつけるメカニズムを明らかにするのに役立った。酵母細胞内の主要な脂質クラスの堅牢で敏感で正確な定量的評価のための汎用性の高い分析方法の利用は、これらのメカニズムに関する深い洞察を得るために重要です。ここでは、S.cerevisiaeの主要な細胞脂質の定量分析のために、タンデム質量分析(LC-MS/MS)と相まって液体クロマトグラフィーを使用するプロトコルを提示する。記載されているLC-MS/MS法は、汎用性が高く、堅牢です。10種類の脂質クラスの中で、多数の種(異なる同種または異性体を含む)の同定と定量が可能です。この方法は感度が高く、0.2 pmol/μLの低濃度で一部の脂質種を同定し、定量することができます。この方法は、酵母細胞全体とその精製された小器官のリピドームの評価にうまく適用されています。この方法でエレクトロスプレーイオン化質量分析のための代替移動相添加剤を使用すると、一部の脂質種のイオン化の効率を高めることができ、したがって、それらの同定および定量を改善するために使用することができます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

証拠の体は、生体分子の主要なクラスの一つである脂質が真核細胞内の多くの重要なプロセスで不可欠な役割を果たしていることを示しています。これらのプロセスには、細胞小器官を取り巻く細胞膜および膜を構成する脂質二重層の組み立て、細胞膜を越えた小分子の輸送、細胞外環境および細胞内シグナル伝達の変化への応答、エネルギーの生成と貯蔵、異なるオルガネラに閉じ込められたタンパク質の輸出入、内膜系内のタンパク質の静脈密売、および細胞死の数のモードが含まれる 、2,3,4,5,6,7,8,9,10.

出芽酵母S.cerevisiaeは、単細胞真核生物であり、これらの重要な細胞プロセスにおける脂質の本質的な役割の根底にあるメカニズムの一部を明らかにするために成功しています4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19,20.S.cerevisiaeは、包括的な生化学的、遺伝的、細胞生物学的、化学的生物学的、システム生物学的、および微小流体解剖分析21、22、23、24、25に適しているため、これらのメカニズムを明らかにするための貴重なモデル生物である。脂質代謝と細胞内輸送がこれらの重要な細胞プロセスに寄与するメカニズムの理解のさらなる進歩には、細胞リピトームの定量的特徴付け、リピドーム分子の複雑性の理解、および定量的リピドミクスをシステム生物学1、2、3、26の学際的プラットフォームに統合するための高感度な質量分析技術が必要である。 27、28、29、30。

酵母細胞および他の真核生物の細胞の質量分析支援定量リピドミクスの現在の方法は、十分に汎用性が高くなく、堅牢で、または感受性が高い。また、これらの現在使用されている方法は、種々の同種または異性体脂質種を互いに区別することができない。ここでは、S.cerevisiaeの主要な細胞脂質の定量分析のためのタンデム質量分析(LC-MS/MS)と相まって液体クロマトグラフィーの使用を可能にする汎用性、堅牢、および高感度な方法について説明します。

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プロトコル

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1. 酵母を培養するための滅菌培地の調製

  1. 1%(w/v)酵母エキスと2%(w /v)バクトペプトンを含む完全なYP培地の90 mLを調製します。
  2. 0.67%(w/v)酵母窒素塩基を含む合成最小YNB培地90 mLを調製し、アミノ酸を含まない酵母窒素塩基、20mg/L-ヒスチジン、30 mg/L L-ロイシン、30mg/L L-リジン、20mg/Lウラシルを調製します。
  3. 完全なYP培地の90mLを2つの250 mLのエルレンマイヤーフラスコ(すなわち、それぞれ45mL)に均等に割る。
  4. 合成最小YNB培地の90 mLを2つの250 mLエルレンマイヤーフラスコ(すなわち、各45mL)に分ける。
  5. 使用前に45分の間に15 psi/121 °CでYPおよびYNB媒体とフラスコをオートクレーブ。

2. 酵母菌株

  1. 野生型株BY4742(MATαhis3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0)を使用する。

3. ブドウ糖を含む完全なYP培地で酵母を培養する

  1. オートクレーブは、使用前に45分の15 psi / 121 °Cでグルコースの20%(w/v)ストック溶液をストックします。
  2. 滅菌20%(w/v)ストック溶液の5 mLを、滅菌YP培地を含む2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれに加え、最終的な濃度の2%グルコース(w/v)を行う。
  3. 微生物ループを使用して、野生型株BY4742の細胞を、グルコースを含む2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれに接種する。
  4. 200rpmで回転揺れをして30°Cで細胞を一晩培養する。
  5. 酵母文化のアリコートを取る。ヘモサイトメーターを使用して、培養のmL当たりの酵母細胞の総数を決定します。

4. 酵母をグルコースを用いた合成最小YNB培地に移し培養する

  1. 滅菌YNB培地を含む2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれに、無菌20%(w/v)ストック溶液の5mLを2%グルコース(w/v)の最終濃度に加える。
  2. 無菌ピペットを使用して、合計5.0 x107細胞を含む一晩酵母培養物の体積を、ブドウ糖を含む2つのエルレンマイヤーフラスコのそれぞれに移入する。
  3. 200rpmで回転揺れを伴う30°Cで少なくとも24時間(または、実験が必要な場合以上)の細胞を培養する。

5. 脂質抽出用の試薬、実験器具、装置の調製

  1. 以下を準備する:1)高いグレード(>99.9%)クロロホルム;2) 高等級 (>99.9%)メタノール;3) ナノ純水中の水酸化アンモニウム溶液 28%(v/v)4)ガラスビーズ(酸洗浄、425-600 μM);5)適切なアダプターを備えた渦。6)ポリテトラフルオロエチレン裏地付きキャップ付き15 mL高速ガラス遠心分離管;7) クロロホルムとメタノールの混合物を17:1と2:1;8)クロロホルム/メタノール(2:1)0.1%水酸化アンモニウム(v/v)との混合物。9) ABC溶液 (155 mM 重炭酸アンモニウム, pH = 8.0);10)表1に示すようにクロロホルムとメタノールの2:1混合物で調製された内部脂質基準の混合物;11)細胞脂質の抽出のためのポリテトラフルオロエチレン裏地付きキャップを用いた2mLガラスサンプルバイアル。

6. LC用試薬・ラボウェア・装置の製造

  1. 以下を準備する:1)アセトニトリル/2-プロパノール/ナノ純水(65:35:5)混合物。2)適切なアダプターを備えた渦。3)超音波超音波処理器。4)ウェルプレート用インサート付きガラスバイアル。5)バイナリポンプ、脱ガッサー、およびオートサンプラーを装備したLCシステム。6)C18逆相カラム(2.1mm;75 mm;細孔サイズ130 Å;pH範囲1-11)を前列システムに結合する。7)混合物A:アセトニトリル/水(60:40);そして8)混合物B:イソプロパノール/アセトニトリル(90:10)。

7. 酵母細胞からの脂質抽出

  1. 酵母文化のアリコートを取る。ヘモサイトメーターを使用するか、またはOD600を測定して、培養のmL当たりの酵母細胞の総数を決定する。
  2. 合計 5.0 x 107細胞 (3.3 単位 OD600)を含む酵母培養のボリュームを取ります。この量の培養液をプレチル1.5 mLマイクロ遠心チューブに入れる。
  3. 4°Cで1分16,000xgで遠心分離により細胞を収穫する。上清を捨てます。
  4. 1.5mLの氷冷ナノ純水を加え、4°Cで16,000 x gの遠心分離で細胞を洗浄します。上清を捨てます。
  5. 1.5 mLの氷冷ABC溶液を加え、4°Cで16,000 x gの遠心分離で細胞を洗浄します。上清を捨てます。細胞ペレットは、脂質抽出の前に-80°Cで保存することができる。
  6. 脂質抽出を開始するには、氷上の細胞ペレットを解凍します。
  7. 200 μLの氷冷ナノ純水で細胞ペレットを再懸濁します。セルサスペンションをポリテトラフルオロエチレン裏地付きキャップ付きの15mL高強度ガラススクリュートップ遠心分離管に移します。このチューブに以下を追加: 1) 25 μLクロロホルム/メタノール(2:1)混合物で調製された内部脂質標準の混合物;2) 425-600 μMの酸洗浄ガラスビーズの100 μL;そして3)600 μLのクロロホルム/メタノール(17:1)混合物。
  8. 室温(RT)で5分間高速でチューブをボルテックスし、細胞を破壊する。
  9. RTで1時間の低速でチューブをボルテックスし、脂質の抽出を容易にする。
  10. サンプルを氷上で15分間インキュベートし、タンパク質の沈殿と水相と有機相の互いの分離を促進します。
  11. 3,000 x gの臨床遠心分離機でチューブを 5 分間 RT で遠心分離します。この遠心分離工程は、すべての脂質クラスを含む下の有機相から上水相を分離することを可能にする。
  12. ホウケイ酸ガラスピペットを使用して、ポリテトラフルオロエチレン裏地付きキャップを用いて、低い有機相(〜400μL)を別の15mL高強度ガラススクリュートップ遠心分離機チューブに移します。このような移動中にガラスビーズまたは上水相を破壊しないでください。窒素ガスの流れの下で低い有機相を保つ。
  13. 残りの上部水相にクロロホルムメタノール(2:1)混合物を300μL加え、スフィンゴ脂質およびPA、PS、PI、およびCL.ボルテックスをRTで5分間激しく抽出できるようにします。
  14. 3,000 x gの臨床遠心分離機でチューブを 5 分間 RT で遠心分離します。
  15. ホウケイ酸ガラスピペットを使用して、遠心分離後に形成された低い有機相(〜200μL)をステップ7.13で採取した有機相に移します。
  16. 窒素ガスの流れを利用して、結合した有機相で溶媒を蒸発させます。窒素ガスの流れ下で脂質膜を含むチューブを閉じます。これらのチューブは-80°Cで保管してください。

8. LCによる抽出脂質の分離

  1. ステップ7.16で得られた脂質膜を含むチューブに、アセトニトリル/2-プロパノール/ナノ純水(65:35:5)混合物を500μL加えます。RTで10 sのためのチューブ3xをボルテックス。
  2. RTで10 sのための15分の超音波超音波処理にチューブの内容を対象. Vortexチューブ3x。
  3. チューブからサンプル100μLを取り、ウェルプレートに使用するインサートでガラスバイアルに追加します。ウェルプレートにペーシングする前に、インサートの気泡を除去します。
  4. LC システムを使用して、逆相 C18 カラム CSH を前段のシステムに結合した異なる脂質種を分離します (材料表を参照)。分離の間、カラムを55°C、流量0.3 mL/minに保ち、サンプルをウェルプレートのRTに保管します。
  5. 混合物A(アセトニトリル/水[60:40(v/v)])と混合物B(イソプロパノール/アセトニトリル[90:10(v/v)])で構成される移動相を使用します。エレクトロスプレーイオン化(ESI)イオン源を用いて作成された親イオンの検出の正のモードでは、ESI(+)モード、移動相AおよびBは、10mMの最終濃度でアンモニウムの定型を含む。親イオン検出の負のモードでは、ESI(-)モード、移動相AおよびBは、10mMの最終濃度で酢酸アンモニウムを含む。
  6. ESI(+)モードとESI(-)モードの両方に注入する場合は、10 μLのサンプルボリュームを使用します。
  7. LCの次の勾配を使用して別々の異なる脂質種: 0-1 分 10% (フェーズ B);1-4分60%(フェーズB);4-10分68%(相B);10-21 97% (フェーズB);21-24分97%(フェーズB);24〜33分10%(相B)。
  8. 抽出ブランクは、最初のサンプル、4 つのサンプルの間、および最後のサンプルとして実行します。背景を減算してデータを正規化します。
  9. 野生型株BY4742の細胞から抽出された脂質のLC/MSデータからの代表的な総イオンクロマトグラムを図1に示す。

9. LCによって分離された脂質の質量分析

  1. LCで分離した脂質を分析するためにHESI(加熱エレクトロスプレーイオン化)イオン源を搭載した質量分析計を使用してください。表 2に示す設定を使用します。
  2. フーリエ変換アナライザーを使用して、60,000 の解像度で、質量範囲 150 ~ 2,000 Da 内で親イオン (MS1) を検出します。
  3. 表3に示す設定を使用して、二次イオン(MS2)を検出します。

10. LC-MS/MSの生データ処理による異なる脂質クラスおよび種の同定と定量

  1. 生の LC-MS/MS ファイルから異なる脂質の識別と定量を実行するソフトウェアの資料表を参照してください。このソフトウェアは、150万個以上の脂質イオン前駆体(MS1)と予測断片イオン(MS2)を含む最大の脂質データベースを使用します。ソフトウェアはまた、脂質の定量のためのMS1ピークと脂質同定のためのMS2を使用しています。同じm/z値を有するが保持時間が異なる2つの異性異性ホスファチジルセリン(34:0)の代表的なクロマトグラムと、MS1およびMS2スペクトルをそれぞれ図2、図3、図4に示す。
  2. LC-MSの生ファイルを検索するフルスキャンMS1データとデータ依存性MS2データを無料(無菌)脂肪酸(FFA)、カージオリピン(CL)、フィトセラミド(PHC)、フィトスフィンゴシン(PHS)、ホスファチジルコリン(PC)、ホスファチジル エタノールアミン(PE)、ホスファチジルグリセロール(PG)、ホスファチジルイノシトール(PI)、ホスファチジルセリン(PS)、トリアシルグリセリン(TAG)の脂質クラスは、前駆体イオンに対して5ppm、製品イオンに対して10ppmのm/z耐性を使用した。その他の検索パラメータを表 4に示します。ソフトウェア・ユーザー・マニュアルに記載されている指示に従ってください。異常な脂肪酸組成を有する内部脂質基準および脂質種の同一性は、手動で検証する必要がある。
  3. 脂質検索ソフトウェアの自由に利用可能なオープンソースの代替手段の助けを借りて、異なる脂質クラスや種を同定し、定量化するには、脂質データ分析器(http://genome.tugraz.at/lda2/lda_download.shtml)、MZmine2(http://mzmine.github.io/)、またはXCMS(https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/xcms.html)ソフトウェアを使用して、LC-MS/MSからの生データを処理します。

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結果

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LC-MS/MSの助けを借りて酵母細胞内の主要な細胞脂質の定量的評価のための私達の方法は多目的で、強い。当初2%のグルコースを含む合成最小YNB培地で培養されたS.セレビシエ細胞の10種類の脂質クラスを同定し、定量化することができました。これらの脂質クラスには、遊離(未エステル化)脂肪酸(FFA)、CL、フィトセラミド(PHC)、フィトスフィンゴシン(PHS)、PC、PE、PG、PI、PS、およびTAG(補足表1)が含まれる。これらの各クラスの多数の分子種を同定し、このLC-MS/MS法を用いて定量化した(補足表1)。

LC-MS/MS法も敏感でした。実際、0.165 pmol/μLの低濃度での脂質の分子種の同定と定量を可能にした(表5のフィトセラミドのデータを参照)。この定量の限界は、広範囲の濃度内の異なる脂質クラスに対して異なる(...

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ディスカッション

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ここで説明するプロトコルの実装を成功させるためには、次の注意事項が重要です。

1. クロロホルムとメタノールは有毒です。それらは実験室のプラスチック製品およびあなたの皮を含む表面から、さまざまな物質を効率よく抽出する。したがって、これらの有機溶媒は、クロロホルムおよび/またはメタノールとの接触を伴うステップでプラスチックの使用を避け、これらのステップにホウケイ酸ガラスピペットを使用し、使用前にクロロホルムとメタノールでこれらのピペットをすすぐすることによって注意してこれらの有機溶媒を処理します。

2. メタノール/クロロホルム(17:1)混合物による脂質抽出の際、ホウケイ酸ガラスピペットを使用して、ポリテトラフルオロエチレン裏地付きキャップを用いて、低有機相(〜400μL)を15mL高強度ガラススクリュートップ遠心分離管に移します。このような移動中にガラスビーズまたは上水相を破壊しないでください。窒素ガスの流れの下で低い有機相を保つ。

3. LC-MS/MSのサンプル調製...

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開示事項

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著者らは、競合する財政的利益はないと宣言している。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ティトレンコ研究所の現在および元メンバーに話し合いに感謝しています。我々は、質量分析の生物学的応用センター及び構造機能ゲノミクスセンター(両方ともコンコルディア大学)が優れたサービスを提供する。この研究は、カナダの自然科学工学研究評議会(RGPIN 2014-04482)とコンコルディア大学議長基金(CC0113)からの助成金によって支えられました。K.M.はコンコルディア大学功労賞の支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
15 mL テフロンライニングキャップ付き高速ガラス遠心チューブPYREX05-550
2 mL テフロンライニングキャップ付きガラスサンプルバイアルフィッシャーサイエンティフィック60180A-SV9-1P
2-プロパノールフィッシャーサイエンティフィックA461-500
アセトニトリルフィッシャーサイエンティフィックA9554
アジレント 1100 シリーズLCシステムアジレント技術G1312A
、Agilent1100 ウェルプレート、Agilent TechnologiesG1367A
酢酸アンモニウム、フィッシャー・サイエンティフィック、A11450
重炭酸アンモニウム、シグマ9830
ギ酸アンモニウム、フィッシャー・サイエンティフィック、A11550
水酸化アンモニウム、フィッシャー・サイエンティフィック、A470-250
バクトペプトンフィッシャーサイエンティフィックBP1420-2
カルジオリピンアバンティ極性脂質750332
セントラ CL2 臨床遠心分離機サーモサイエンティフィック004260F
セラミドアバンティ極性脂質860517
クロロホルムフィッシャーサイエンティフィックC297-4
CSH C18 ヴァンガードWaters186006944プレカラムシステム
遊離脂肪酸 (19:0)Matreya1028
ガラスビーズ (酸洗浄済み, 425-600 μM)Sigma-AldrichG8772
GlucoseFisher ScientificD16-10
血球計算盤Fisher Scientific267110
L-histidineSigmaH8125
脂質検索ソフトウェア (V4.1)Fisher ScientificV4.1LC-MS/MS 分析ソフトウェア
L-ロイシンシグマL8912
L-リジンシグマL5501
メタノール フィッシャー サイエンティフィックA4564
ホスファチジルコリンアバンティ極性脂質850340
ホスファチジルエタノールアミンアバンティ極性脂質850704
ホスファチジルグリセロールアバンティ極性脂質
ホスファチジルイノシトールAvanti 極性脂質LM1502
ホスファチジルセリンAvanti 極性脂質840028
逆相カラム CSH C18Waters186006102
スフィンゴシンAvanti 極性脂質860669
Thermo Orbitrap Velos MSFisher ScientificETD-10600
トリシルグリセロールラロダン、マルメTAG 混合 FA
超音波超音波装置フィッシャー サイエンティフィック15337416
ウラシルシグマU0750
ボルテックフィッシャー サイエンティフィ2215365
酵母エキスフィッシャー サイエンティフィBP1422-2
アミノ酸なしの酵母窒素塩基フィッシャーScientificDF0919-15-3
酵母株 BY4742DharmaconYSC1049
、、、、840446ス ック ック

参考文献

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