ヒト誘導多能性幹細胞由来の脳オルガノイドの生成とミトコンドリア病のモデル化におけるその使用に関する詳細なプロトコルについて述べています。
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この記事について
サマリー
要約
ミトコンドリア病は、代謝の生まれ変わりエラーの最大のクラスを表し、現在不治です。これらの疾患は、根本的なメカニズムが解明されたままの神経発達上の欠陥を引き起こす。主要な障害は、患者に見られる早期発症神経障害を再現する効果的なモデルの欠如である。誘導多能性幹細胞(iPSC)の技術の進歩により、神経系の発達と組織に対する疾患の影響を調べるための3次元(3D)脳オルガノイドの生成が可能になります。これらの著者を含む研究者は、最近、ミトコンドリア障害をモデル化するためにヒト脳オルガノイドを導入しました。本論文は、ヒトiPSC由来の脳オルガノイドの堅牢な生成と、ミトコンドリアの生体エネルギープロファイリングおよびイメージング分析におけるその使用に関する詳細なプロトコルを報告する。これらの実験は、脳オルガノイドを使用して代謝および発達の機能不全を調査することを可能にし、ミトコンドリア病の神経病理学を解剖するための重要な情報を提供するかもしれない。
概要
ミトコンドリア病は、代謝の内生誤差の最大のクラスを表します1.それらは、酸化リン酸化(OXPHOS)2、呼吸連鎖集合体、ミトコンドリアダイナミクス、ミトコンドリアDNA転写または複製を含む異なるミトコンドリアプロセスを破壊する遺伝子変異によって引き起こされる。エネルギー要件を有する組織は、特にミトコンドリア機能不全4の影響を受ける。したがって、ミトコンドリア病の患者は、典型的には早期発症の神経学的症状を発症する。
現在、ミトコンドリア病の影響を受ける小児に対する治療法はない5。ミトコンドリア病の薬剤開発の大きな障害は、ヒト疾患コース6を再現する有効なモデルの欠如である。現在研究されている動物モデルのいくつかは、患者7に存在する神経学的欠陥を示さない。したがって、ミトコンドリア病の神経病理学の根底にあるメカニズムはまだ完全には理解されていない。
最近の研究では、ミトコンドリア病の影響を受けた患者からiPSCを生成し、これらの細胞を使用して患者特異的神経細胞を得た。例えば、ミトコンドリア病に伴う....
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プロトコル
注: 人間の iPSC を使用するには、倫理的な承認が必要な場合があります。本研究で用いたiPSCは、現地の倫理的承認(#2019-681)に従って健康なコントロール個人に由来した。すべての細胞培養手順は、ボンネットの下で移送する前に、慎重にすべての試薬および消耗品を消毒し、無菌細胞培養フードの下で行われなければなりません。分化に使用するヒトiPSCは、広範な培養で起こり得る潜在的なゲノム収差を避けるために、50未満の通過番号を持つべきである。細胞の多能性状態は、例えば、NANOGまたはOCT4のような多能性関連マーカーの発現を監視することによって、オルガノイド生成の前に検証されるべきである。マイコプラズマの検査は、マイコプラズマを含まない培養を確実にするために毎週実施する必要があります。
1. 脳オルガノイドの生成
- ヒトiPSCの文化
- コーティングされた6ウェルプレートのiPSC培地( 材料表参照)のフィーダーフリー条件下で培養したヒトiPSCを、37°Cおよび5%CO2の加湿組織培養インキュベーターに保管します。
注:フィーダー細胞の持ち越しは、オルガノイド分化を妨げる可能性があります。フィーダーフリー条件で少なくとも一回細胞を通過させる。 - 1:4~1:12の酵素無剥離媒体を用いて80%の合流率でiPSCを通過させる。細胞生存率を高めるには、分割後に10....
- コーティングされた6ウェルプレートのiPSC培地( 材料表参照)のフィーダーフリー条件下で培養したヒトiPSCを、37°Cおよび5%CO2の加湿組織培養インキュベーターに保管します。
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結果
ここで説明するプロトコルは、丸型オルガノイドの堅牢な生成を容易にする(図1A)。生成されたオルガノイドには、軸索(SMI312)および樹状突起(微小管関連タンパク質2(MAP2))に特異的なタンパク質マーカーを使用して視覚化できる成熟したニューロンが含まれています(図1B)。成熟したオルガノイドは、神経細胞(MAP2陽性)だけでなく、グリア細胞(例えば、アストロサイトマーカーS100カルシウム結合タンパク質B(S100ß)に陽性)も含む(図1B)。
共焦点顕微鏡を用いて、切れた脳オルガノイドを解析することで、細胞型や細胞構造の詳細な分布や組織を特定し、監視することが可能です。これは、ミトコンドリア病が神経系の発達にどのような影響を与えるかについての新しい洞察を提供する可能.......
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ディスカッション
本論文では、ヒトiPSC由来の脳オルガノイドの再現性のある生成と、ミトコンドリア病のモデル化に用いることを説明する。ここで説明するプロトコルは、以前に公開された work20 に基づいて変更されます。本プロトコルの大きな利点の1つは、各オルガノイドを足場マトリックスに手動で埋め込む必要がなされないことである。実際、マトリックス溶液は、細胞培養培地に単に溶解される。さらに、オルガノイドはインキュベーター内の軌道シェーカー上に配置された標準的な組織培養6ウェルプレートで培養することができるので、高価なバイオリアクターを採用する必要はありません。この手順はまた、様々な個々のラインに由来する異なるオルガノイドを含む複数のプレートの並列栽培を可能にし、それによって実験のスループットを高め、異なるオルガノイドの成長プロファイルに出現する潜在的な違いをモニタリングすることを可能にする。我々は、一貫した結果で、健康なコントロールに由来する異なるiPSCとミトコンドリア病の影響を受ける個人を用いてこのプロトコルをテストした。
ミトコンドリア病のモデル化.......
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開示事項
著者らは、競合する財政的利益や非財政的利益を宣言しない。
謝辞
ミリアム・ビュニングの技術サポートに感謝します。我々は、ドイツ・フォルシュングスゲミンシャフト(DFG)(PR1527/5-1からA.P.)、スパークとベルリン衛生研究所(BIH)(BIH検証資金からA.P.)、ユナイテッド・水戸からの支援を認める コンドリア病財団(UMDF)(リー症候群国際コンソーシアム補助金A.P.)、大学病院デュッセルドルフ(Forschungskommission UKDからA.P.)、ドイツ連邦教育研究省(BMBF)(e:バイオ若手研究者は、AZ 031L0211をA.P.に付与します。C.R.R.の研究室での作業は、DFG(FOR 2795 「ストレス下のシナプス」、Ro 2327/13-1)によってサポートされました。
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材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 2-メルカプトエタノール | Gibco | 31350-010 | |
| Affinity Designer | Serif (Europe) Ltd | レイアウトソフトウェア;ベクトル グラフィックス エディター | |
| アレクサ フルーア 488 ロバ アンチモルモット | シグマ アルドリッチ | SAB4600033-250UL | 1:300 |
| アレクサ フルオ 488 ロバ アンチマウス | サーモフィッシャーサイエンティフィック | A-31571 | 1:300 |
| アンチマイシン A | シグマ アルドリッチ | 1397-94-0 | |
| アンチベータ - チューブリン III (TUJ-1) | シグマ アルドリッチ | T8578 | 1:2000 |
| アルゴン レーザー | メレスグリオ | 他のレーザー、例えば、488を発するダイオードレーザーは問題ありませんが、 | |
| アスコルビン酸 | シグマ | A92902 | |
| B-27とビタミンA | ブコ | 17504044 | |
| バクト寒天 | ベクトンディキンソン | PBSで3%、-20°Cで溶液を保存します。C | |
| BDNF | Miltenyi Biotec | 130-093-0811 | |
| cAMP | Sigma | D0627 | |
| Cell Star cell culture 6 well plate | Greiner-Bio-One | 657160 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Gibco | 11905031 | |
| Confocal レーザー走査型顕微鏡 C1 | Nikon Microscope Solutions | モジュール式共焦点顕微鏡システム | |
| Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free | Corning | 356231 | Matrix component |
| CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit | Thermo Fisher | C7026 | |
| DMEM/F12 | ThermoFisher | 31330038 | |
| DMSO | Sigma | D2660-100ML | |
| Donkey anti-goat Cy3 | Merckミリポア | AP180C | 1:300 |
| ロバ アンチマウス Cy3 | メルク ミリポア | AP192C | 1:300 |
| ロバ アンチウサギ Cy3 | メルク ミリポア | AP182C | 1:300 |
| DPBS | ギブコ | 14190250 | |
| DS-Q1Mc カメラ | ニコン顕微鏡ソリューション | ||
| エクリプス 90i 直立広視野顕微鏡 | ニコン顕微鏡ソリューション | ||
| Eclipse E 600FN 直立顕微鏡 | Nikon Microscope Solutions | ||
| Eclipse Ts2 倒立顕微鏡 | Nikon Microsope Solutions | ||
| EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | 共焦点顕微鏡用イメージングソフトウェア | |
| FCCP | Sigma Aldrich | 370-86-5 | |
| ウシ胎児血清 | Gibco | 10270-106 | |
| GDNF | Miltenyi Biotec | 130-096-291 | |
| Glasgow MEM | Gibco | 11710-035 | |
| ガラスパスツールピペット | ブランド | 747715 | 逆 |
| グルタマックス | Gibco | 35050-061 | |
| ヘリウムネオンレーザー | メレスグリオ | 他のすべてのレーザー、例えば、594を発するダイオードレーザーは問題ありません, too | |
| Heparin | Merck | H3149-25KU | |
| HERACell 240i CO2 インキュベーター | Thermo Scientific | 51026331 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | H3570 | 1:2500 |
| Image J 1.53c | Wayne Rasband National Institute of Health | 画像処理ソフトウェア | |
| Injekt Solo 10 mL/ Luer | Braun | 4606108V | |
| ノックアウト血清交換 | Gibco | 10828010 | |
| レーザー (407 nm) | Coherent | 他のレーザー、例えば、407を放射するダイオードレーザーは問題ありません、あまりにも | |
| Map2 | Synaptic Systems | No. 188004 | 1:1000 |
| Maxisafe 2030i | |||
| MEM NEAA | Gibco | 11140-050 | |
| mTeSR Plus | Stemcell Technology | 85850 | iPSC medium |
| Multifuge X3R Centrifuge | Thermo Scientific | 10325804 | |
| MycoAlert Mycoplasma Detection Kit | Lonza | # LT07-218 | |
| N2 Supplement | Gibco | 17502-048 | |
| Needle for single usage (23G x 1"TW) | Neoject | 10016 | |
| NIS-Elements Aadvanced Research 3.2 | Nikon | イメージングソフトウェア | |
| オリゴマイシン A | Sigma Aldrich | 75351 | |
| オービタルシェーカー ハイドルフ ユニマックス 1010 | ハイドルフ | 543-12310-00 | |
| PAP ペン | Sigma | Z377821-1EA | スライド上に疎水性バリアを描くため。 |
| パパイン解離システムキット | ワージントン | LK003150 | |
| パラホルムアルデヒド | メルク | 818715 | PBSで4%、溶液を-20°Cで保存します。C |
| パスツールピペット 7mL | VWR | 612-1681 | mLまで目盛り付き |
| ペニシリン-ストレプトマイシン | Gibco | 15140-122 | |
| プラン Apo VC 20x / 0.75 エア DIC N2 ∞/0.17 WD 1.0 | Nikon Microscope Solutions | ドライマイクロスコープ 対物 | |
| Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13 | Nikon Microscope Solutions | 油浸顕微鏡対物 | |
| ポリスチレンペトリ皿(100 mm) | Greiner Bio-One | 664161 | |
| 細胞ストレーナーキャップ付きポリスチレン丸底チューブ(5 mL) | Falcon | 352235 | |
| 塩化カリウム | Roth | 6781.1 | |
| ProLong ガラス退色防止Moutant | Invitrogen | P36980 | |
| 性的濾紙 | VWR | 516-0813 | |
| ロック インヒビティオール | メルク | SCM075 | |
| ロテノン | シグマ | 83-794 | |
| S100β | Abcam | Ab11178 | 1:600 |
| SB-431542 | ケイマンケミカルカンパニー | 13031 | |
| メスの刃 | ハインツ ヘレンツ ハンブルク | 1110918 | |
| SMI312 | バイオレジェンド | 837904 | 1:500 |
| 重炭酸ナトリウム | メルク/シグマ | 31437-1kg-M | |
| 塩化ナトリウム | ロス | 3957 | |
| ナトリウムリン酸二水素 | Applichem 131965 | ||
| ピルビン酸ナトリウム | Gibco | 11360070 | |
| SOX2 | Santa Cruz Biotechnology | Sc-17320 | 1:100 |
| StemPro Accutase 細胞解離試薬 | Gibco/StemPro | A1110501 | 試薬 |
| A 瞬間接着剤 ゲル | UHU | 63261 | 接着ゲル |
| SuperFrost Plus | VWR | 631-0108 | |
| 単回使用用シリンジ (1 mL) | BD Plastipak | 300015 | |
| TB2 Thermoblock | Biometra | ||
| TC Plate 24 Well | Sarstedt | 83.3922 | |
| TC Plate 6 Well | Sarstedt | 83.392 | |
| TGFbeta3 | Miltenyi Biotec | 130-094-007 | |
| Tissue Culture Hood | ThermoFisher | 51032711 | |
| TOM20 | Santa Cruz Biotechnology | SC-11415 | 1:200 |
| Triton-X | Merck | X100-5ML | |
| UltraPure 0.5M EDTA | Invitrogen | 15575020 | |
| Vibratome Microm HM 650 V | Thermo Scientific | 生産が終了しましたが、他の調整可能なミクロトームも問題ありません。 | |
| ビブレータ ウィルキンソン クラシック カミソリ ブレード | ウィルキンソン ソード | 70517470 | |
| ワットマン ベンチコート | メルク/シグマ | 28418852 | |
| Wnt アンタゴニスト I | EMD ミリポア | コーポレーション 3378738 | |
| XF 96 細胞外フラックス分析装置 | タツノオ | 100737-101 | |
| XF アッセイ DMEM ミディアム | タツノオトシゴ バイオサイエンス | 103680-100 | |
| XF Calibrant Solution | タツノオ | 100840-000 | |
| XFe96 FluxPak (96ウェルマイクロプレート) | タツノオ | 102416-100 |
参考文献
- Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
- Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080(2016).
- Vafai, S. B., Mootha, V. K.
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再版と許可
