患者由来腫瘍オルガノイドを用いたイン ビトロ アッセイのハイスループット

ヒトがん細胞株は、がんの生物学を研究し、抗がん剤を評価するために広く受け入れられています。しかし、これらの細胞株は、それらの形態、遺伝子変異、および遺伝子発現プロファイルが長期間にわたって培養中に変化する可能性があるため、必ずしもそれらの元の組織の元の特性を維持する必要はありません。さらに、これらの細胞株の大部分は、単層で培養されるか、またはマウス異種移植片として使用され、いずれも腫瘍組織^1、2を物理的に表していない。したがって、抗癌剤の臨床有効性は、癌細胞株で観察されたものと同じではないかもしれない。そこで、患者由来の腫瘍異種移植片や患者由来の腫瘍オルガノイド(PPO)や腫瘍組織の構造や機能を正確に再現する腫瘍スフェロイドモデルを用いたex vivoアッセイなどのインビトロシステムが開発されている。証拠の増加は、これらのモデルが対応する癌組織に直接匹敵することによって抗癌剤に対する患者の反応を予測することを示唆している。これらのin vitroシステムは、異なる腫瘍組織タイプに対して確立されており、薬物スクリーニング用の関連高スループットアッセイシステム(HTS)^{も3、4、5、6、7}に開発されている。患者または患者由来腫瘍異種移植片から得られた原発性腫瘍の異種ex vivoオルガノイド培養は、培養の容易さと、間質組織^8、9、10における細胞の複雑さを維持する能力のために、近年かなりの牽引力を得ている。これらのモデルは、がんの生物学の理解を深め、インビトロでの薬物有効性の評価を促進することが期待されます。

最近、福島トランスレーショナル研究プロジェクトの下で、F-PDOに指定されたさまざまな種類の腫瘍組織から一連の新しいPDOが作成されました。PPOは、ソース腫瘍と同様の形態を有する大細胞クラスターを形成し、6ヶ月以上^{培養することができる11。}比較組織学と包括的な遺伝子発現解析は、PPOの特徴が、培養条件下で長期増殖した後でさえ、その源腫瘍組織の特徴に近いことを示した。さらに、96ウェルおよび384ウェルプレートのPDOの種類ごとに適切なHTSが確立されました。これらのアッセイは、いくつかの分子標的剤および抗体を評価するために使用した。ここでは、子宮内膜癌に用いられる標準的な化学療法薬(パクリタキセルおよびカルボプラチン)を、パクリタキセルおよびカルボプラチンに反応しなかった患者由来のF-PDOを用いて評価した。したがって、このPDOに対するパクリタキセルおよびカルボプラチンの細胞増殖阻害活性は弱かった_(IC50:>10μM)。さらに、以前の研究では、化学療法薬および分子標的剤に対するいくつかのF-PPOの感受性が臨床有効性^11、12、13と一致することが報告されている。最後に、抗癌剤によって引き起こされるPPOの高次構造の変化を、3次元細胞分析システム^12,13を用いて分析した。PDOベースのHTSを用いた抗癌剤の評価の結果は、これらの薬剤について得られた臨床結果と同等である。ここでは、PDOモデルを用いて抗がん剤および免疫療法の効力を評価するために使用できる、より単純で正確なHTSのためのプロトコルが提示される。

ヒト由来物質に関する実験はすべてヘルシンキ宣言の下で行われ、福島医科大学倫理委員会によって事前に承認されました(承認番号1953年と2192年、承認日は2020年3月18日、2016年5月26日)。書面によるインフォームド・コンセントは、本研究で使用された臨床標本を提供したすべての患者から得られた。

1. PPOの文化

注: F-PPO は、さまざまな異種形態を示し、懸濁液培養で増殖する細胞クラスターを形成します (図 1)。さらに、F-PPOは6ヶ月以上培養することができ、将来の使用のために凍結保存することができる。

1. 保存されたPPOの解凍(0日目)
   1. 0日目の解凍および種子PPO(例えば、RLUN007、肺腺癌)(図1)。まず、B-27サプリメントの1%を含むPPO用培地の培地15mL( 材料表参照)を加え、表皮成長因子の30ng/mLを無菌50 mL遠心チューブに加えます。
   2. 液体窒素貯蔵から凍結バイアルを取り除いた後、37°Cの水浴でPPOを2分間静かに攪拌する。次に、水浴からバイアルを取り出し、70%エタノールでバイアルを拭き取り、バイアルを生物学的安全キャビネットに移動させます。
   3. PPO用の15mLの培地を含むチューブにバイアルの内容物を移します。PPOとミディアムを3mLトランスファーピペットで5回軽くピペットで混ぜます。チューブを200xgで3分間~25°Cで遠心し、上清を捨てます。 PDOペレットを5mLの新鮮な培地に再び懸濁し、穏やかなピペットで25cm²フラスコ(材料表を参照)に移します。最後に、PTOを_5%CO2で37°Cで培養する。
2. 週に 2 回 (日 3 から 7) のメディアを変更します。PDO懸濁液を遠心分離して細胞クラスターを沈殿させ、培地の4mL(体積80%)に置き換える。新鮮な培地の細胞を再中断します。
   メモ:RLUN007の大部分は、直径100~500μmのセルクラスタとして表示されます。図 1Aに示すように、培地中のフェノール赤の色が黄色に変わると、より頻繁に培地を交換してください。交換の日に媒体が黄色に変わり、各セルクラスタが合流して直径500μm >の大きなクラスタを形成する場合、1:2の分割比で通過します。
3. PPOのサブカルチャー(日8-28)
   注:実際に単一細胞数を測定することの難しさを考えると、通過のタイミングは、適切な細胞クラスター密度と遠心分離後のPDOペレットのサイズに基づいて決定されます(図1B)。RLUN007の場合、PDOペレットの体積は解凍後約2週間で30μL(25cm2フラスコの飽和密度)に達します。
   1. 25cm²フラスコ(P1)を2本の2本のフラスコ(P1)に移す場合は、PDO懸濁液を遠心管に移し、200xgで遠心分離機を200xgで約25°Cで2分間移動します。 PDOペレットの体積を推定し、上清を捨てます。5 mL ピペットを使用して PDO ペレットを 5 mL の新鮮な培地で再懸濁します。ピペットは低速で5回優しく上下します。次に、PDO懸濁液(2.5mL)の体積の半分を2つのフラスコに移し、各フラスコに2.5mLの新鮮な培地を加えます。細胞を5%CO2で37°Cで培養する。
   2. 2つの25cm²フラスコから1つの75cm²フラスコ(P2)への移管のために、2つのフラスコからのPDO懸濁液を2つの遠心管に移し、PDOを200 x gで約25°Cで2分間遠心分離する。 次に、PDOペレットの体積を推定し、ペレットを2.5mLの新鮮な培地(チューブ当たり)で再懸濁する。その後、PDO懸濁液を一方のチューブと他方のチューブに組み合わせ、10mLの新鮮な培地を含む^75cm2フラスコに移します。細胞を5%CO2で37°Cで培養する。サブ培養PPOを2つの25cm²フラスコから、最初の通路の約1週間後に1つの75cm²フラスコに移す(図1C)。

2. 成長阻害 HTS

注: PPOに対する抗癌剤の増殖抑制活性は、 図2に示すように、細胞内ATP含有量を測定することによって評価される。このステップは、市販の細胞生存アッセイキットを使用して実行されます( 材料表を参照)。

1. 0日目に、PPO(RLUN007など)をフラスコで培養し、アッセイに十分な数の細胞クラスターが利用できるようになるまで行います。1日前に、PDO懸濁液を75cm2フラスコから15mLチューブに移し、遠心分離機を200xgで2分間移し、PDOペレットの体積を測定します。 次に、PDOペレットを15mLの新鮮な培地に再び懸濁し、75cm2フラスコに戻します。細胞を5%CO2で37°Cで培養する。
   注:必要なPDOペレットの量は、PDOの希釈速度とアッセイに使用される384ウェルプレートの数によって異なります。RLUN007では、384ウェルプレート10個にシードするために200μLのセルペレット体積が必要です。
2. 1日目(培地交換後24時間)に、70μmメッシュフィルタを含むフィルタホルダーを使用して、細胞の断片化および分散装置( 表を参照)を使用してPPOをミンチします。次いで、PDO懸濁液の15mLを10倍希釈した。PDO懸濁液のシード40 μLを、セルサスペンションディスペンサーを使用して384ウェル超低添付スフェロイド(丸底)マイクロプレート( 材料表を参照)に入れます( 材料表を参照)。
   注: 細胞クラスターを細かく刻む場合は、市販のセルの断片化および分散装置を使用することをお勧めします( 資料表を参照)。
3. 播種後の24時間(2日目)に、PPOを0.04 μLのテスト剤溶液で、液体ハンドラを使用して20μM〜1.0 nM(10シリアル希釈)の最終濃度範囲で液体処理器を使用して処理します( 材料表を参照)。
4. 8日目(被験物質処理後144時間)に、細胞内ATP測定試薬を試験井戸に添加する。ミキサーでプレートを混ぜ、25°Cで10分間インキュベートします。 プレートリーダーを使用して、細胞内ATP含有量を発光として測定します( 材料表を参照)。
5. セルの生存率を計算するには、テスト井戸の ATP の量を、車両を含む制御井戸の量で、背景を減算して除算します。6日間にわたる成長率を計算するには、シーディング後24時間の車両制御井戸での車両制御井戸内のATP量を除算する。
6. 生物学的データ解析ソフトウェアを用いて、線量応答曲線から50%の阻害濃度(IC₅₀₎および曲線下面積(AUC)値を計算する(材料表参照)。Z ファクターは、1 (無限分離) から <0 までの範囲の無次元パラメータで、z = "1" - (3σc+ + 3σc-) >(c-c-コントロール)の標準偏差(σ)と平均(μ)です。

3. 細胞の摘出と成長抑制のためのイメージングシステムを備えたHTS

注:プロトコル2を使用してデータに大きな偏差がある場合(アッセイ時の変動係数[CV]が20%を超える場合)、選択されたサイズのPPOは、セルピッキングおよびイメージングシステムを使用して96ウェルまたは384ウェルプレートに播種することができます(図2)。このプロトコルは、前のセクションのステップ 2.1 および 2.2 で説明したものと同じです。このステップは、市販のセルピッキングおよびイメージングシステムを使用して実行されます( 表の材料参照)。

1. 1日目には、40 μLの培地/ウェルの投射先プレートを持つ384ウェル超低接続スフェロイドマイクロプレートと、セルピッキングおよびイメージングシステムのデスティネーションプレートをセットします。
2. 6 mLの培養培地と遠心分離機を1,500 x gで6 mLで、気泡を除去するために、ピッキングチャンバー(材料表を参照)を充填します。培地に懸濁したPDO(PDOペレット容量、4μL)をピッキングチャンバーに追加し、システムにセットします。
3. セルクラスターがチャンバーの底に落ち着くように、少なくとも1分間チャンバーを立て、その後分散液を続ける。その後、チャンバーのスキャンを実行します。
4. セルクラスタの自動選択を行うシステムで、ピッキングサイズを140-160 μm(面積15,386-20,000 μm²⁾に設定します。次に、スキャンした画像上の選択したセルクラスターの品質を確認し、選択チップ(「材料表」を参照)を使用して、ウェルごとに 10 個のセル クラスターを宛先プレートに転送します。
5. 手順 2.3 以降のプロトコルステップを実行します。

4. HTS抗体依存性細胞傷害性

メモ:このステップは、電気インピーダンス測定器である市販 のシステム(材料表を参照)を使用して実行されます。モノクローナル抗体およびナチュラルキラー(NK)細胞を用いた抗体依存性細胞傷害(ADCC)によるPTOの細胞化を評価するために使用される(図3)。NK細胞は、メーカーの指示に従って、NK細胞製造キット( 材料表を参照)を用いて末梢血単核細胞から作製されます。

1. ADCC活性の測定
   1. 0日目には、96ウェルプレート( 材料表を参照)に50 μLの10 μg/mLフィブロネクチン溶液(0.5 μg/well)を一晩4°Cでコーティングします。
   2. 1日目に、フィブロネクチン溶液を除去した後、50μLの培養培地を各ウェルに加えて、バックグラウンドインピーダンスを測定する。
   3. 播種する前に、5 mLの細胞培養解離試薬(材料表を参照)をPDO(RLUN007:75cm2フラスコのPDOペレット100μL)に加え_、CO2インキュベーターを37°Cでインキュベートして20分間培養してPDOを分散させます。トリプシンを止めるには、5 mLの培地、遠心分離機を加え、解離試薬を除去します。40 μmのセルストレーナーを通して新鮮な培地とフィルターでPPOをリンスします(材料表を参照)。
   4. 細胞生存率分析器を使用してセルの数をカウントします (「 材料表」を参照)。
   5. PDO懸濁液を貯留槽に移し、マルチチャンネルピペットを使用して混合します。PDO懸濁液を96ウェルプレートの5 x 10⁴ 細胞/ウェルのウェルに追加します。各ウェルには、100 μL の最終ボリュームが含まれています。その後、プレートを生物学的安全キャビネットに約25°Cで30分間置きます。
   6. 37 °Cの_CO2 インキュベーターでプレートを器具に移します。 インピーダンス信号の変化を15分ごとにセルインデックスとして記録します。
   7. PDO播種と同じ日に37°Cの水浴中のNK細胞を解凍します。バイアルからNK細胞用培地10mL(材料表参照)を含む15mLチューブに細胞を移し、遠心分離機を約25°Cで5分間300xgで移動します。 上清を捨て、新鮮な培地の10mLで細胞ペレットを再懸濁します。セルカウント後、細胞密度を1 x 10⁶セル/mLに調整し、75cm²フラスコに移します。NK細胞を37°Cで_5%CO2インキュベーターで培養する。
   8. 2日目に、滅菌V-底96ウェルプレートの最終濃度の10倍の抗体溶液(リン酸緩衝生理食塩基)を調製します。
   9. 各ウェルから60 μLの培地を取り出し、10 μLのトラスツズマブまたはセツキシマブ溶液(10 μg/mL、1 μg/mL、0.1 μg/mL)をPDUに加えます。プレートをインキュベーターの計器に戻し、セルインデックスを1時間記録します。
   10. NK細胞懸濁液を50mLチューブに移し、セル数を数えます。細胞を5分間300 x g で遠心分離し、PDOs用の培地でNK細胞密度を1 x 10⁶ 細胞/mL、2 x 10⁶ 細胞/mLに調整します。
   11. ターゲット(RLUN007)セル比1:1または2:1のエフェクター(NK)セルに50μLのNK細胞懸濁液を加えます。抗体の最終濃度は1 μg/mL、0.1 μg/mL、0.01 μg/mLです。プレートを約25°Cで15分間保ち、プレートを器具に戻します。
2. データ収集と分析
   1. 解析ソフトウェアを使用してセルインデックスを%細胞分析値に変換します( 材料表を参照)。
   2. 細胞化率とは、NK細胞と標的細胞(PTO)単独で殺される標的細胞の割合をコントロールとして指す。各時点でのサンプルウェルのインデックスから、NK細胞のみを含むウェルのセルインデックスを引きます。抗体の添加直前の細胞指標に各値を正規化します。次の式を使用して正規化された細胞指数を%細胞増殖率に変換します: % 細胞増殖性 = (1 - 正規化された細胞指数 [標本ウェル]) / 正規化された細胞インデックス (ターゲット単独ウェル) x 100.

抗がん剤を評価するためにPDOと384ウェルマイクロプレートを用いて高度に正確なHTSを開発し、各PDOのHTSの開発は、以前に報告された10、11、12、13。HTSの性能は、CVとZ'ファクターを計算して評価した。Z'-factorは、アッセイの品質と性能の検証のために広く受け入れられている方法であり、この値が>0.514の場合、アッセイはHTSに適している。RLUN007を用いた384ウェルプレートアッセイの制御データム点は、CV値5.8%、計算されたZ'ファクター0.83で、ほとんどばらつきを示さなかった。これらの結果は、このアッセイがHTSに対して高い性能を有することを示す。HTSを用いた抗がん剤に対するPTOの感受性を調べるには、 8つの抗癌剤で治療されたRLUN007、具体的には、表皮成長因子受容体(EGFR)阻害剤(アファチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、オシメルチニブ、ロシレチニブ)およびパクリタキセル(非小肺癌の標準的な臨床処置である)およびミトミシンクチシンを用いて増殖抑制を評価した。各PDOに対する抗癌剤のIC50およびAUC値を図4に示す。RLUN007は、すべてのEGFR阻害剤および他の抗癌剤に対して高感度(IC50<2 μM、AUC<282)を示した。すべてのデータについて計算されたシグモイド曲線は、抗癌剤の増殖抑制活性を正確に測定できることを示した。

細胞の選別およびイメージ投射システムは、上記の方法論を用いてデータが大きく異なる場合に使用される。細胞の選抜および画像化システムは、細胞クラスターを損傷することなく正確に選び、細胞クラスタサイズを整列してアッセイシステムから細胞の破片を除外することで、正確なHTSアッセイを可能にします。システムが使用されなかった場合、CV 値は 26.0% 、Z'ファクター値は 0.23 (データは表示されません) でした。しかし、CVとZファクターの値は、システムを使用してそれぞれ6.4%と0.81で改善されました。

細胞の数、形態、および付着を長期間監視する電気インピーダンス測定装置を用いて、ADCC活性を有するPTOの細胞化を調べるため、96ウェルプレート内のエフェクター細胞として抗体(トラスツズマブおよびセツキシマブ)を用いて処理したRLUN007を用いてインピーダンス信号の変化を評価した。標的細胞のみからなる対照と比較して、細胞化率は時間とともに増加した。抗体を含まないE:1(図5A,C)または2:1(図5B,D)のE:T比で6時間後に45%または75%に達した。トラスツズマブを用いたNK細胞媒介細胞増殖症は、それぞれ1:1(図5A、1μg/mL)と2:1(図5B、1μg/mL)の比率で約60%、90%であった。対照的に、セツキシマブはNK細胞介在性細胞増殖に対して用量依存的な影響を及ぼした(図5C,D)。セツキシマブの最高濃度では、RLUN007はそれぞれ1:1と2:1の比率で90%と100%で破壊されました(図5C、D)。トラスツズマブの効果はセツキシマブよりも弱く、細胞毒性はわずか60%であった。これらの結果は、PDOアッセイシステムがリアルタイムインピーダンスベースの技術を用いてADCC活性を評価できることを示している。

図1: PDO カルチャの重要なポイント (A) 媒体の色の変化。(B) PDO濃度 50-200 μLのレベルでマークされたチューブを持つ PDO を含む遠心管を裏打ちすることによりペレットサイズからのPDOの量の測定。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図2:384ウェルマイクロプレートを用いたハイスループットアッセイシステムの作成に用いたプロトコルの概要 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図3:ADCC活性のハイスループットアッセイのためのプロトコルの概要 ADCC, 抗体依存性細胞毒性;NK、ナチュラルキラー。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図4:抗がん剤による増殖抑制のためのハイスループットアッセイシステム 抗癌剤に対するRLUN007の用量応答曲線細かく取られたPPOは384ウェルプレートに播種した。これらは、抗癌剤の10の異なる濃度(10μMと1.5 nMの間)で6日間治療した。データは三重化実験の標準偏差±平均を表します。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

図5:ADCC活性に対するハイスループットアッセイ (A,B)トラスツズマブ(C,D)セツキシマブ(A,C)エフェクターセルに対するRLUN007の1:1の比率。(B,D)RLUN007の比率を持つ細胞化:エフェクターセル1:2。活性は、エフェクター細胞の添加後12時間測定した。データは、3つの反復サンプルの平均±標準偏差として提示されます。ADCCは、抗体依存性細胞毒性を示す。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

富士フイルムワコバイオソリューションズ株式会社は、ライセンス譲渡によるF-PDOおよびF-PDOメディアの商業オーナーである富士フイルムワコピュアケミカルズの子会社です。