方法論記事

ポリ無水物IL-1αナノ粒子の 生体内 抗腫瘍活性の評価

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DOI：

10.3791/62683

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2021年6月28日

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1Interdisciplinary Graduate Program in Human Toxicology, University of Iowa, 2Department of Pathology, University of Iowa, 3Department of Chemical and Biological Engineering, College of Engineering, Iowa State University, 4Nanovaccine Institute, Iowa State University, 5Division of Pharmaceutics and Translational Therapeutics, College of Pharmacy, University of Iowa, 6Holden Comprehensive Cancer Center, University of Iowa, 7Department of Oral Pathology, Radiology and Medicine, College of Dentistry, University of Iowa

この記事について

サマリー

HNSCCの同系マウスモデルにおけるIL-1αの抗腫瘍活性および関連する毒性を研究するための標準プロトコルが記載されている。

要約

サイトカイン療法は、がん患者に強力な抗腫瘍免疫応答を生み出すことができる有望な免疫療法戦略です。炎症誘発性サイトカインインターロイキン-1アルファ(IL-1α)は、いくつかの前臨床および臨床試験で抗がん剤として評価されています。しかし、インフルエンザのような症状や低血圧などの用量制限毒性は、この治療戦略への熱意を弱めています。IL-1αのポリ無水物ナノ粒子(NP)ベースの送達は、毒性副作用を低減しながら全身的にIL-1αのゆっくりと制御された放出を可能にする可能性があるため、この文脈では効果的なアプローチを表します。ここでは、頭頸部扁平上皮癌(HNSCC)同系マウスモデルにおけるIL-1α担持ポリ無水物NPsの抗腫瘍活性の解析について説明する。HPV16 E6/E7をhRASおよびルシフェラーゼ(mEERL)細胞とともに安定発現するマウス中咽頭上皮細胞をC57BL/6Jマウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍が任意の方向に3〜4 mmに達したら、1.5%IL-1aを装填した20:80の1,8-ビス(p-カルボキシフェノキシ)-3,6-ジオキサオクタン:1,6-ビス(p-カルボキシフェノキシ)ヘキサン(CPTEG:CPH)ナノ粒子(IL-1α-NP)製剤をマウス腹腔内投与しました。腫瘍の大きさおよび体重は、腫瘍の大きさまたは体重減少が安楽死基準に達するまで連続的に測定された。血液サンプルを採取して顎下静脈穿刺による抗腫瘍免疫応答を評価し、炎症性サイトカインをサイトカインマルチプレックスアッセイで測定しました。腫瘍と鼠径リンパ節を切除し、単一細胞懸濁液にホモジナイズして、マルチカラーフローサイトメトリーでさまざまな免疫細胞を分析しました。これらの標準的な方法により、研究者は抗腫瘍免疫応答と免疫刺激NPの潜在的なメカニズムを研究することができます 癌治療のための他の免疫療法剤。

概要

がん免疫療法の新たな分野の1つは、炎症性サイトカインを使用して、腫瘍細胞に対する患者の免疫系を活性化することです。いくつかの炎症誘発性サイトカイン(すなわち、インターフェロンアルファ(IFNα)、インターロイキン-2(IL-2)、およびインターロイキン-1(IL-1))は、重要な抗腫瘍免疫をマウントすることができ、サイトカインベースの薬物の抗腫瘍特性と安全性の探求に関心が寄せられています。特にインターロイキン-1α(IL-1α)は、炎症のマスターサイトカイン1として知られる炎症誘発性サイトカインである。1970年代後半にこのサイトカインが発見されて以来、化学療法の副作用を治療するための造血薬としてだけでなく、抗癌剤としても研究されてきました2。1980年代後半に、IL-1α 3,4,5,6の抗癌効果を決定するために、いくつかの前臨床および臨床試験が実施されました。これらの研究では、メラノーマ、腎細胞がん、および卵巣がんに対する組換えIL-1α(rIL-1α)の有望な抗腫瘍活性が見つかりました。ただし、発熱、吐き気、 ?? 吐、インフルエンザ様症状、および最も深刻な用量制限低血圧などの毒性が一般的に観察されました。.残念ながら、これらの用量関連毒性は、rIL-1αのさらなる臨床使用への熱意を弱めました。

IL-1α媒介毒性の重要な問題に対処するために、 表面侵食速度論によるIL-1αの制御放出を可能にするポリ無水物ナノ粒子(NP)製剤が調査されます。これらのNP製剤は、用量制限副作用を低減しながらIL−1αの抗腫瘍特性の利益を享受することを意図している7。ポリ無水物はFDA承認のポリマーであり、表面侵食によって分解し、カプセル化された薬剤のほぼゼロ次放出をもたらします8、9、10、11、12。1,8-ビス-(p-カルボキシフェノキシ)-3,6-ジオキサオクタン(CPTEG)および1,6-ビス-(p-カルボキシフェノキシ)ヘキサン(CPH)を含む両親媒性ポリ無水物コポリマーは、腫瘍学および免疫学に基づく研究において、さまざまなペイロードの優れた送達システムであると報告されています8,12。次のプロトコル20:80では、1.5重量%のrIL-1α(IL-1α-NP)を搭載したCPTEG:CPH NPを使用して、このサイトカインの抗腫瘍活性と毒性を研究します HNSCCのマウスモデル。

以下の手順の全体的な目標は、HNSCCに対するIL-1α-NPの抗腫瘍活性を評価することです。記載された手順は、腫瘍の成長および生存を評価することを含む、関心のある任意の免疫調節剤に適用することができる。これらの手順は、臨床的関連性を最大化するために、無傷の免疫系13 を有する同系マウスモデルにおいて実施されるべきである。IL-1α-NP毒性は、炎症誘発性サイトカインの循環レベルと動物の体重の変化を測定することによっても評価されます。 in vivo 薬物毒性を決定する方法はたくさんあります。しかしながら、最も広く使用されている方法は、それらの器官における器官毒性および組織学的変化についての血清酵素の測定を含む。しかしながら、組織学的分析を行うには、動物を犠牲にする必要があり、それは実験の生存曲線に影響を与えるであろう。したがって、このプロトコルは、血清サンプル中のサイトカインの測定のための生きたマウスからの血液の収集のためのプロトコルを含むであろう。収集された血清は、臓器毒性に関する任意の所望の血清分析物の測定に使用することができる。マルチカラーフローサイトメトリーは、腫瘍微小環境における免疫細胞集団の変化とリンパ節への免疫細胞の移動を理解するために使用されます。免疫組織化学および/または保存された切片の免疫蛍光を含む他の方法を利用して免疫細胞を同定することができる14。ただし、これらの手法は、多数の動物で実行するには時間がかかり、面倒な場合があります。全体として、以下の方法により、研究者は抗腫瘍免疫応答と潜在的なメカニズムを研究することができます 癌治療のための免疫刺激剤。

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プロトコル

この研究で使用されたすべての in vivo 手順は、アイオワ大学の施設内動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。

1. HNSCC細胞株の調製と維持

注:この研究では、マウス中咽頭上皮細胞株がHPV E6およびE7で安定して形質転換されました hRasおよびルシフェラーゼ(mEERL)が使用されます。この細胞株は、C57BL/6Jマウス系統から開発されたもので、Paola D. Vermeer博士(米国サウスダコタ州サウスダコタ大学サンフォード医学部外科)からの贈り物でした。

  1. mEERL細胞の凍結バイアルを予熱した(37°C)ウォーターバスで解凍し、温かい培養培地(40.5%1:1 DMEM/Hams F12、10%ウシ胎児血清[FBS]、0.1%ゲンタマイシン、0.005%ヒドロコルチゾン、0.05%トランスフェリン、0.05%インスリン、0.0014%トリヨードチロニン、および0.005%上皮成長因子を添加したダルベッコ改変イーグル培地[DMEM])に移します。
  2. コニカルチューブを277 x g で25°Cで5分間遠心分離し、培地を除去します。次に、細胞ペレットを3〜5 mLの新鮮な培地に再懸濁し、T-25細胞培養フラスコに移します。凍結保存からの最適な回収のために、高密度で細胞をプレートします。
    注:T-25フラスコはサイズが小さいため使用され、T-75フラスコと比較して細胞が近接している場合の凍結保存からの回復時間が短縮されます。
  3. 細胞を37°Cおよび5%CO2の加湿インキュベーター内で増殖させ、より大きなフラスコ(すなわち、T-75またはT-150)に増殖させ、3日ごとに継代させる。すべてのマウスに所望の移植に十分な細胞があるら、フラスコを取り出し、培地を廃棄し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で細胞を穏やかにすすぎます。次に、4 mL(T150フラスコを使用する場合)の0.25%トリプシン-EDTAを加え、37°Cで2分間インキュベートします。使用する皿/フラスコのサイズに応じて、トリプシンの量を増減します。
    注:細胞株の種類とコンフルエンシーの程度は、トリプシン処理時間に影響を与える可能性があります。トリプシン処理期間が長いと、細胞に損傷を与え、生存率が低下する可能性があります。トリプシン処理に必要な最小限の時間を使用してください。
  4. 顕微鏡下では、トリプシン処理で剥離した細胞は自由に動く。一部の細胞がまだ付着している場合は、フラスコを非常に軽くたたいて、残りの付着細胞を動員します。新しい培地(必要に応じて培地の量を増やす)を加えてトリプシン反応を停止し、細胞懸濁液を50 mLコニカルチューブに回収します。277 x g で25°Cで5分間遠心分離し、培地を除去します。
  5. 細胞を新鮮な培地に再懸濁し、細胞をカウントします。(上記のように)もう一度遠心分離し、次に細胞に冷PBSを加えて、最終濃度を10×106 細胞/ mLにします。マウスに注射する前に、細胞懸濁液を氷上に保ちます。.

2. 腫瘍移植、薬物治療、測定

注:実験動物はアイオワ大学の動物飼育施設に保管され、適切な無菌手順に従って取り扱われました。

  1. C57Bl/6Jマウスをケタミン(80 mg/kg)とキシラジン(10 mg/kg)を混合して麻酔します。電気かみそりで側面領域または目的の注射部位を慎重に剃ります。
    注意: 制度(またはその他の)規則や規制で要求されている規制物質の使用を文書化することを忘れないでください。
  2. エタノールパッドで脇腹領域を消毒し、25〜28Gのシリンジを使用して100μL(1 x 106 細胞を含む)の細胞懸濁液を皮下にゆっくりと注入する。突然の動きや細胞の損失を防ぐために、注射前にマウスを麻酔します。各注射の前に、細胞懸濁液を穏やかに混合して、細胞がバイアルまたはコニカルチューブの底に沈降するのを防ぎます。
  3. 細胞懸濁液をシリンジに取り込んだ後、上部からすべての気泡とデッドスペースを取り除きます。細胞懸濁液をゆっくりと着実に注入します。複数のマウスで同じ針を使用しないでください。偶発的な損失を考慮して、常に追加のセル懸濁液を作成してください。
  4. 動物をそれぞれのケージに入れ、麻酔から回復するまで監視します。麻酔中、動物は低体温のリスクがあります。したがって、補助的な熱を提供するか、マウスを互いに近づけて保温します(同じケージに収容されている場合)。
  5. 腫瘍が任意の方向に3 mmに達したら、治療群のマウスを(腫瘍のサイズおよび/または体重によって)ランダム化し、薬物治療を開始します。4日目と9日目に、3.75 μgのrIL-1α /マウスを含むNP15 をマウスの腹腔内(i.p.)に注射します。腫瘍の大きさまたはマウスが安楽死基準に達するまで、腫瘍体積((長さx幅2)/ 2)およびマウス体重を毎日または隔日で測定および記録する。
    注:経験豊富な研究者でも、すべてのマウスに同じサイズの腫瘍を移植することは困難です。腫瘍のサイズとマウスの体重に基づいて動物を実験グループにランダム化します。

3.採血と血清分離

注:顎下静脈からの採血は、意識のある動物や麻酔下の動物からの採血を可能にする簡単で効果的な技術です。この研究では、動物が麻酔下にあるときに動物から血液を採取しました。

  1. 上記のようにケタミン/キシラジン混合物の注射でマウスを麻酔します。
  2. 利き手ではない手を使用して肩の上の緩んだ皮膚をつかみ、下顎骨の少し後ろにある18 Gの針またはランセットで顎下静脈に穴を開けます(その領域の白い斑点)。
  3. すぐに血流を確保するために静脈を穿刺します。200〜300 μLの血液(マウスの体重によって異なります)を1.5 mLのポリプロピレン製マイクロ遠心チューブまたは血清分離チューブに収集します。採血後、出血が止まるまで穿刺部位に穏やかな圧力をかけます。マウスをそれぞれのケージに戻し、麻酔から回復するまで観察します。
    注意: 1回の収集または24時間にわたってマウスの体重の24%を超えて収集しないでください。
  4. 集めた血栓を室温で20〜30分間放置します。遠心分離の準備ができるまでチューブを氷の上に置きます。
  5. 凝固した血液を1540 x g で4°Cで15分間遠心分離します。
  6. 赤血球を乱すことなく上層(血清)を収集します。使用するまで-80°Cで保存してください。

4. 採取した血清の多重化

  1. 血清または血漿サンプルを氷上に保ちながら解凍します。
  2. サンプルを1540 x g で4°Cで5分間遠心分離して細胞破片を沈降させ、上から血清層を注意深く収集します。
  3. マルチプレックスキットを室温で取り出します。
    注:特定のサイトカイン、ケモカイン、または成長因子用に設計された市販のマルチプレックスキットがいくつかあります。また、目的のタンパク質に基づいてキットをカスタマイズすることができる。
  4. サイトカインを検出するために、製造元のプロトコルに従ってアッセイを実行します。
    注:ほとんどのマルチプレックスキットは、磁気ビーズを使用して捕捉された抗体に結合します。したがって、洗浄中は自動またはハンドヘルド磁気洗浄機を使用することが不可欠です。そうしないと、磁気ビーズがプレートから洗い流され、読み取りを行うのに十分なイベントがなくなります。

5.腫瘍および鼠径リンパ節の採取と単一細胞懸濁液の調製

  1. ケタミン/キシラジン混合物でマウスを麻酔します。完全な鎮静を確実にするために、ペダル反射(しっかりしたつま先のつまみ)を使用してください。マウスが反応しない場合は、頸部脱臼によってマウスを安楽死させます。
  2. 各マウスを仰向けに置き、腹部の皮膚に70%エタノールをスプレーします。鉗子とハサミを使用して、マウスの左側から腫瘍を切り取り、右側からリンパ節を切り取ります。腫瘍が大きい場合は、細かく切って500〜600 mgの組織を取ります。リンパ節の場合は、臓器全体を集めます。
    注:鼠径部の両側に2つのリンパ節があります。実験目標に応じて、リンパ節と腫瘍を同じ側から分離することができます。しかし、腫瘍が非常に大きくなると、同じ側からリンパ節を採取することは容易ではなくなります。
  3. 3〜5mLのRPMI培地を含むそれぞれの解離管に組織を置きます。自動解離器を使用して組織を均質化します。
    注意: 他の自動またはハンドヘルドホモジナイザーを使用できます。
  4. ホモジナイズ後、細胞懸濁液を70 μmのフィルターを通して50 mLのコニカルチューブに移します。277 x g で25°Cで5分間遠心分離し、培地を除去します。細胞を洗浄し、1〜2 mLの冷たいPBSに再懸濁します。

6. 単一細胞懸濁液のFACS染色

  1. 0.4%トリパンブルー染色を使用して、血球計算盤で生細胞をカウントします。2〜300万個のセルを取得するために必要な体積を計算し、それらをそれぞれのFACSチューブに移します。
  2. 生細胞をゲートするために生存率色素を使用します。そうしないと、抗体と死細胞との非特異的結合が起こり、偽陽性の結果をもたらす可能性があります。
    注:この実験では、生細胞と死細胞の染色にゾンビ色素を使用しました。いくつかの固定可能および非固定可能な色素(例えば、ヨウ化プロピジウム)が市販されている。
  3. 遠心分離機(277 x g で25°Cで5分間)で細胞を計数した。上清をデカントし、細胞を300 μLのPBSに再懸濁します。0.5〜1μLのゾンビ染料/チューブを追加します。暗所で20分間室温でインキュベートします。
  4. 遠心分離機(277 x g 、25°Cで5分間)し、細胞を1〜2 mLのFACSバッファーで洗浄し、200 μLのFACSバッファーに再懸濁します。
  5. Fc受容体遮断薬(200 μLあたり2 μL、またはメーカーのプロトコルに従って)を追加し、細胞を10分間インキュベートします。
  6. 遠心分離機(277 x g で25°Cで5分間)し、1〜2 mLのFACSバッファーで細胞を洗浄します。抗体カクテルを加え、暗所で4°Cで30分間インキュベートします。
  7. インキュベーション後、遠心分離(277 x g で25°Cで5分間)し、1〜2 mLのFACSバッファーで細胞を洗浄します。300〜400μLの2%パラホルムアルデヒド溶液を加え、固定のために再懸濁します。このステップで細胞を4°Cで数日間保存するか、マルチカラーフローサイトメーターですぐに分析します。

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結果

本研究では、HNSCCの同系マウスモデルにおけるポリ無水物IL-1αの抗腫瘍活性を調べた。組換えIL−1α(rIL−1α)は、mEERL腫瘍増殖を有意に減速させたが(図1A)、処置マウスでは体重減少が観察されたが、これは処置離脱後に回復した(図1B)。IL-1α-NPは、生理食塩水またはブランクNPと比較して有意な抗腫瘍効果を誘導せず(図1A)、rIL-1αほど顕著ではありませんが、いくらかの体重減少を伴いました(図1B)。rIL-1αで処置されたマウスは、他の処置群よりも有意に長く生存した(図1C)。さらに、IL-1α、IL-1β、およびIFN-γの循環レベルは、他の治療群と比較してrIL-1α治療マウスで高かった(図2A-C

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ディスカッション

このプロトコルにより、研究者は抗腫瘍活性と免疫調節薬の根底にあるメカニズムのいくつかを研究することができます in vivo 腫瘍マウスモデルシステム。ここでは、同系皮下腫瘍モデルが使用されましたが、これは、技術的に簡単なプロトコル、腫瘍増殖の容易なモニタリング、動物の罹患率の低下、およびより高い産生性を含む、同所性モデルに比べていくつかの利点を有する。皮下腫瘍モデルは、左右両側に腫瘍細胞を注入することにより、両側性腫瘍モデルに改変することもできる。この両側性腫瘍モデルでは、放射線療法または薬物を腫瘍内の1つの腫瘍に投与することができ、アブスコパル応答をモニターすることができる。同所性HNSCCマウスモデルは、より臨床的に関連性があるが、技術的に生成が難しく、腫瘍の成長を監視することが困難であり、口腔内の腫瘍量は、マウスが飲食することができないために早期安楽死をもたらすことが多い。

細胞の調製は、すべてのマウスにおいて対称的で類似したサイズの腫瘍を形成するための重要なステップである。細胞の調製が不十分な場合、細胞の生存率が低下し、マウスの腫瘍発生に大きく影響します...

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開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

この作業は、米国(米国)のメリットレビュー賞#I01BX004829によって部分的にサポートされました。退役軍人省、生物医学研究所研究開発サービス、アイオワ大学のホールデン総合がんセンターを通じたメジール賞プログラムの支援を受けています。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
Bio-Plex 200 システムバイオ・ラッドこのシステムは、フローサイトメトリー施設から提供されました アイオワ大学ヘルスケア
Bio-Plex Pro マウスサイトカイン 23-plex アッセイバイオ・ラッドM60009RDPD
C57BL/6J マウスJakson Labs664生後 4 〜 6 週齢
DMEM (ダルベッコの改変イーグル培地)サーモフィッシャーサイエンティフィ11965092
DMEM/ハム F12 (ダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物 F-12)サーモフィッシャーサイエンティフィック11320033
EGFミリポアシグマSRP3196-500UG
ウシ胎児血清ミリポアシグマ12103C-500ML
ゲンタマイシン硫酸塩溶液IBI サイエンティフィックIB02030
ジェントルMACS ディスソシエーターミルテニーbiotec
磁気プレートウォッシャーサーフィッシャーサイエンティフィックEPX-55555-000
ドロコルチゾンミリポアシグマH6909-10ML
インスリンミリポアシグマI0516-5ML
ケタミン/キシラジン注射麻酔
MEERL細胞株HPV16 E6/E7をhRASおよびルシフェラーゼ(mEERL)細胞とともに安定して発現するマウス中咽頭上皮細胞
Portable BalancesOhaus
Scienceware Digi-Max スライドノギスMillipore SigmaZ503576-1EA
Sterile alcohol prep pad (70% isopropyl alcohol)CardinalCOV5110.PMP
トランスフェリンヒトミリポアシグマT8158-100MG
トリヨードチロニンミリポアシグマT5516-1MG
ック ハンドヘルドモヒ

参考文献

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