ショウジョウバエ細胞におけるイン核Hi-C

サマリー

ゲノムは核空間内で異なる構造に編成され、染色体立体構造の捕捉技術によって明らかにすることができる。核内Hi-C法は、ショウジョウバエ細胞株におけるクロマチン相互作用のゲノム全体のコレクションを提供し、制限フラグメントレベルでメガベース解像度で探索できる接触マップを生成する。

要約

ゲノムは、ドメイン間の相互作用を分離する境界によって区切られたトポロジカルに関連付けられたドメイン(TAD)に編成される。ショウジョウバエでは、TADの形成と境界の根底にあるメカニズムはまだ調査中です。ここで説明する核内Hi-C法の適用は 、ノッチ 遺伝子を単離するTAD境界における建築タンパク質(AP)結合部位の機能を解剖するのに役立った。APの損失を引き起こすドメイン境界の遺伝子改変は、TAD融合、転写欠陥、および長距離トポロジカル変化をもたらす。これらの結果は、ショウジョウバエにおけるドメイン境界形成および遺伝子発現制御に対する遺伝要素の寄与を示す証拠を提供した。ここでは、核内Hi-C法について詳細に説明し、これはプロトコルと共に実験の品質を評価するための重要なチェックポイントを提供する。また、異なるゲノムスケールでゲノム相互作用を分析するために必要なシーケンシング読み取り数と有効なHi-Cペアも示されています。CRISPR/Cas9は、この核内Hi-Cプロトコルを用いたゲノム相互作用の調節要素の遺伝子編集と高解像度プロファイリングを、遺伝的要素の構造機能の調査のための強力な組み合わせとなり得る。

概要

真核生物では、ゲノム^は第1相間の核空間内の特定の領域を占める染色体に分割される。染色体を形成するクロマチンは、転写的に寛容であるアクセス可能なクロマチンの1つと、転写的に抑制的なコンパクトクロマチンの2つの主要な状態に分けることができます。これらのクロマチン状態は、核空間で分離し、めったに混ざらず、核²に2つの異なるコンパートメントを形成する。サブメガベーススケールでは、境界は、染色体組織^3、4、5をマークするTADと呼ばれる高周波クロマチン相互作用のドメイン^を分離します。哺乳類では、TAD境界は、凝集およびCCCTC結合因子(CTCF)6、7、8によって占め^られます。凝集複合体は、安定したクロマチンループ9、10、13、14を形成するためにゲノム配列において収束配向で配置されたCTCF結合部位においてクロマチンを押し出し

プロトコル

1. 固定

1. 1000万のシュナイダーのライン2プラス(S2R+)細胞から始め、室温(RT)で10%のウシ胎児血清(FBS)を含むシュナイダー培地で17.5mLの細胞懸濁液を調製する。
2. メタノールフリーホルムアルデヒドを添加し、2%の最終濃度を得る。RTで10分間混ぜてインキュベートし、毎分混ぜるように注意してください。
   注意:ホルムアルデヒドは有害な化学物質です。適切な安全衛生規則に従い、ヒュームフードで作業してください。
3. グリシンを加えて反応を焼き付け、0.125Mの最終濃度を達成し、混合する。RTで5分間インキュベートし、氷の上で15分間インキュベートします。
4. 遠心分離機 400 × G RT で 5 分間、4 °C で 10 分間;上清を捨てる25 mLの冷たいリン酸緩衝生理食塩分でペレットを慎重に再懸濁します。
5. 400×gで400gで4°Cで10分間遠心し、上清を捨てます。
   注: プロトコルを続行する場合は、手順 2.1 に進み、lysis を使用します。それ以外の場合は、ペレットを液体_N2 にフラッシュフリーズし、ペレットを-80°Cに保存します。

2. リシス

1. 氷冷ライシスバッファー(10 mM Tris-HCl、pH 8;非イオン界面活性剤の0.2%)(

結果

以下に、Hi-C プロトコルが正常に機能した結果を示します (図 1Aの Hi-C プロトコル ワークフローの概要を参照してください)。核のHi-C実験の間にはいくつかの品質管理のチェックポイントがある。サンプルアリコートは、(UD)および(D)後に、結紮後(L)と同様にクロマチン制限ステップを回収した。架橋を逆転させ、DNAを精製し、アガロースゲル上で動かした。Mbo Iとの制限が成功した場合、200-1000 bpのスミアが観察された(図1B)。分子の予想サイズは、選択した制限酵素に依存する。ライゲーションが成功した場合、ゲルの上部に高分子量帯が見られた(図1B)。消化効率は、プロトコルに詳述するqPCRによっても確認することができる。許容可能な消化効率は80%以上である(図1C)。

Hi-Cライゲーション効率を詳細に評価するために、プライマ.......

ディスカッション

ここで提示される核中のHi-C法は、ショウジョウバエゲノムトポロジーの詳細な探索を高解像度で可能にし、プロモーターおよびエンハンサーなどの調節要素間のクロマチンループからTADおよび大きなコンパートメント識別²⁵までの異なるゲノムスケールでのゲノム相互作用の図を提供する。同じ技術は、いくつかの修飾³³を有する哺乳類組織にも効率的に適用されている。例えば、単細胞懸濁液の代わりに組織を処理する場合、組織は70μmのフィルターを通してふるいにかけ、そしてDounceホモジナイザーを使用して材料を均質化しながら、リシスステップを行う。さらに、哺乳類のゲノムがショウジョウバエゲノムより25倍大きいほど、1~5kbの分解能マトリックスを構築するのに必要な有効な読み取りペアの数が多くなります。核内Hi-C法は、結紮前65°Cで1%SDSを有する核ライシスの回避において、元のHi-C法²とは異なり、したがって核完全性を維持し、7mLの代わりに1mLで結紮することにより

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
16%(vol / vol)パラホルムアルデヒド溶液	寒天科学	R1026
ビオチン-14-dATP	Invitrogen	CA1524-016
ClaI酵素	NEB	R0197S
COVARIS 超音波装置	Covaris	LE220-M220
カットスマート	NEB	B72002S
ダルベッコの修正イーグル培地(DMEM) 1x	Life Technologies	41965-039
Dynabeads MyOne ストレプタビジン C1	Invitrogen	65002
ウシ胎児血清 (FBS) 滅菌フィルター	Sigma	F9665
Klenow Dna PolI ラージフラグメント	NEB	M0210L
Klenow exo(-)	NEB	M0210S
Ligation Buffer	NEB	B020S
MboI酵素	NEB	R0147M
NP40-Igepal	SIGMA	CA-420	溶解緩衝液に添加する非イオン性界面活性剤 PE
アダプター 1.0	イルミナ	5'-P-GATCGGAAGAGCGGTTCAGCAG GAATGCCGAG-3'PE
アダプター 2.0	イルミナ	5'-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT CTTCCGATCT-3'PE
PCRプライマー 1.0	Illumina	5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACACTCTTTCCCTACACGAG CTCTTCCGATCT-3'PE
PCR プライマー 2.0	Illumina	5'-CAAGCAGAAGACGGCATCGAG ATCGGTCTCGGCATTCCTGCTGA ACCGCTCTTCCGATCT-3'Phenol
: Chloroform:Isoamyl Alcohol 25:24:1	SIGMA	P2069
Primer 1 (既知の相互作用、図)2A)	Sigma	5'-TCGCGGTAATTTTGCGTTTGA-3'Primer
2 (既知の相互作用、図 2A)	Sigma	5'-CCTCCCTGCCAAACGTTTT-3'Protease
inhibitor カクテル錠	Roche	4693132001
Proteinase K	Roche	3115879001
	Qubit ThermoFisher	Q33327
RNAse	Roche	10109142001
SPRI ビーズ	Beckman	B23318
T4 DNAリガーゼ	Invitrogen	15224-025
T4 DNAポリメラーゼ	NEB	M0203S
T4ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)	NEB	M0201L
TaqPhusion	NEB	M0530S	DNAポリメラーゼ
Triton X-100			SDSの消光のための非イオン性界面活性剤