単純ヘルペスウイルス-1抗ウイルス薬の有効性を研究するブタ角膜組織外植

眼感染症に罹患している人は、しばしば視力低下¹を起こします。世界的に高い血清威容性を持つHSV感染者は、角膜瘢痕化、間質角膜炎および新血管新生症^に至る眼感染症の再発に苦しむ^{2、3、4、5。}HSV感染はまた、より少ない頻度を引き起こすことが示されている、免疫不全の間で重篤な状態の範囲、脳炎および全身性罹患率^6、7、8のような未治療の患者。アシクロビル(ACV)およびそのヌクレオシド類似体のような薬物は、HSV-1感染を抑制し、再活性化を制御することに一貫した成功を示していますが、これらの薬物の長期使用は腎不全、胎児の異常および進化するウイルス株^{9、10、11、12、13}に対する薬剤耐性の出現を制限する失敗に関連している。HSV-1眼感染症に関連する複合体は、マウスまたはウサギの眼感染症を用いてヒト角膜細胞の単層および3D培養物および生体内でのインビトロで以前に研究されてきた。これらのin vitroモデルはHSV-1感染の細胞生物学的構成要素に関する重要なデータを提供するが、しかし、角膜組織の複雑な複雑さを模倣できず、ウイルス¹⁴の樹状拡散を照らすことはほとんどしない。対照的に、in vivoシステムは、HSV-1感染中に角膜および免疫活性化応答で感染が広がっていることを示す上でより洞察力があるが、実験を見落とすために訓練を受けた研究者と動物ケアのための大規模な施設が必要であるという警告が付属している。

ここでは、HSV-1感染誘発創傷系を調べるために、ブタ角膜をex vivoモデルとして使用します。特定の薬物の潜在的な薬理学だけでなく、感染によって引き起こされる創傷系の細胞および分子生物学の両方を組織外植物培養を通じて研究することができる。このモデルは、他のウイルスおよび細菌感染の使用についても修正される可能性があります。本研究では、ブタコーンネを用い、前臨床小分子BX795の抗ウイルス効果を試験した。ブタの角膜の使用は、アクセスの容易さと費用対効果のために好まれました。さらに、ブタ角膜モデルは、角膜が単離しやすく、感染および可視化のために十分な大きさで^、15を処理するための堅牢な人間の目の良いモデルです。ブタ角膜はまた、トランス角膜透過性および全身吸収¹⁵の両方におけるヒト角膜モデルの複雑さに匹敵する。このモデルを用いて研究を行うことで、HsV-1ウイルス感染の有能な阻害剤としてBX795がさらなる調査に値する方法を解明し、それを潜在的な低分子抗ウイルス化合物¹⁶として分類する文献に加えた。

この研究で使用されるすべてのブタ組織は、第三者の民間組織によって提供され、動物の取り扱いのいずれもイリノイ大学シカゴ校の職員によって行われませんでした。

1. 材料

1. 試薬
   1. プラークアッセイの試薬として、パウダーメチルセルロース、ダルベッコの改変ワシ培地(DMEM)、ウシ胎児血清(FBS)、ペニシリン、ストレプトマイシン(P/S)を使用してプラークアッセイを行います。
   2. プラークアッセイ用の結晶紫色溶液を調製するために、クリスタルバイオレット錠剤とエタノール(分子生物学グレード)を使用してください。
2. ベロ細胞増殖培地 - DMEM全メディア
   1. DMEMメディアボトルを組織培養フードの内側に開きます。血清ピペットを使用してボトルから55mLの培地を取り出し、捨てます。50 mLのP/SのFBSをDMEMに加えます。4°Cで冷蔵する。
3. プラークアッセイ媒体 - メチルセルロース培地の在庫5%
   1. メチルセルロース粉末の2.5gを、500 mLガラス瓶内の攪拌磁石で測定し、オートクレーブします。ボトルが室温まで冷却した後、50 mLのFBSと5mLのP/Sを含むDMEM全体の培地を500mLとし、メチルセルロースを含むガラス瓶に加えます。
   2. 磁気攪拌機を使用して、これを4°Cで2日間撹拌します。4°Cで冷蔵する。
4. 切除されたブタ角膜の培地調製
   1. ティッシュ培養フードの中に最低限必要なメディア(MEM)ボトルを開きます。血清学的ピペットを使用してボトルからMEMの10 mLを捨てます。
   2. 培地に5mLのインスリントランスフェリンセレン(ITS)と抗ミキサンク抗菌剤(AA)5 mLを加え、4°Cで冷蔵します。
5. クリスタルバイオレットのマスターと作業ストック:
   1. 水晶紫色のストック液を作るために、水に20%エタノールの100 mLに1gの水晶紫色粉末を加えます。このストック(1%w/vクリスタルバイオレット)は、暗い場所に保管すると最長1年間保存して使用できます。
   2. この中から作業ストックを作るために、350 mLの水に50mLのオリジナルストック液を加えます。この溶液に100mLのエタノールを加えた場合、500 mLの働く結晶バイオレット溶液(0.1%w/v水晶紫色)を作ります。
      注: これらのソリューションはどちらも暗闇の中に保存する必要があります。

2. 手順

1. 目全体からの豚の角膜の分離¹⁷
   1. 適切なベンダーからブタの目を受け取った後、 図1に示すようにティッシュ処理に遅れがある場合は氷の上に保管する。
   2. この手順では、個人の保護機器を使用して、汚染や、膜炎のユーモアのこぼれによる事故を避けてください。
   3. 作業領域に70%エタノールをスプレーして、洗浄し、消毒します。作業スペースが安定していることを確認するには、ベンチカバーを広げ、テープを側面にしっかりと広げて 、図2に示すようにします。
   4. ガーゼにブタの目を置く(図3)。50mmガーゼを使用して、図4Bに示すようにブタの目の後部(図4A)を片手で保持します。
   5. 30G針で、目の上皮表面の中心を丁寧に1本軽く突き刺し、間質に損傷がないことを確認する(図5)。間質の関与を避けるために、ポークは上皮(〜100〜200 μm)に限定する必要があります。
   6. 鋭い滅菌ブレードを使用して、角膜から1mmの距離でスクレラに小さな切開を行います。角膜の縁を切り、手の素早く滑らかな回転作用を使用して、膜炎のユーモアが漏らないようにします(図6A)。角膜スクレーラエッジを平坦なトゥイザーで保持することにより、ブレードを使用して残りのテザリング膜を切断する(図6B)。
   7. 角膜を取り、角膜培地の2 mLを重ねた12ウェルプレートに入れ.角膜は、図7A-D、 図8の一連のステップで示され、上を向けて配置する必要があります。
   8. 角膜表面のデブリ部位に、17 GFPの5 x 10⁵ プラーク形成ユニット(PFU)を含むウイルス溶液5μLを加えます。感染したブタの角膜を含む12ウェルプレートを、5%の_CO2 を72時間インキュベーターに入れる。
   9. 10%漂白剤で実験に使用されていない追加の目をスプレーし、バイオハザードバッグにしっかりと配置します。
2. 視覚化
   注:ウイルスは、薬物の添加前に毎日視覚化する必要があります。
   1. ステレオ顕微鏡とLED光源をオンにし、角膜をイメージングする前に機械のランプをウォームアップさせます。慎重に溶液を乱すことなく、インストルメントに角膜のプレートを運びます。GFP(380-460 nm)を使用して検体を見るようにフィルターを変更します。画像をキャプチャするには、露出時間を 500 ミリ秒に設定します。
   2. まず、角膜板をステレオスコープの下に置き、7.5倍の最も低い倍率で画像をキャプチャします。すべてのウイルスの広がりと樹状突起の形成が明確に視覚化されるような一連の拡大画像(例えば、15x、25x、35x)でこれをフォローアップ
   3. 感染した角膜を組織培養器に戻し、撮影したすべての画像を保存してください。
3. ウイルス感染定量
   注:ブタの角膜からのウイルス力価は、薬物治療の効果を分析するために毎日評価されるべきである。
   1. ウイルスを定量化するために、この実験で行われた6ウェルプレートを使用する場合、ウェルあたり5 x 10⁵ の細胞の密度でVero細胞をシードします。感染の前日にこれを行います.メッキされた細胞を一晩インキュベートして、ウイルス定量に合流していることを確認します。
   2. アリコート500 μLの血清フリー培地を複数のマイクロ遠心チューブに入れ.無菌綿の先端綿棒を無血清培地充填チューブに挿入します。綿棒は、使用前に少なくとも5分間浸漬し、湿潤する必要があります。
   3. 基礎となる媒体を妨げることなく、感染したブタの角膜板をバイオセーフティキャビネットに輸送する。湿った綿棒を使用して、過剰な圧力をかけることなく、感染したブタの角膜の中心から直径5mmで3回転を時計回りに、3回転を反時計回りにします。
   4. 綿棒を無血清培地に挿入し、マイクロ遠心チューブを充填し、時計回りと反時計回りに5回回転させます。綿棒の金属先端はマイクロ遠心チューブに完全に収まり、蓋を閉じることができるように短く切る必要があります。
   5. 綿棒の先端を含むマイクロ遠心チューブを渦マシンに、渦を高速で1分間に置きます。
   6. これらのサンプルにプラークアッセイを介してウイルス定量を行う。
      注: この定量化ステップは、2日目、4日目、および必要に応じて感染後6日間に実行する必要があります。
4. プラークアッセイによるウイルス定量
   注:プラークアッセイを実行するには、ベロ細胞を6ウェルプレートに成長させ、プレートし、アッセイ開始前に細胞の90%の合流性を確保します。これらの細胞のコンフルエント75 cm² フラスコを使用してください。以下のすべてのステップは、バイオセーフティキャビネット内で実行する必要があります。
   1. 培養液を吸引した後、新鮮なリン酸緩衝液生理食塩水(PBS)の10 mLでフラスコ中のベロ細胞のコンフルエント単層を洗浄する。洗浄液の最初のセットを吸引した後、PBSで再度洗浄ステップを繰り返します。
   2. セル単層に0.05%トリプシンの1 mLを加えます。フラスコを37°Cで5分間インキュベートします。肉眼で、フラスコの内側表面から細胞が切り離されていることを確認します。ない場合は、フラスコを再び調べる前に、さらに5分待ちます。細胞が剥離しているように見える場合は、1層に9mLのメディアを加え、フラスコ表面から細胞が完全に外れ出るようにします。
   3. フラスコから全ての細胞をメディア全体と一緒に集め、15 mL遠心分離管に入れる。
   4. プラークアッセイに使用される6つのウェルプレートのウェルごとに、遠心チューブから300 μLを使用してください。6ウェルプレートの各ウェルを2mLのメディアで上に上げなさい。プレートをインキュベーターに一晩放置して、成長し、各井戸にコンフルエント単層を形成できるようにします。
   5. プラークアッセイを行うためには、ウイルスの定量化前にサンプルを連続希釈する必要があります。
   6. ^10-8の希釈に達するまで血清遊離培地を用いてマイクロ遠心管内でウイルスの丸11倍希釈を行う。^10-3希釈時に、希釈液の1mLを、6ウェルプレートから細胞上の増殖培地を吸引した後のめっき細胞の単層に移し、これが感染工程となる。感染したプレートを37°Cインキュベーターで2時間インキュベートする。
   7. 既存の感染媒体を吸引し、PBSで2回静かに洗浄して細胞をコーティングし、メチルセルロースを含む培地を6つのウェルすべてに2mL添加する。72時間またはプラークの形成が見られるまでインキュベート。プラークは、細胞単層内の細胞間の小さな隙間の形成によって同定することができる。
   8. 各ウェルの隅に1mLのメタノールをゆっくりと加え、壁を導く先端として使用します。室温で6ウェルプレートを15分間インキュベートします。細胞単層を乱したり攪拌したりすることなく、プレートから各ウェルの内容物をゆっくりと吸引する。
   9. 6ウェルプレートのウェルに1mLの結晶バイオレット加工液を加え、すべての細胞が覆われていることを確認します。暗闇の中で6ウェルプレートを30分間インキュベートします。水晶の紫色溶液を吸引して捨て、吸収性紙の上でウェルを乾燥させます。
   10. 開始溶液中のウイルス総量を定量化するために、最も高い希釈ウェルでプラークの数を数えます。このプロセスを2回繰り返して、ウイルスの引き機を確認します。

実験的な抗ウイルス薬の有効性を理解するには、生体内ヒト臨床試験のために送られる前に、広範囲にテストする必要があります。この点に関して、正の対照、陰性対照および試験群を同定しなければならない。トリフルオロチミジン(TFT)は、長い間、角膜炎を局所的に治療するための好ましい治療法として使用されてきた。陽性対照として使用され、TFT処置された角膜基は、より低い感染広がりを示す。陰性対照として、PBSに溶解したDMSOまたは車両制御を用いた。BX795は、実験前臨床薬を試験群であった。各グループに合計4つの角膜が割り当てられ、薬物は豚の角膜に毎日3回添加された。立体蛍光イメージングを用いた我々の結果は、BX795の抗ウイルス効果が、ウイルス拡散を制御するTFTと類似していることを示している。我々の研究におけるウイルスの広がりは、ステレオスコープ内の緑色蛍光チャネルを画像化することによって可視化することができる。我々は、負の対照群角膜のみを治療した車両が最初のウイルス接種後6日までに中央感染領域からその周辺にウイルスが広がっていることを観察したが、両方の薬物(BX795およびTFT)は4日目から6日目の画像(図9A)で感染をクリアした。同様に、感染後2日目と4日目に採取した眼綿棒は、陽性対照およびBX795処理サンプルにおけるウイルスの完全な阻害を示し、一方で感染性ウイルス力素の急激な増加が陰性対照群で観察される(図9B)。

図1: 豚の目は、組織が処理されるまで氷の上に留めてお きます。

図2:ワークベンチのセットアップ。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:ガーゼにポータシの目を置く。この図のより大きなバージョンを見るにはここをクリックしてください。

図4:30G針の豚目を撮影した。 この図の大きなバージョンを見るにはここをクリックしてください。

図5:30 G針を使用し、上皮表面の中心に穴を開けます 。

図6:鋭い滅菌ブレード(A,B)を使用して角膜縁の周りを切り取るために使用される回転アクションは、この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図7: コルネア画像(A,B) 角膜は最終的に鋭いはさみを使用してカット(C)単離角膜はピンセット(D)完全に単離した角膜によって保持され、使用の準備は、 この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図8:コルネアスを12ウェルプレートに入れ、72時間インキュベートした。

図9:感染過程でのウイルスの広がりの進行 切除したばかりのブタの角膜は、2日目、4日目、6日目の感染後に顕微鏡を用いてHSV-1 17-GFPおよび(A)画像化に感染した。DMSO、TFTまたはBX795による局所治療は、2日目の感染後に開始された。(B)プラークアッセイは、ベロ細胞上のブタ角膜から採取した綿棒を用いて行った。治療群間の有意な違いを理解するために、双方向ANOVA試験を実施した。n=4、 ****p=0.0001。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

著者らは、利益相反や競合する財政的利益を宣言していない。