方法論記事

ライブイメージングのためのフィブリン・クロッツによる ショウジョウバエ 組織固定化の応用

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DOI:

10.3791/61954

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2020年12月22日

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1Cell & Developmental Biology, School of Life Sciences, University of Dundee

この記事について

サマリー

このプロトコルは、Fibrin血栓を使用したサンプル固定化のアプリケーション、ドリフトの制限、およびライブイメージング中の試薬の追加と洗い流しを可能にするアプリケーションを記述します。試料は、カバースリップの表面に培養培地を含むフィブリノーゲンの滴に移され、その後、トロンビンを加えることによって重合が誘導される。

要約

ショウジョウバエ は、生物学的な問題の広大な範囲を研究するための重要なモデルシステムです。イマジナルディスク、成体女性の幼虫の脳や卵室、または成人の腸などの異なる発生段階の様々な器官および組織を抽出し、タイムラプス顕微鏡でイメージングするために培養中に保持することができ、細胞および発生生物学に関する貴重な洞察を提供する。ここでは、 ショウジョウバエ 幼虫脳の解剖に関する現在のプロトコルを詳細に説明し、フィブリン血栓を使用してガラスカバースリップに幼虫脳および他の組織を固定化および配向させる現在のアプローチを提示する。この固定化法は、培養培地にフィブリノーゲンおよびトロンビンを添加するだけで済む。同じ培養皿内の複数サンプルの反転顕微鏡での高解像度タイムラプスイメージングに適しており、マルチポイント訪問顕微鏡で顕微鏡ステージの動きによって頻繁に引き起こされる横漂流を最小限に抑え、イメージングの過程で試薬の添加および除去を可能にします。また、ドリフトの修正や、タイムラプス分析から特定の定量的情報を抽出して処理するために日常的に使用するカスタムマクロも紹介します。

概要

ショウジョウバエは、生物学的な問題の広大な範囲を研究するための重要なモデルシステムであり続け、何十年もの間、多くの分野で知識を進める上で優れています。特に目立つ機能の1つは、ライブイメージングに特に適していることです。細胞内のプロセスや細胞や組織の挙動をリアルタイムで監視する能力は、細胞生物学や発生生物学に関連する重要な概念の生成に貢献し続けています。多くの成功したプロトコルは、このようなショウジョウバエサンプルを生きて健康に保つために、異なるグループによって開発され、標本および蛍光分子の挙動を研究しています。例えば、イマジナルディスク1、2、幼虫脳3、4、5、6、または成人女性の卵室から器官および組織は、例えば、経過顕微鏡でイメージング用の培養物中に保存することができる。ライブイメージングの重要な課題は、機械的衝撃に敏感なサンプルの完全性を損なうことなく、最適な分解能と不動性のために、試料をイメージング表面の近くに保つということです。例えばショウジョウバエ幼虫脳の神経芽細胞またはニューロンと呼ばれる神経幹細胞を研究するために、サンプルを被覆画像体11、12、13の培養培地で覆うことによって、画像表面の近くにサンプルを保持させることが可能である。しかし、このアプローチでは、メディア交換が容易に行えないため、実験室の操縦が制限されます。あるいは、サンプルを調製し、細胞の接着を増加させ、開いた培養皿におけるマルチポイント訪問顕微鏡および拡張ライブセルイメージングを可能にするために処理されたカバースリップに置くことができるが、それは潜在的に媒体交換を可能にするが、メディア交換中のサンプルのドリフトまたは損失を防ぐ容易な手段を提供しない14、15。

もともと生きているクレーンフライ精子細胞16における明治の病原生を研究するために開発されたフィブリン血栓法は、これらの問題を克服するために特に適している。フィブリノーゲンは、関連する培養培地に溶解し、トロンビンが添加される前に適切なガラス表面イメージングチャンバー上にこの溶液の滴に配置および配向したサンプルは、不溶性フィブリン凝固の迅速な形成をもたらし、サンプルを培養培地への試料のアクセスを確保しながらガラス表面および試料に付着する粘着性の線維性メッシュをもたらす。その後、血栓またはサンプル位置を摂動させることなく、培地を交換することができる。例えば、イメージング時の培地交換は、阻害剤が元の方法のように添加される場合や、洗い流しやパルス追跡実験のために、または細胞および組織を所定の位置に保ちながら生細胞イメージング中に蛍光色素を添加する場合に望ましい。フィブリン血栓は、ショウジョウバエ組織のイメージングに適しているだけでなく、個々の細胞13、17。フィブリン血栓は、フィブリン血栓内のサンプル位置と血栓自体の形状を調節することによって、その形状または他の特性のために、通常は望ましい方向に向けることができないという、サンプルを配向するのに役立つさらに使用することができる。

ここでは、現在のFibrin血栓ベースのイメージング方法に関する最新情報を提供し、セグメンテーションベースの画像分析のためのツールを提供し、この方法を使用して発達中のハエ脳の神経芽細胞分裂を研究することに焦点を当てています。私たちは、同じ培養皿の異なる血栓の複数のサンプルに従うためにFibrin血栓法を日常的に使用しています。これにより、i)マルチポイント訪問を使用して同じイメージング設定で異なる遺伝子型の薬理学的治療時にサンプルの挙動を監視する、セントロソーム挙動やmRNA局在化生18、19、iiなどの細胞内イベントのイメージングが可能になります。 顕微鏡20、iii)酵素21およびivの急性阻害の影響を研究する)標的レーザーアブレーション22に対する生理的環境内の細胞分裂の細胞の向きの変化を研究するために漂流を最小限に抑える。トロンビンとフィブリノーゲンとフィブリン血栓の望ましくない効果は、各サンプルについて経験的にテストする必要がありますが、 この方法は、生細胞イメージングによって分析されるあらゆる種類のサンプルを固定化するのに適しており、ショウジョウバエでは神経芽細胞生物学5、19、20の複数の側面を研究するのに成功しているが、また、女性生殖細胞系幹細胞23の細胞センサー突起のダイナミクスおよび急性APKCの卵胞阻害時の極性の変化も研究に成功している。

タイムラプス蛍光イメージングは、この定量的情報を抽出する方法を必要とする複雑な時間分解3Dデータセットの生成をもたらします。ここでは、ショウジョウバア幼虫脳の神経芽細胞または一次細胞培養中の個々の神経芽細胞の皮質タンパク質を定量化するために開発された細胞皮質におけるマルチチャネル蛍光の半自動定量を可能にするハイパースタックおよびカスタムメイドのImageJマクロの漂流を修正するために使用できるImageJベースの24マクロのさらなる開発について説明する。

プロトコル

1. 試薬の調製

注: このプロトコルのすべての手順は、特に説明がない限り、室温で実行されます。

  1. 1x PBS-BSA(0.1%w/v)の溶液を調製するために、1mgの牛血清アルブミン(BSA)をPBSの1mLに溶解する。トロンビン1,000ユニット・mL-1のストック溶液を準備するには、1,000単位のトロンビンをPBS-BSAの1mL(0.1%w/v)に溶解させます。10 μLのアリコートを作成し、-20°Cで4ヶ月間保存します。
  2. ショウジョウバエ脳用の培地を調製し、1Gのグルコースを無菌状態でシュナイダー培地の1Lに溶解する。4 °Cで3ヶ月間フィルターして保管してください。
  3. フィブリノーゲン溶液を調製するには、1mLの培養培地に10mgのフィブリノーゲンを室温で20分間、または37°Cで5分間溶解する。
    注:ステップ1.2で調製したものとは異なる培養培地が使用され、Fibrin血栓がこのステップで既に形成されている場合、培養培地には活性トロンビンが含まれている可能性が高く、事前に不活性化する必要があります。トロンビンの可能性が高いソースは胎児の牛の血清であり、血清を56°Cに加熱して30分間不活性化することができる。
  4. PBS-BSA(5%w/v)のコーティング溶液を調製し、1xPBSの1mLに50mgの牛血清アルブミン(BSA)を溶解する。
  5. ステップ4で使用した試薬例については、1mg NAPP1を315μLのジメチルスルホキシドに溶解して10mM NAPP1のストック溶液を調製する。

2. ショ ウジョウバエ 幼虫脳の解剖

注: この手順は、両眼解剖の下で実行します。

  1. ブラシを使用して、L3幼虫をPBSを含む9ウェルホウケイ酸ガラス皿に移します。幼虫からフライフードのほとんどを取り外し、別のよく含まれる培養培地に移すためにかき混ぜます。
  2. 鉗子(例えば、デュモン#55)を使用して、体の長さの中央にある幼虫を全径にわたって把握します( 図1A,Bを参照)。幼虫を保持しながら、200μLの新鮮な培養培地を含むホウケイ酸プレートの別のウェルに移します。
  3. 幼虫を解放しないでください。幼虫を全径(図1B)で半分に切る場合は、鉗子の先端(図1A、上パネル)の横移動でつかんだ領域を粉砕するか、幼虫を保持する2つの鉗子先端の間に別の鉗子の1つの先端をスライドさせる(図1A、下パネル)。幼虫を四肢の1つを引っ張って半分に切らないでください, それは体の長さを横切る神経を介してそれを引っ張ることによって脳を損傷する可能性があります ( 図 1Bの赤い線).
  4. 鉗子を使って幼虫をキューティクルで保持し、別の鉗子を使って、脳を引っ張らずにキューティクルを剥がす(図1C)。図 1Dに示すように、脳から出る神経が見え、脳と口の部分をつなぐ器官にアクセスできるまで繰り返します。
  5. 脳から生じる神経を保持するために鉗子を使用してください。他の鉗子のペアでは、図1Aに示す技術のいずれかを使用して、脳と口の部分との間の接続を切断し、脳を残りのキューティクルから分離する(図1D)。
  6. 鉗子を使用して、腹側神経コードから出てくる軸索によって脳を保持します。 図1E に灰色で描かれた器官を、脳からそっと引き離して摘み取ります。
    注:目/アンテナの想像力ディスク(濃い黄色)を引っ張って脳から取り外しないでください。これらの組織間の接続は、脳を損傷することなく引っ張ることによって壊れるには堅牢すぎます。
  7. 脳を保持し、向きに神経を保持しながら、他の鉗子のペアと目/アンテナの想像力ディスク(濃い黄色)と脳の間の接続を把握する(図1F)。図1Aに示すいずれかの技術を使用して、脳を引っ張らずにこの接続を切断します。脳が他の組織(図1G)を適切にクリアし、損傷していないかどうかを確認する(図1H)。損傷の兆候を示す場合は、脳を破棄します。
  8. ピペットチップを塗布するためにP20を入れ、および出してコーティング溶液をピペット。コーティングされた先端を3 μLの培地(図2A、左)と共に脳にピペットし、200μLのクリーンな培養培地を含む別のウェルにピペットアウトする。
  9. 十分な脳が解剖されるまで、ステップ2.2〜2.8を繰り返し、時折解剖が行われる井戸の培養培地を置き換えます。

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図1:D.メラノガスター幼虫脳の解剖。(A)鉗子を使用して引っ張らずに切断する技術。サンプル(淡い緑色)は、鉗子の先端(上パネル)の間に接地されるか、サンプル(下部パネル)を保持する鉗子の先端に沿って鉗子の先端を動かすことによって切断することができる。(B–F)幼虫の脳を損傷することなく隔離するためのステップ(テキストを参照)。赤:脳。濃い黄色:目/アンテナディスク。青のテキスト: 対応する鉗子で実行するアクション。(G) 目に見える損傷のない孤立した脳の外観。Dは裏側、Vは側面図の側である。(H) 解剖中に脳を過度に引っ張ることによって引き起こされる一般的な損傷。トップパネル:腹側神経コードの剥離。ボトムパネル:ローブの変形。後部は左、前は全パネルで右です。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

3. フィブリンの血栓が付いているカバースリップの固定化

注: この手順は、両眼解剖の下で実行します。

  1. ステップ2.8のようにコーティングされた先端を有するP20ピペットを使用して、200μLの培養培地+フィブリノーゲンを含むホウケイ酸プレートの別のウェルに解剖された脳を移す(図2A)。
  2. 9 μLの培養培地+ フィブリノーゲンと共に1つの脳内のピペット。先端の端部が35mm細胞培養皿のカバーガラス底部にほとんど触れると、培養培地がピペット先端を出た直後にカバースリップに触れ、脳と培地が先端の側面にスライドしないように、脳に損傷を与える可能性がある内容物(培養培地と脳)をピペットアウトする( 図2A)。
  3. 一対の鉗子または閉じた鉗子の1つの先端を使用して、脳を穏やかに押し、培養培地+フィブリノーゲンの低下の中に位置付ける。
    注:開いた鉗子でドロップをタッチすると、培養培地が鉗子の先端の間の毛細血管によって引っ張られる可能性があります(図2B)。
  4. 脳の腹側部分を画像化する必要がある場合は、以下のようにフィブリノーゲン凝固を誘導して、血栓内の脳を適切に配向させる(図2C)。
    1. 脳をドロップの片側に押し込む。P1チップを搭載したP1ピペット、ピペット1μLのトロンビン溶液を備え、ピペットチップで脳の反対側のドロップの端に触れ、トロンビンをピペットアウトします(図2C、最初の図)。
    2. フィブリノーゲンが重合を開始するまで1〜2分待ち、落下の片側に曇りの沈殿物が形成されます(図2C、2番目の図面)。脳をそっと押してフィブリン血栓に「押し込む」と、画像への部分(例えば、腹側)が脳を変形させることなくカバースリップにできるだけ近いことを確認します(図2C、3番目の図面)。
    3. フィブリン血栓に押し込まれていない脳の側面に近いトロンビン溶液のピペットアウト1 μL.(図2C、4番目の図面)。
    4. 2番目のフィブリン血栓が設定されるまで2〜3分待ちます(図2C、5番目の図面)。血栓の端を押して、カバースリップに強く付着させ、脳を変形させないように注意してください(図2C、6番目、7番目の図面)。脳がカバースリップから遠すぎるように見える場合は、脳の近くにフィブリン血栓を押すことによってそれを近づけます。
  5. 脳の後部を画像化しなければならない場合は、次のようにフィブリン凝固を誘導する(図2D)。
    1. 脳をドロップの中央に置き、後ろ側をカバースリップに向けます。薄い先端を備えたP10ピペット、トロンビン溶液のピペット1μLで、ピペット先端で脳の反対側のドロップの端に触れ、トロンビンをピペットアウトします(図2D、最初の描画)。
    2. フィブリノーゲンが重合を開始するまで2〜3分待ち、曇り、繊維状の沈殿物が形成されます(図2D、第2の図面)。血栓の端を押して、カバースリップに強く付着させ、脳を変形させないように注意してください(図2D、3番目、4番目の図面)。
  6. カバースリップ上に複数の血栓サンプルを固定する必要がある場合は、ステップ3.1~3.5を繰り返します。
  7. 先端の端部が血栓の上に約0.5cm配置された場合、フィブリノーゲンが血栓の上に滴り落ちることなく、390μLの培養培地を静かにピペット化します(図2B、右ペトリ皿)。カバースリップから脱離する可能性があるため、血栓の側面に培養培地を添加しないでください。
  8. 残りのトロンビンを洗い流すために、ピペットを使用して300μlの培養培地を取り除き、300μlのクリーンな培養培地を加え、血栓が完全に浸漬したままであることを確認します。余分なトロンビンを洗い流すために2回繰り返します。

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図2:フィブリン血栓を用いたショウジョウバエ幼虫脳の固定化(A)BSAコーティングされたピペットチップを用いて、脳は培養培地(黄色)から培養培地+フィブリノーゲン溶液(オレンジ)に移され、培養培地+フィブリノーゲンの3.5μLとともに培養皿のカバースリップ(水色)にピペット化される。フィブリノーゲン凝固は、トロンビンを添加して、脳を後側または腹側位置に固定化することによって誘導される(DおよびEを参照)。血栓中の確保された脳は、その後フィブリノーゲンなしで培養培地で覆われ、過剰なトロンビンは、培養培地を3回加減することによって除去される。(B) カバースリップ上の培養培地+フィブリノーゲン(オレンジ)の滴下内の脳の位置は、閉じた鉗子の先端でそっと押すか、または1つの鉗子の先端で穏やかに押すことによってのみ調節すべきである。開いた鉗子のペアでドロップに触れると、培養培地が鉗子の先端の間の毛細血管によって引っ張られる可能性があります。(C)腹側を撮像するための幼虫脳の位置決めのステップ(テキスト参照)。(D) 後方を画像化するための幼虫脳の位置決め手順(テキスト参照)。(D) および (E) 緑: トロンビン.ダークオレンジ:フィブリン血栓。淡い青:カバースリップ。青い矢印:血栓を安定させるためにカバースリップに押し付ける血栓のエッジ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

4. ライブイメージング中の試薬の添加

  1. 温度変化が焦点の変化を引き起こすのを避けるために、培養皿自体と同じ温度で培養皿に添加する試薬と一緒に溶液を保ち、添加する前に同じ温度に保ちます。環境室が使用されている場合は、チャンバー内に溶液を残します。
  2. 文化皿自体を置き換えることなく、培養皿の蓋を取り除きます。取り外しが容易な場合は、35mm皿の蓋をイメージする前に皿の上に逆さまに置きます。
  3. P1000ピペットを使用して、培養皿の中の培養液の表面にピペットチップを近づけ、適切な量の試薬溶液を適度に放出して、所望の試薬濃度(例えば、20μM NAPP1の溶液の400 μLを400 μLにして最終濃度10μMNAPP1)、血栓を取り外すことができる強いフラックスを発生させることなく。
  4. 培養皿内で溶液を均質化するには、P200ピペットを使用して少量の溶液を5回(例えば、皿内の800 μLの体積に対して150 μL)ゆっくりとピペットします。
  5. 培養皿自体を置き換えずに培養皿の上に蓋を交換し、イメージングを再開します。

5. ライブイメージング中の試薬の洗い流し

  1. 洗い流しの前に、洗浄液を培養皿と同じ温度に保ちます。
  2. 文化皿自体を置き換えることなく、培養皿の蓋を取り除きます。
  3. P200またはP1000ピペットを使用すると、血栓の上部を露出させることなく、培養皿から培養培地をゆっくりと取り除きます(例えば、皿の中の培養培地の800μLから600 μLを取り除きます)。
  4. 試薬を希釈するには、P1000ピペットを用いて、培養液の表面にピペットチップを培養皿の表面近くに置き、洗浄液をゆっくりと放出する(例えば、希釈係数6の場合は皿内に残された200μLの培養液に1mLの洗浄液を加える)。
  5. 必要に応じて試薬が希釈されるまでステップ5.3と5.4を繰り返します(例えば、別の3つの同様のラウンドは1296の希釈因子となり、初期濃度の10 μM NAPP1を7.7nMに減少させます)。
  6. 培養皿自体を置き換えずに培養皿の上に蓋を交換し、イメージングを再開します。

6. 三次元および/または多チャンネルタイムラプス上のドリフトXYZの補正

  1. 準備
    1. ダウンロードしてインストールします。TurboReg25 と MultiStackReg26 プラグインをダウンロードし、ImageJ のプラグインフォルダー内に配置します。
    2. マルチハイパースタックレグ (補足コーディングファイル 1) と AutoHyperStackReg ImageJ マクロ (補足コーディングファイル 2)をダウンロードします。マクロをインストールするには、ImageJ のプラグイン フォルダ内に .ijm ファイルを配置するか、または .ijm ファイルの内容を ImageJ/マクロ/StartupMacros.txt ファイルに追加します。
    3. ImageJ では、いくつかのスライスや複数のチャンネルを含むタイムラプスムービーを開きます (それ以降は「ハイパースタック」と呼ばれる、図 3A、4A)。タイムラプスにスライスが1つ、チャンネルが1つしかない場合、位置合わせはMultiStackRegを使用して直接実行できます。
  2. マルチハイパースタックレグを用いた横ドリフトの補正
    1. アライメントの基準として使用するハイパースタックのチャンネルやスライスを決定します。1 チャンネルの 1 スライス参照スタック(「参照スタック」と呼ばれる)を生成するには、[イメージ]|Duplicate...、重複ハイパースタックチェックボックスをオンにし、関連するチャンネル番号を「チャンネル(c)」に入力します(例えば、1–2を1に置き換える)、およびスライス(z):(例えば、1-15を8に置き換える)、フレーム:(例えば、1-50)にすべてのフレームが含まれていることを確認します(
    2. または、ステップ6.2.1の場合、1チャンネルの1スライス参照スタックに複数のスライスの投影が優先される場合は、[ イメージ]をクリック|スタック |Z Project. をクリックし、最初と最後のスライスと投影の種類を選択し、[ すべての時間枠 ] にチェックマークが付いていることを確認し 、[OK] をクリックします。タイムラプスに複数のチャンネルがある場合は、無関係なチャンネルを削除します(イメージ|スタック |作成された投影からスライスを削除するか、選択した参照チャンネル(画像|複製) (図 3B)
    3. 必要に応じて、ツールバーの長方形ツールを選択し、対象領域の長方形をトレースし、[イメージ]をクリックして、参照として 1 つの部分のみを参照として使用するように参照スタックをトリミング| 作物.
    4. マルチスタックを起動するには、プラグインをクリック|登録|マルチスタックレグ.ポップアップメニューの「スタック 1:」で、前のステップで生成された 1 つのチャンネル、1 つのスライスのスタック名を選択します。ポップアップメニューで[変換: ]を選択します。[変換ファイルを保存]チェックボックスをオンにして、他のすべてのフィールドを無視します。
      注: その他の変換タイプ(25)を参照してください。
    5. [OK] をクリックします。位置と名前を選択して、位置合わせファイルを保存し、[保存] をクリックします。参照スタックウィンドウで、フレームが自動的に移動しなくなるのを待ち、登録が終了したことを示します(図3B)。
    6. 基準スタックで、アライメントが満足しているかどうかを確認します。ない場合は、別の参照スライス、チャンネル、トリミングでステップ6.2.1~6.2.5を繰り返します。参照スタックを閉じます。
    7. ハイパースタックウィンドウを選択し、マルチハイパースタックRegマクロを実行します。ステップ 6.2.5 で作成した変換ファイルを選択し、開くをクリックします。ハイパースタックのすべてのチャンネルやスライスにアライメントが適用されるのを待ち、その時点で「_aligned」という接尾辞を持つ新しいウィンドウが開きます (図 3C)。
  3. マルチハイパースタックレグを使用したフォーカスドリフトの補正
    1. 画像|をクリックします。[プロパティ]をクリックし、[ピクセル幅] に表示されている値をコピーします。1 チャンネルのハイパースタックを 1 ピクセルの間隔で直交的に再スライスするには、[イメージ]|スタック |再スライス [/]...をクリックし、ピクセル幅の値を[出力間隔:数値] フィールドに貼り付けます。[開始位置: ]ポップアップメニューで[上]を選択し、[補間を避ける]にチェックマークを付けて[OK]をクリックします。
      メモ:ImageJでメモリを解放する必要がある場合は、再スライスの後にハイパースタックを閉じることができます。
    2. 再スライスによって生成された新しいウィンドウを選択します (これ以降は「再スライスハイパースタック」と呼ばれます(図4B)。再スライスされたハイパースタックに複数のチャンネルがある場合は、チャンネルスクロールバーでそれらのチャンネルを選択して、整列を実行する参照チャンネルを選択し、他のチャンネルを削除します。[画像]|をクリックします。スタック |スライスを削除し、現在削除ポップアップメニューでチャンネルを選択し、OKをクリックします。
    3. 再スライスされたハイパースタックの単一スライス(ステップ6.2.1を参照)の複製するか、再スライスされたハイパースタックのスライスを複数投影して、シングルスライスされたハイパースタック(それ以降は「再スライスされた参照スタック」と呼ばれる)を生成します(図4C)。
    4. 必要に応じて、イメージとして 1 つのパーツのみを参照として使用するように、再スライスされた参照スタックをトリミングします(ステップ 6.2.3 を参照)。
    5. MutiStackReg を使用して再スライスされた参照スタックに対してイメージ登録を実行します (手順 6.2.4 – 6.2.6 を参照してください) (図 4C)。
    6. 再スライスされたハイパースタックウィンドウを選択し、マルチハイパースタックRegマクロを実行します。ステップ 6.3.5 で作成した変換ファイルを選択し、[ 開く ] をクリックし、ハイパースタックのすべてのチャネルまたはスライスにアラインメント _alignedが適用されるのを待 ちます。元の再スライスされたハイパースタックを閉じます。
    7. 再スライスされたハイパースタックを元のハイパースタックのxyビューに変換するには、[スタック]をクリック|再スライス [/]....をクリックし、[開始位置: ]ポップアップメニューで[トップ]を選択し、[補間を避ける]にチェックマークを付けて[OK]をクリックします。最後のフォーカスに合わせたハイパースタックを含む新しいウィンドウが開いたら (図 4E)、再スライスされた整列したハイパースタックを閉じます。
  4. 横向きのドリフトとフォーカスドリフトを自動的に修正するには、AutoHyperStackReg マクロを実行します。参照チャネルを選択し、該当する場合は、横向きおよび/またはフォーカスドリフトを補正するかどうかを選択します。 [OK] をクリックします。

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図 3: マルチハイパースタックRegによる横ドリフトの補正用パイプライン(A)横向きとフォーカスドリフトは、いくつかのスライスとタイムポイントを含むハイパースタックで観察することができます。(B) 単一のスライス、単一のチャネル参照スタックは、複写または Z 投影のいずれかによってハイパースタックから生成されます。参照スタックは、マルチスタックRegプラグインによって整列され、アライメントファイルが生成されます。(C) MultiHyperstackReg マクロは、ハイパースタックにアライメントファイルを適用するために使用され、その結果、横方向のドリフトが補正されるハイパースタックが整列されます。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-4
図 4: マルチハイパースタックRegによるフォーカスドリフトの補正のためのパイプライン(A) フォーカスドリフトは、複数のスライスとタイムポイントを含むハイパースタックで観察できます。(B) ハイパースタックは、補間なしで、Y 軸に沿ったピクセルの各線に沿って、上から直交して再スライスされます。その結果、再スライスされたハイパースタックはハイパースタックと同じ情報を含み、y と z の座標が切り替わります。元のハイパースタックのフォーカスドリフト(z)は、再スライスされたハイパースタック上のyのドリフトとして発生します。(C) 単一のスライス、単一チャネルの再スライスされた参照スタックは、複製または Z 投影のいずれかによって、再スライスされたハイパースタックから生成されます。再スライスされた参照スタックは、MultiStackReg プラグインによって整列され、アライメントファイルが生成されます。(D) MultiHyperstackReg マクロは、再スライスされたハイパースタックにアライメントファイルを適用するために使用され、その結果、フォーカスドリフト(y)が修正される再配置された再スライスされたハイパースタックが生成されます。(E) 第 2 の直交リスライスはハイパースタックの元の座標を復元しますが、現在はフォーカスドリフト(z)を表示しません。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

7. 回転ラインスキャンによる皮質信号測定

  1. 回転ラインスキャン ImageJ マクロ (補足コーディングファイル 3) をダウンロードします。
  2. ImageJ でタイムラプスを開きます。フレームを最初のフレームに移動し、タイムラプスに複数のスライスが含まれている場合は、信号を測定するスライスにスライスのスクロールバーを配置します。
  3. トラッキングモード
    1. ツールバーで直線ツールを選択します。測定する皮質ゾーンを横切る線をトレースする (図 5A),線が皮質にほぼ垂直であることを確認し、線が次の時間ポイントで皮質を横切るのに十分な長さであることを確認します (図 5B,第 1 および第 2 パネル).
    2. ツールバーの線ツールアイコンをダブルクリックして、[ 線幅 ] ウィンドウを開きます。線と皮質の交差を直線に保ちながら、必要に応じて線の幅を広げます (図 5B、 第 3 パネル)。
    3. [ラインスキャンの回転]マクロを開始します。測定する皮質帯の向きが 1 つのタイムポイントから次の時点に大きく変化しない場合は、回転範囲 (図 5E)を低い値 (約 10 度) に設定します。 [周りを計測] の値を 0 ピクセルに設定すると、最大信号強度が検出されたライン上の信号のみを測定し、このラインの周りの信号も測定するには高い値に設定します。
      注: [周りを測定]の値は、皮質の検出後の信号測定にのみ影響し、検出自体には影響しません。
    4. [Cortex を 検索するチャネル: ] ポップアップメニューで、検出を実行するチャンネルを選択します。各タイムポイントでの皮質の検出場所を視覚化するには、[ 表示位置..] チェックボックスにチェックを入れておいてください (推奨)。[ 再センターと方向を変更する] チェックボックスをオンにします。 [OK] をクリックします。
    5. [完了]、[クリップボードにコピーされた結果] ステータスが ImageJ ウィンドウのステータスに表示されたら、タイムラプスをスクロールして、検出された皮質の位置(黄色のオーバーレイ)と測定領域(シアン オーバーレイ)が満足しているかどうかを確認します。行がない場合は、ラインスキャンオプションウィンドウで、異なるライン位置、長さ、幅、および異なる設定で手順 7.3.1 ~ 7.3.4を繰り返します。
    6. 測定値をスプレッドシート ソフトウェアに貼り付けます。
      注: 列はタイムラプスの表示順にチャネルに対応し、ラインはフレームに対応します。
  4. 非トラッキング モード
    1. ツールバーで直線ツールを選択します。測定する皮質ゾーンを横切って線(シアン、図5Aで示す)をトレースし、線が皮質に対してほぼ垂直であり、ラインが各時間点で皮質を横切るのに十分な長さであることを確認します(図5C、第1および第2パネル)。
    2. ツールバーの線ツールアイコンをダブルクリックして、[ 線幅 ]ウィンドウを開きます。線と皮質の交差を直線に保ちながら、必要に応じて線の幅を広げます (図 5C、 第 3 パネル)。
    3. [ラインスキャンの回転]マクロを開始します。全体のタイムラプス全体で測定される皮質帯の向きの変化に応じて回転範囲(図5E)を設定します。 [周りを計測] の値を 0 ピクセルに設定すると、最大信号強度が検出されたライン上の信号のみを測定し、このラインの周りの信号も測定するには高い値に設定します。
      注: [周りを測定]の値は、皮質の検出後の信号測定にのみ影響し、検出自体には影響しません。
    4. [Cortex を 検索するチャネル: ] ポップアップメニューで、検出を実行するチャンネルを選択します。各タイムポイントでの皮質の検出場所を視覚化するには、[ 表示位置] チェックボックスにチェックを入れておいてください(推奨)。[ 再センターと方向の変更]チェックボックスのチェックを 解除します。 [OK] をクリックします。
  5. 完了すると、クリップボードにコピーされた結果がImageJウィンドウのステータスに表示され、検出された皮質の位置(黄色のオーバーレイ)と測定領域(シアンオーバーレイ)が満足しているかどうかを確認するためにタイムラプスをスクロールします。行がない場合は、ラインスキャンオプションウィンドウで、行の位置、長さ、幅を変更し、設定を変更して、前の手順を繰り返します。
  6. 測定値をスプレッドシート ソフトウェアに貼り付けます。
    注: 列はタイムラプスの表示順にチャネルに対応し、ラインはフレームに対応します。

figure-protocol-5
図5:回転ラインカンを用いる皮質信号の測定。(A) 線(シアン)は、信号が測定される皮質(黒)に垂直にトレースされます。グレーの異なる網掛けは、3 つのタイムポイント (t1、t2、t3) にわたって変化するセルの位置を示します。(B)左:トラッキングモードでの行の正しい位置。中央: 次のタイムポイントでの皮質との重複がないため、トラッキングモードでのラインの位置が正しくない。右: 広い線で、皮質と直線が直線でない間の交点(オレンジ線) になります。(C)左: 非トラッキングモードでの行の正しい位置。中央: 各タイムポイントでのコルテックスとの重複がないため、非トラッキングモードでのラインの位置が正しくない。右: 広い線で、皮質と直線が直線でない間の交点(オレンジ線) になります。(D) スキャンラインの長さと幅。(E) ラインカンは、「回転範囲」パラメータで定義された「回転範囲」パラメータで定義された元の方向を中心に、方向の範囲内で実行されます。(F)皮質に対する走査線の非最適の向きにより、線に沿って測定される低信号が生じる。(G)ラインの最適な方向は、ラインに沿って測定される信号強度の最高峰をもたらすものとして定義されます。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

結果

ライブイメージング中にフィブリン血栓および培養培地交換を伴うショウジョウバエ組織の固定化
ステップ2で示した手順に従って解剖された後(図1)、ステップ3(図2)で示した手順に従って同じカバースリップ上のフィブリン血栓に固定化された後、極性タンパク質Par-3のフライオルソログであるGFPタグ付きバズーカ(Baz::GFP)を発現する幼虫脳を、時間多位共像画像で30分間イメージングした。Baz::GFPはapkcas4と組み合わされ、小さなATPアナログ1-NAPP120を添加することにより非定型タンパク質キナーゼC(aPKC)の急性阻害を可能にするアレルである。したがって、ステップ4で提示した手順に従って培養培地に1-NAPP1を添加し、2.5時間ライブイメージングを再開した。野生型のキナーゼaPKCを運ぶ制御脳はATPアナログに反応しなかったが、APKCのアナログ感受性突然変異(apkcas4)を付加的に運ぶ脳は、神経芽細胞およびそれらの子孫におけるバズの神経エピテリウムおよび明るいクラスターの収縮を示した(図6、ビデオ1)。神経芽細胞はタイムラプスを通して分裂し続け、組織が健康であり続けることを示し、脳は培養培地の変化にもかかわらずほとんどドリフトを示さなく、それらが十分に固定されていることを示す。同様に、27で示された手順に従って解剖された後、Bazを発現する卵巣は、同じカバースリップ上のフィブリン血栓に固定化され、8分間イメージングされ、その後1-NAPP1の適用はapkcas4変異濾胞細胞の収縮を誘発したが、コントロールは誘導しなかった(図7、ビデオ2)。

マルチハイパースタックRegを使用して横およびフォーカスドリフトの補正。
横向きとフォーカスドリフトの両方を表示するハイパースタック(ビデオ3、左パネル)は、まず横ドリフト(ステップ6.2、図3、ビデオ3、中央パネル)を補正し、MultiStackRegプラグインとMultistackHyperRegマクロを使用してフォーカスドリフト(ステップ6.3、図4、ビデオ3、右パネル)を補正し、元のハイパースタックで観察された動きを大幅に減少させました。

回転ラインスキャンを用いた皮質信号測定
Baz::GFP(緑色)と赤外線蛍光タンパク質でタグ付けされた膜貫通タンパク質CD4(CD4:mIFP、赤)を1回の有糸分裂の間にイメージングした。CD4::mIFPシグナルは、ラインカンを用いて神経芽細胞の様々な部分で皮質を検出するための基準として使用された(ステップ7、図5、図8A–C)とBaz::GFP信号を検出された位置で測定した図8D)。分裂の間、神経芽細胞は、尖極と基底極という明確で反対の皮質ドメインを確立することによって一過性に分極した。Bazは、補助極を定義し、一貫して、Baz::GFP信号は神経芽細胞の尖極で増加し、分裂中に基底極で減少した(図8C,D)。皮質の位置は、タイムラプスを通して満足して追跡された(図8C、ビデオ4)。ショウジョウバエ線と遺伝子型は補足表1–2で参照されている。

figure-results-1
図6:ライブイメージング中に固定化された幼虫脳にATPアナログを適用する。(A) Bazを発現する2つの幼虫脳のライブイメージング::GFPは、同じカバースリップに固定化。培養培地は、0分でATPアナログ1-NAPP1の10μMの濃度に変化する。コントロール脳はATPアナログに目に見えて反応しないのに対し、APKC(aPKCAS4)の類似の敏感突然変異を運ぶ脳は、神経芽細胞とその子孫における神経エピテリウム(矢印)およびバズの明るいクラスターの収縮を示す。23 μMの深さのための33のスライスの最大強度の投射はスケール棒:20μM.(B)神経エピテリウムの拡大。スケールバー:10 μM.この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

figure-results-2
図7:ライブイメージング中に固定化された卵室にATPアナログを適用する。Bazを発現する2つの卵巣のライブイメージング::GFPは同じカバースリップに固定化。培養培地は、0分でATPアナログ1-NAPP1の10μMの濃度に変化する。コントロール卵室はATPアナログに目に見えて反応しないのに対し、aPKC(aPKCAS4)の類似の敏感な突然変異を運ぶ卵室は、最終的に付着接合の明らかな崩壊につながる上皮(矢印)の収縮を示す。27 μMの深さのための33スライスの最大強度の投影: 20 μM:この図のより大きいバージョンを表示するにはここをクリックしてください。

figure-results-3
図8:回転ラインスキャンを用いた皮質信号の測定。(A) Bazを発現するライブD.メラノガスター神経芽細胞::GFP(緑)とCD4::mIFP(赤)。シアンライン:測定する様々な皮質ゾーンに垂直にトレースされた最初のスキャンライン。スケールバー:5μM.(B)皮質ラインカンとCD4::mIFP(赤)を基準チャンネルとして使用した皮質(濃い青色の線)の同定。シアンライン:「周りを測定する」パラメータ(ここでは2ピクセル)によって定義される領域で、ここで、信号は皮質検出後に測定される。スケールバー:2μm(C)シアン:(A)に表示される最初の走査線から、(A)に表示される回転ラインスキャン法によって神経芽細胞分裂中に同定される皮質領域を、基準チャンネルとしてCD4::mIFP(赤)を用いた。スケールバー:5 μM.矢印:尖極。矢印:基底極。(D) で表示される回転ラインスキャンによって識別される 2 つの対応するゾーンにおける Baz:::GFP信号強度の時間経過に伴う測定有糸分裂の間、Baz::GFPは神経芽細胞の尖極で一過性に濃縮され、反対側の基底極から枯渇する。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ビデオ1:ライブイメージング中に固定化された幼虫脳にメディア交換を適用して阻害剤を追加し、図6、スケールバー:20μmを追加します。

ビデオ2:ライブイメージング中に固定化された卵室でのメディア交換の適用は、インヒビターを追加するために、図7、スケールバー:20 μmを追加します。

ビデオ3:マルチハイパースタックレグを使用して横向きとフォーカスドリフトの補正。 膜プローブPH::GFPを発現する神経芽細胞のライブイメージング。Xy:単一焦点面。Xz:直交リスライス。左:ドリフトの補正前。中央:横ドリフトの補正後。右:補正後、横向きとフォーカスドリフト、スケールバー:10 μmを クリックしてください。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ビデオ4:回転ラインカンを使用した皮質の検出、図8、スケールバー:5 μmを使用して、このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表 1: ショウ ジョウバエ 組織の画像化された遺伝子型。 こちらの表をダウンロードしてください。

補足表 2: 使用されるトランス遺伝子の起源。 こちらの表をダウンロードしてください。

補足コーディングファイル 1:使用されるトランス遺伝子の起源。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足コーディングファイル 2:使用されるトランス遺伝子の起源。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足コーディングファイル3:使用されるトランス遺伝子の起源。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

D.メラノガスター幼虫脳全体のライブイメージングは、生理学的文脈に近い状態で非対称神経幹細胞分裂を観察する機会を提供する。私たちのプロトコルの最初の部分は、幼虫の脳の解剖に関する私たちのアプローチを紹介します。すでに述べたように13,準備の重要な側面は、脳を損傷を避けることです..この最も困難な側面は、脳を過度に引っ張ることなく、隣接する想像力ディスクから脳を分離することです。「引っ張らずに切断する」という当社のアプローチは、1対の鉗子の先端を持つ粉砕運動を行うか、組織間の接続を保持する他の2つの鉗子チップに沿って鉗子の先端をスライドさせることであるのに対し、Leritらは解剖ピンでのソーのような動きを説明する。私たちは、すべてのアプローチを試してみて、自分自身のために最も適したものを採用するために実験者に助言します。また、分離された脳を移動するための解剖ツールではなく、BSAまたはFCSコーティングされたピペットチップを使用することをお勧めします。コーティングはティッシュがプラスチックに付着するのを防ぎ、彼らが移管の間に解剖用具に付着する可能性のある一過性変形にそれらを従うことなく、常にそれらを完全に浸したまま組織の安全な移動を可能にする。コーティングされた先端は、一度にいくつかの脳の転送を可能にする他の利点を有し、これは特定の媒体内のサンプルの居住時間を制御することが重要である場合に特に有用である。それらは他の組織の移動に適しており、例えば脂肪体のような脆弱なものでさえも、それらは、他の組織の移動に適している。大きなチップを使用するか、先端の先端を切断することで、さまざまなサンプルサイズに対応できます。

次に、このプロトコルは、培養皿のカバースリップに幼虫の脳を固定化するためのフィブリノーゲン凝固の使用を記述する。脳は、培養培地+フィブリノーゲンの一滴以内に配向され、その後、凝固はトロンビンの添加によって誘発される。フィブリン形成は緩やかであり、必要に応じてサンプルの向きを微調整できる時間枠を設ける(図2C)。幼虫の脳の場合に対して助言するサンプルのわずかな圧縮が必要な場合は、ステップ3.4.4と3.5.2の間に多かれ少なかれサンプルの近くに血栓を押すことによって細かく調整することができます。このフィブリノーゲン凝固の主な利点は、ガス透過膜とカバースリップの間に脳が取り付けられるLeritららで説明されているプロトコルに対する、ライブイメージング中に培養培地を交換する能力である。私たちのプロトコルよりもガス透過性膜を使用する可能性のある利点は、脳が血栓といくつかの媒体によって空気から分離されるため、サンプルの最適な酸素化を提供できることです。このため、培養皿内の培養培地の量の影響を評価しなかったが、血栓を完全に浸漬したまま血栓の上に培養培地の量を制限することを提案する。

血栓の操作は実験的に困難で時間がかかるため、実験者はサンプルなしで血栓を操作する最初の練習をすることをお勧めします。カバースリップ上の培養培地+フィブリノーゲンの滴の体積を調節すると、フィブリノーゲンの濃度またはトロンビンの体積と濃度は、準備を容易にするのに役立ち、プロトコルを他のタイプの組織に適応させる際に重要である可能性がある。血栓を操作する十分な経験を持つ複数の脳は、必要に応じて1つの血栓に固定することができますが、方向の微調整を複雑にします。いくつかの血栓は、例えば、異なる遺伝子型のサンプルを画像化することを可能にする、カバースリップ上に形成することができる。同じカバースリップ上の異なる血栓を異なる培養培地に露出させることも可能であるが、異なる血栓を覆う培養培地の滴を混ぜることは決して注意する必要が有る。幼虫の脳が固定化され、ライブイメージングの準備ができたら、過度の光損傷を避けるためにLeritら13 の勧告に従うことをお勧めします。これらの推奨事項に加えて、ステージインキュベーターでのライブイメージング中に脳を25°Cで維持するだけでなく、イメージング開始前に少なくとも30分間この段階を予熱します。私たちの手の中では、体系的にそうしないと、強い焦点ドリフトが生じます。

ライブイメージング後にサンプルをサンプルに対して相関顕微鏡および固定および免疫染色を行うことができる場合もある文脈において有利であり得る。しかし, Fibrin 血栓を使用する制限は、機械的に損傷を与えることなく、血栓から脳を分離することはほぼ不可能です。.この制限を克服する方法としては、プラスミンでフィブリン血栓を分解する方法を開発するか、フィブリン重合を可能にするノブを模倣したペプチドを添加して血栓分解を誘導する方法を開発することができる。私たちは通常、単一細胞から200μMの長い組織までのサンプルにFibrin血栓を使用しますが、幅3mm以上の成人バンブルビーの血栓や画像脳に固定化することに成功しました。血栓中で固定化できるサンプルサイズの上限は未定である。同様に、通常は4〜5時間の固定化サンプルを画像化したが、一次培養における神経芽細胞の画像化に最大3日間成功し、血栓が少なくとも長期的な生存率を妨げないことを示した。それどころか、血栓は、この目的のために蠕動ポンプなどの装置を必要とせずに、培地の定期的な交換を容易にすることができ、より長期的なイメージングの要件である。フィブリン血栓の透過性パラメータは測定されていませんが、血栓の繊維状のゲル状の性質は、細胞透過性分子によって浸透可能であるように見えます。我々は、ラトルンクリンA、コルセミドまたは1-NAPP1、HALOタグリガンドおよび細胞生物学に使用される他の標準的な染料が問題なくフィブリン凝固体の細胞に到達し、これまでのところ血栓によって保持される分子に遭遇していないことを発見した。

結論として、Fibrin血栓を使用すると、生きたイメージングのために生体組織を固定する方法を実装する信頼性が高く、比較的容易になります。横方向漂流を制限する上での有用性を超えて、生画像中に培養培地を変化させる能力は 、D.メラノガスター 神経芽細胞21の非対称細胞分裂を研究するための我々の化学遺伝学アプローチにとって非常に貴重であることが証明された。我々は、この技術は、特に化学遺伝学または例えばタンパク質自己標識29を含む場合、さまざまな組織の広い範囲での研究に有益であると予想される。

MultiHyperStackReg マクロは、スタックの連続したフレームまたはスライスを整列する TurboReg ImageJ プラグインと、他のスタックに変換を適用できる MultiStackReg ImageJ プラグインに依存しています。MultiHyperStackRegは、単にハイパースタック(少なくとも4次元のスタック)にこれらの変換を適用することができます。MultiHyperStackRegの使用は、我々が説明しているように、多くのアクションを必要とし、非常に時間がかかる可能性があります、また、自動的にステップ6.2と6.3で説明されているすべての手順を実行するAutoHyperStackRegマクロを書きました。しかし、マルチハイパースタックレグに反して、AutoHyperStackRegは現在、このスタックのサブ領域に基づいてスタックのアライメントを計算する可能性を欠いている、我々は満足のいくアライメントのために時々重要であることがわかったオプション。AutoHyperStackReg のもう 1 つの制限は、その使用は変換に制限され、TurboReg と MultiStackReg によって提案される他の変換ではなく、MultiHyperStackReg は、ユーザーが必要とする変換型をハイパースタックに適用できるということです。今後のリリースではこれらの機能が実装され、GitHub30で利用できるようになります。最後に、私たちの回転ラインカンマクロは、皮質が時間の経過とともにその位置または向きを変更した場合でも、時間経過中の皮質信号を迅速に測定する簡単な方法を提供します。追跡モードか非トラッキングモードかは、分析に最適かは、皮質信号の品質と一貫性に依存します。トラッキングモードは、ユーザーが時間ポイントごとに皮質がどこにあるかを考慮する必要がなく、時間の経過とともに位置と向きの大きな変化に対応できるため、より使いやすくなります。しかし、皮質信号が映画全体の間に検出するのに十分な強さのままである場合にのみ適しています:皮質以外のものを検出できなかった(例えば、皮質に近い明るい細胞質コンパートメント)は、次のタイムポイントごとに検出を損なう可能性があります(例えば、細胞質コンパートメントは皮質から離れ、皮質ラインスキャンは残りの時間のためにそれを追う)。非追跡モードでは、検出がユーザーによって最初に描かれた線に限定されています(例えば、明るい細胞質コンパートメントは、検出ゾーンから離れて移動すると、皮質の位置や方向が時間の経過とともに大きく変化する場合、検出が失敗する可能性があります)。トラッキングモード用に開発される次の機能(GitHub30で利用可能)は、指定されたタイムポイントのみを分析し、(最初のタイムポイントではなく)基準タイムポイントを定義するオプションであり、その後に検出が実行され、ユーザーは少なくとも問題のあるタイムポイントを避けられるようにします。

開示事項

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

ヤヌシュケ研究所での作業は、ウェルカム信託助成金100031/Z/12/Aと1000032/Z/12/Aによってサポートされています。組織イメージング機能は、ウェルカムからの助成金WT101468によって支えられている。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アルブミンウシ血清、BSAメルク5470
D-(+)-グルコースΣG7021
ジメチルスルホキシドΣD2650
デュモン #55 鉗子ファインサイエンスツール11255-20
胎児ボビー血清、細胞培養に適したヒト
ブリノーゲンシグマF3879
FluoroDish 細胞培養ディッシュ - 35mm、23 mm ウェルワールド プレシジョン インスツルメンツFD35-100
PP1 アナログ (1NA-PP1)メルク ミリポア529579
パイレックス スポットプレート 9 つのくぼみ付きシグマCLS722085-18EA
シュナイダーの昆虫培地シグマS0146
ウシ血漿からのトロンビンメルクT4648
血漿からのシグマF7524フィ

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