方法論記事

透明なシリコーン窓による縦方向の生体内イメージング

DOI：

10.3791/62757

⸱

2022年1月5日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Cold Spring Harbor Laboratory, 2Cold Spring Harbor Laboratory School of Biological Sciences, 3Koch Institute for Integrative Cancer Research, Massachusetts Institute of Technology, 4Medical Scientist Training Program, School of Medicine, Stony Brook University, 5Graduate Program in Pharmacology, Stony Brook University, 6Graduate Program in Genetics, Stony Brook University, 7Graduate Program in Biomedical Engineering, Stony Brook University, 8Department of Biomedical Engineering, Stony Brook University, 9Department of Pathology, University of Michigan

* These authors contributed equally

この記事について

サマリー

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ここでは、関心のある組織/器官および皮膚に直接接着することができる光学的に透明なシリコーン窓を使用して、長期の生体内イメージングのためのアプローチを提示する。これらの窓は、現在現場で使用されている他の窓よりも安価で汎用性が高く、外科的挿入は動物に限られた炎症および苦痛を引き起こす。

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生体内顕微鏡(IVM)は、単一細胞分解能での細胞移動、分裂、および死の可視化を可能にします。外科的に挿入されたイメージングウィンドウを通るIVMは、数日から数週間にわたって同じ組織の縦断的観察を可能にするため、特に強力である。典型的なイメージングウィンドウは、マウスの皮膚に縫合された生体適合性の金属フレーム内のガラスカバースリップで構成されています。これらの窓は、マウスの自由な動きを妨げ、強い炎症反応を誘発し、ガラスの破損または破れた縫合糸のために失敗し、そのいずれもが安楽死を必要とする可能性がある。これらの問題に対処するために、長期腹部器官および乳腺イメージング用の窓は、以前は頭蓋イメージング窓に使用されていた光学的に透明なシリコーンポリマーであるポリジメチルシロキサン(PDMS)の薄膜から開発された。これらの窓は組織に直接接着することができ、挿入に必要な時間を短縮する。PDMSは柔軟性があり、マウスの耐久性に寄与し、時間の経過とともに最大35日間試験されています。縦方向イメージングは、別々のセッション中に同じ組織領域をイメージングすることです。ステンレス製のグリッドが窓に埋め込まれ、同じ領域をローカライズし、数日離れた同じ場所での動的プロセス(乳腺の退縮など)の視覚化を可能にしました。このシリコーンウィンドウはまた、時間の経過とともに微小転移に発達する単一の播種性癌細胞のモニタリングを可能にした。この研究で使用されたシリコーン窓は、金属フレームのガラス窓よりも挿入が簡単で、画像化された組織の炎症を制限します。さらに、埋め込みグリッドにより、繰り返しイメージングセッションで同じ組織領域を簡単に追跡できます。

概要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

麻酔をかけられた動物の組織のイメージングである生体内顕微鏡(IVM)は、無傷の組織における細胞分解能での生理学的および病理学的事象のダイナミクスへの洞察を提供する。この技術の応用は多岐にわたりますが、IVMはがん生物学の分野で、がん細胞が組織に侵入して転移し、周囲の微小環境と相互作用し、薬物にどのように反応するかを解明するのに役立つ1、2、3。さらに、IVMは、エクスビボプロファイリングアプローチ(例えば、フローサイトメトリー)を補完する洞察を提供することにより、免疫応答を支配する複雑なメカニズムの理解を促進するための鍵となっています。例えば、生体内イメージング実験は、細胞遊走および細胞間接触に関連する免疫機能の詳細を明らかにし、傷害または感染に応答して時空間ダイナミクスを定量するためのプラットフォームを提供している4,5,6,7。これらのプロセスの多くは、組織学的染色によっても研究することができるが、動的変化の追跡を可能にするのはIVMのみである。実際、組織学的切片は所与の時間における組織のスナップショットを提供するが、インバイタルイメージングは、同じ組織内の細胞間および細胞内事象を経時的に追跡することができる。特に、蛍光標識の進歩と分子レポーターの発達により、分子事象は、増殖、死、運動性、および他の細胞または細胞外マトリックスとの相互作用などの細胞挙動と相関することが可能になった。ほとんどのIVM技術は蛍光顕微鏡法に基づいており、光散乱のためにより深い組織のイメージングを困難にします。したがって、関心のある組織は、しばしば侵襲的および終末的処置で外科的に曝露される必要がある。したがって、器官部位に応じて、組織を、数時間から40時間8まで変化する期間にわたって連続的に画像化することができる。あるいは、永久的な画像化窓の外科的挿入は、7、9週までの数日にわたって同じ組織の画像化を順次可能にする。

新しいイメージングウィンドウの開発は、バイタル内イメージングアプローチをさらに改善するための技術的必要性として強調されています10。プロトタイプのインタビタル画像化ウィンドウは、縫合糸11で皮膚に固定されたガラスカバースリップを含む金属リングである。自由な動きへの干渉、滲出液の蓄積、およびガラスカバースリップの損傷は、そのような窓の使用で見られる一般的な問題である。さらに、プロトタイプウィンドウは特殊な生産を必要とし、外科的処置は広範なトレーニングを必要とする可能性がある。これらの問題に対処するために、シリコーンポリマーであるポリジメチルシロキサン(PDMS)は、以前は脳12における長期画像化のための頭蓋窓において使用されていたが、腹部器官および乳腺画像化における使用のために適合された。ここでは、PDMSベースのシリコーン窓を生成するための詳細な方法が提示され、同じ組織領域の反復画像化のためのランドマークを提供するためにステンレス鋼グリッドの周りに窓を鋳造する方法を含む。さらに、腹部器官または乳腺の上に窓を挿入するための簡単でステッチフリーの外科的処置が記載されている。この新しいアプローチは、現在使用されているイメージングウィンドウの最も一般的な問題のいくつかを克服し、縦方向のインタビタルイメージングのアクセシビリティを向上させます。

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プロトコル

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

記載されているすべての手順は、コールドスプリングハーバー研究所外科ガイドラインに従って行われ、コールドスプリングハーバー研究所の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されていました。

1.シリコンウィンドウを鋳造する

  1. シリコーンポリマー(PDMS)を調製するには、ベースエラストマーと硬化剤を10:1(v/v)の比率で混合します。
  2. 無菌で滑らかな表面に少量のPDMSを堆積させて窓を鋳造し、体積対面積比を所望の厚さに調整する。
    注:24ウェルプレート蓋の蓋に直径22mmの円に対して200mgのポリマー溶液を使用すると、窓の頑丈さと光学的透明度の間に良好な妥協点が生じます。
  3. オプション:同じ組織領域を繰り返しイメージングするためのランドマークを提供するには、PDMSが所望の鋳造面上にあってから、ステンレス鋼グリッドをシリコーンに軽く押し込みます。
  4. 気泡を除去するには、コーティングされた表面を真空デシケーターに45分間置き、ポリマーを脱気する。
  5. シリコーン窓を80°Cのオーブンで45分間硬化させる。
  6. 金型の端にポリマーをスコアリングし、鉗子で鋳造に使用した表面から硬化した窓を静かに剥がします。
  7. 手術前に、オートクレーブで窓を滅菌してください。

2.シリコンウィンドウの挿入のためのマウスの準備

  1. 誘導チャンバー内でマウスを4%(v/v)イソフルランを用いて麻酔する。マウスを手術台の温めパッドに移動し、麻酔ノーズマスクにマウスを置き、イソフルラン濃度を2%に下げて手術中のメンテナンスを行います。
  2. 後肢のつま先をつまんで麻酔の深さを確認してください。マウスが非アクティブになり、つま先のピンチ反射応答が表示されなくなるまで、マウスを続行しないでください。
  3. 眼科用潤滑剤を眼に塗布して、眼が乾燥しないようにし、外傷を予防します。
  4. 先制鎮痛薬(ブプレノルフィン0.05mg/kg)を皮下に投与する。
  5. 手術部位を剃り、脱毛クリームで完全に脱毛します。
  6. ポビドン - ヨウ素溶液(10% v / v)およびエタノール(70% v / v)を連続して3倍に塗布し、手術部位の感染を予防する。

3. 肝臓のイメージングのための腹側窓の挿入;他の腹部器官に適応可能(図1)

  1. マウスを仰臥位に置きます。
  2. 滅菌はさみと鉗子を使用して剣状突起から3mm下方から10mm切開します。
  3. 正中線に沿って1〜1.5 cm2 の皮膚部分を取り除きます。
  4. 滅菌はさみと鉗子の2番目のペアを使用して、皮膚のセクションよりわずかに小さい腹膜のセクションを削除します。
  5. オプション:肝臓の大部分を視覚化するには、滅菌生理食塩水で湿らせた滅菌綿棒を使用して肝臓を横隔膜から押し下げ、肝臓と横隔膜をつなぐ鷹状靭帯を明らかにします。下大静脈を切らないように注意しながら靭帯を切断する。
  6. 31Gシリンジで外科用接着剤を引き出し、画像化する領域の縁の周りの肝臓の表面に少量塗布する。この接着剤は円形のシールを作成し、中央領域をそのまま残してイメージングします。
    警告: 接着剤は、画像領域の周りに円形のパターンを形成する小さな液滴に制限してください。接着剤と接触した組織はすぐには画像化できない。接着剤を塗布する前に組織を乾燥させる必要はない。
    注:この手順では、シアノアクリレートベースの接着剤を正常に使用できます。外科用接着剤は無菌性を保証します。ターミナル手順では、万能スーパー接着剤が良好な結果をもたらします。
  7. 鉗子を使用して窓を置き、接着剤が乾くまで(〜2分間)肝臓にしっかりと押し付けます。
  8. 腹膜の下の窓の端を折りたたむ。
  9. 注射器で、腹膜の下にある窓の端に少量の外科用接着剤を堆積させる。鉗子で腹膜を押し下げて窓に固定します。
  10. 同様に、腹膜に少量の外科用接着剤を付着させてから、鉗子で皮膚を押し下げて腹膜に固定する。
    注:正しく実行すれば、肝臓組織の円形の領域が窓から見えるはずです。
  11. 窓の端に接着剤を塗って、窓の上に皮膚が伸びるのを防ぐのに役立つ縁を作ります。
    注意:無菌の外科的技術を用いて処置が行われ、挿入前に窓が滅菌されている場合、外科用接着剤で創傷を密封するだけで感染を避けるのに十分である。しかし、外科的挿入または不完全な閉鎖中に適切な無菌技術に従わないと、顕在または無症候性の感染および組織からの乾燥につながる可能性がある。

4. 肝臓のイメージングのための側方窓の挿入;門脈における癌細胞の同時注入と互換性がある(図2)

  1. マウスを左側方褥瘡の位置に置きます
  2. 滅菌はさみと鉗子を使用して、肋骨弓の3 mm下の右脇腹に10 mmの切開を行います。
  3. 皮膚の1cm2 の部分を取り除きます。
  4. 滅菌はさみと鉗子の2番目のペアを使用して、皮膚のセクションよりわずかに小さい腹膜のセクションを削除します。
  5. 31Gシリンジで外科用接着剤を引き出し、画像化する領域の縁の周りの肝臓の表面に少量塗布する。
    警告: 接着剤は、画像領域の周りに円形のパターンを形成する小さな液滴に制限してください。接着剤と接触した組織はすぐには画像化できない。
    注:この手順では、シアノアクリレートベースの接着剤を正常に使用できます。外科用接着剤は無菌性を保証します。ターミナル手順では、万能スーパー接着剤が良好な結果をもたらします。
  6. 鉗子を使用して窓を置き、接着剤が乾くまで(〜2分間)肝臓にしっかりと押し付けます。
  7. 腹膜の下の窓の端を折りたたむ。
  8. 注射器で、腹膜の下にある窓の端に少量の外科用接着剤を堆積させる。鉗子で腹膜を押し下げて窓に固定します。
  9. 同様に、腹膜に少量の外科用接着剤を付着させてから、鉗子で皮膚を押し下げて腹膜に固定する。
    注:正しく実行すれば、肝臓組織の円形の領域が窓から見えるはずです。
  10. 窓の端に接着剤を塗って、窓の上に皮膚が伸びるのを防ぐのに役立つ縁を作ります。
  11. 門脈注入が必要な場合:
    1. マウスを仰臥位に置きます。
    2. 皮膚の剣状突起から10mmの切開を行う。
    3. 滅菌ハサミおよび鉗子の第2のペアを使用して、腹膜に10mmの切開を行う。
    4. 2本の綿棒を滅菌生理食塩水に浸す。
    5. 綿棒を使用して、滅菌生理食塩水で湿らせた滅菌ガーゼの上に腸を優しく引っ張り、向きをねじったり乱したりしないように注意してください。
    6. 門脈が腹部の右側に見えるまで、腹腔から腸を変位させ続ける。
    7. 門脈の肝臓への入り口の入り口まで尾の5〜7mmの31〜33G針を挿入し、血管内を通過せず、血管内に進むようにしてください。
    8. がん細胞をゆっくりと注入する(100 μLの滅菌PBSに再懸濁する)。
      注:この実験のために、アミリン膵臓癌細胞株(例えば、KPC-BL/6-1199)は、完全なDMEM培地および100μLの滅菌PBS中に注射された1 x105 細胞で培養することができる。
    9. 出血を防ぐために、針を抜いた直後に、手術用スポンジの小片で注射部位に1〜2分間穏やかに圧力をかけます。
    10. 圧力が解放された後、止血を確実にするために1〜2分間サイトを監視します。
    11. 湿らせた綿棒を使用して、器官の生理学的配向に従って腸を腹腔に戻す。
    12. 滅菌鉗子を使用して、マウスの腹腔の左側にある腹膜のすぐ下に窓を挿入します。
    13. 4-0シルク縫合糸で縫合し、正中線切開部を7mmのステンレス鋼の創傷クリップでホチキス止めする。
    14. マウスを左横褥瘡の位置に移動する
    15. 滅菌はさみと鉗子を使用して、皮膚を通して肋骨アーチの下の右脇腹3mmに10mmの切開を行う。
    16. 切開部の周りの皮膚の1cm2 部分を除去する。
    17. 滅菌はさみと鉗子の2番目のペアを使用して、皮膚のセクションよりわずかに小さい腹膜のセクションを削除します。
    18. 手順4.8-4.10で説明されているように、窓を肝臓の上の所定の位置に引っ張ってから所定の位置に接着します。

5. 膵臓にイメージング用のウィンドウを挿入する(図3)

  1. マウスを右側の側方褥瘡の位置に置きます。
  2. 滅菌はさみと鉗子を使用して、肋骨アーチの3mm下の左脇腹に10mmの切開を行います。
  3. 切開部の周りの皮膚の1cm2 部分を除去する。
  4. 滅菌はさみと鉗子の2番目のペアを使用して、皮膚のセクションよりわずかに小さい腹膜のセクションを削除します。
  5. 滅菌生理食塩水で浸した滅菌綿棒を使用して、脾臓を優しく引っ張って膵臓を視覚化します。湿らせた綿棒で膵臓の位置を変えて、切開部を通してより多くの表面積が見えるようにします。
    注:この時点で、膵臓癌細胞は、実験計画の一部である場合、膵臓に同所的に注入することができる。
  6. 31Gシリンジで外科用接着剤を引き出し、画像化する領域の縁の周りの膵臓の表面に少量塗布する。
    警告: 接着剤は、画像領域の周りに円形のパターンを形成する小さな液滴に制限してください。接着剤と接触した組織はすぐには画像化できない。
  7. 鉗子を使用して窓を置き、接着剤が乾くまで(〜2分間)膵臓にしっかりと保持します。
  8. 腹膜の下の窓の端を折りたたむ。
  9. 注射器で、腹膜の下にある窓の端に少量の外科用接着剤を堆積させる。鉗子で腹膜を押し下げて窓に固定します。
  10. 同様に、腹膜に少量の外科用接着剤を付着させてから、鉗子で皮膚を押し下げて腹膜に固定する。
    注:正しく実行すれば、膵臓組織の円形領域が窓から見えるはずです。
  11. 窓の端に接着剤を塗って、窓の上に皮膚が伸びるのを防ぐのに役立つ縁を作ります。

6. 乳腺にイメージング用の窓を挿入する(図4)

  1. マウスを仰臥位に置きます。
  2. 滅菌はさみと鉗子を使用して鼠径乳首の1つに10mmの切開内側を作ります。
  3. 乳腺の上の皮膚の0.5cm2 の部分を取り除く。
  4. 2組目の滅菌ハサミを使用して、はさみを2つの表面の間に広げて付着を乱すことで、乳腺を皮膚から慎重に分離します。
    注:鼠径乳腺領域のイメージングを容易にするために、乳腺より上だが後肢よりも優れた皮膚の一部を解剖するように注意し、窓がマウスの可動性を制限しないように注意してください。
  5. 31Gシリンジで外科用接着剤を引き出し、画像化する領域の縁の周りの乳腺の表面に少量塗布する。
    警告: 接着剤は、画像領域の周りに円形のパターンを形成する小さな液滴に制限してください。接着剤と接触した組織はすぐには画像化できない。
  6. 鉗子を使用して窓を置き、接着剤が乾くまで乳腺にしっかりと固定します(〜2分)。
    注:乳腺組織の円形領域は、正しく実行すれば窓から見えるはずです。
  7. 窓の端を皮膚の下に折りたたみます。
  8. シリンジで、皮膚の下にある窓の端に少量の外科用接着剤を堆積させる。鉗子で皮膚を押し下げ、皮膚を窓に固定します。
  9. 窓の端に接着剤を塗って、窓の上に皮膚が伸びるのを防ぐのに役立つ縁を作ります。

7. 術後の回復

  1. 十分なネスティング材で清潔な回収ケージにマウスを置き、ケージの一部が加熱パッドの上に置かれていることを確認します。
  2. マウスが意識的で可動性になるまで、マウスを継続的に監視します。
  3. 必要に応じて、先制投与の12時間後に鎮痛剤の追加用量を提供する。
    注:追加の鎮痛は一般的に不要ですが、マウスが苦痛の兆候(背中のふらつき、毛皮の不自由な、食べ物への興味の喪失など)を示す場合は獣医師に相談してください。感染または他の有害作用の徴候について、手術後最初の3日間、マウスを毎日監視する。動物の注意または安楽死を必要とするマウスの2%未満は、典型的には窓の部分的な剥離に起因する。腹側肝臓イメージング窓を有する雄マウスの場合、マウス間の戦闘は窓の剥離をもたらす可能性があることに注意することが重要です。これは、マウスを別々に収容することによって回避される。

8. 窓からの撮影

  1. 誘導チャンバー内でマウスを4%(v/v)イソフルランを用いて麻酔する。
  2. 眼科用潤滑剤を眼に塗布して、眼が乾燥しないようにし、外傷を予防します。
  3. マウスを誘導チャンバーから顕微鏡ステージに移動します。マウスを麻酔ノーズマスクに入れ、イソフルラン濃度を約1〜1.5%に下げて、イメージング手順全体を通して麻酔を維持します。
  4. マウスの下に圧力パッドセンサーを置いて呼吸数を監視し、柔らかいサージカルテープを使用してマウスをステージに固定します。
  5. 直腸体温計を挿入して、イメージングセッション全体を通して体温を監視します。
  6. 加熱したパッドの電源を入れ、マウスを注意深く監視して、体温が37°Cを超えないようにします。
  7. ソフトウェアを利用してマウスの呼吸数を監視します。最適な速度は〜1呼吸/秒です。必要に応じて麻酔を調整します。
  8. 各イメージングセッションの前に、70%エタノール(v / v)に浸した綿棒で優しく拭き取って、残留レンズ浸漬媒体や破片から窓をきれいにしてください。
  9. 水浸漬レンズを利用する場合は、気泡を避けて、超音波ゲルを窓に塗布してください。
    注: 蒸留水を使用することもできますが、イメージング中に再適用が必要になる場合があります。
  10. イメージングに最適な深度を見つけるには、まずグリッドを見つけてピントを合わせます。
  11. グリッドの下部を 0 に設定して、おおよその組織イメージング深度を決定します。この情報は、後続のイメージングセッションで対応するz平面を見つけるために必要です。
  12. 複数のイメージングセッションで同じ位置を特定するには、グリッド上の正方形を参照点として使用します。イメージング中は、グリッドの向きと、画像化された各視野のグリッド内の位置(たとえば、上から2行目 、左から4番目の 正方形)に注意してください。
  13. 連続したイメージングセッション中に、グリッドを使用して特定のグリッド領域、つまりイメージングフィールドに戻ります。
  14. 各イメージングセッションに続いて、70%エタノール(v/v)に浸した綿棒で窓を優しく拭き取り、残留レンズ浸漬媒体および破片を除去します。

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結果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

イメージングウィンドウによるイントラバイタルイメージングは、数時間から数週間にわたって単一細胞分解能で幅広い細胞および分子イベントを観察、追跡、定量するために使用できます。イメージングウィンドウのための理想的な特徴には、a)マウスの幸福および組織の生理機能に対する限られた影響が含まれる。b)耐久性;c)挿入の単純さ;d)同じ領域の繰り返し画像化のための明確なランドマーク。その結果、汎用性の高い不活性シリコーン窓が簡単に製造および挿入され、グリッドを装備して、複数のイメージングセッションにわたって同じ視野を見つけることができます。

窓はPDMSでできており、安価で柔軟で透明な素材です。窓は、ほとんどの研究室で広く購入可能な消耗品で鋳造することができます。これらの目的のために、市販の24ウェルプレートの蓋にすでにエッチングされている円形金型(直径22mm)がうまく機能する。単位面積当たりに使用するポリマーの量を変えることにより、窓の厚さを調整することができる。イメージング解像度に対するウィンドウの厚さの影響を文書化するために、40nm蛍光微小球の点像分布関数(PSF)分析を行い、さまざ...

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ディスカッション

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

生体内イメージングウィンドウは、生理学的および病理学的プロセスを細胞分解能で直接視覚化するための重要なツールです。マウスに柔軟なシリコーンイメージングウィンドウをキャスティングおよび挿入するために説明されている新しい手順は、現在使用されているイメージングウィンドウの最も一般的な問題(滲出液、破損、および通常の可動性との干渉)のいくつかを克服し、マウスにさらなる安全性を提供し、この技術のアクセシビリティを向上させます。

最も広く使用されているイメージングウィンドウは、ガラスカバースリップを保持する金属フレームで構成されています。これらのプロトタイプウィンドウの使用に対する主な障害は、金属リングの固定には面倒なステッチング手順が必要であり、高度な外科的訓練を受けた人員が必要であることです。さらに、フレームの製造にはコストがかかり、特殊な機器が必要です。PDMS ウィンドウは、これらの問題の両方を克服します。PDMSウィンドウを挿入する手順は、ステッチングを排除し、技術を学ぶための障壁を大幅に下げます。窓を作る材料も安価で、簡単に購入できます。さらに、窓の形状と外科的処置の両方は、乳腺、...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M.E.は、Insmed, Inc.の ブレンソカティブ の研究諮問委員会のメンバーです。Vividion Therapeutics, Inc.の科学諮問委員会のメンバー。Protalix, Inc.のコンサルタント。Agios Pharmaceuticals, Inc.の株式を保有していますD.A.T.はMestag Therapeuticsの共同設立者であり、科学諮問委員会のメンバーであり、Mestag Therapeutics、Leap Therapeutics、Surface Oncology、Cygnal Therapeuticsの株式を保有しています。他の著者は、競合する利益を宣言していません。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

レーザーカットされたステンレス鋼グリッドの設計と最適化におけるロブ・アイファートの支援に感謝します。この研究は、CSHLがんセンター(P30-CA045508)および国立衛生研究所(NIH)からのM.E.のための資金(1R01CA2374135および5P01CA013106-49)によって支援された。CSHLとノースウェルヘルス;トンプソン家族財団;アメリカ全土を泳ぐ。サイモンズ財団からCSHLへの助成金。M.S.は、一般医科学研究所医学者養成プログラム研修賞(T32-GM008444)およびNIH国立がん研究所(受賞番号1F30CA253993-01)の支援を受けました。L.M.はジェームズ・S・マクドネル財団のポスドク・フェローシップの支援を受けています。J.M.A.は、がん研究所/アービントン・ポスドク・フェローシップ(CRI賞#3435)の受賞者です。D.A.T.は、Lustgarten Foundation Dedicated Laboratory for Pancreatic Cancer ResearchとThompson Family Foundationの支援を受けています。漫画は Biorender.com で作成されました。

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材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
3M Mediporeソフトクロスサージカルテープ3M70200770819
シルク縫合糸 4-0 PERMA HAND BLACK 1 x 18" RB-2Ethicon N267H
ACTB-ECFP マウスJackson Laboratory22974
AEC Substrate Kit, Peroxidase (HRP), (3-amino-9-ethylcarbazole)Vector Laboratories SK-4200
アルコール綿棒BD 
麻酔システムMolecular Imaging Products Co.
Acqknowledgeソフトウェアとセンサー BIOPACACK100W、ACK100M、TSD110
ベタジンスプレー LORIS109-08
c-fms-EGFP (MacGreen) マウスJackson Laboratory18549
C57BL/6J miceJackson Laboratory664
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11)Invitrogen14-0451-82
CD68 Antibody Abcamab125212
Curity ガーゼスポンジ Covidien
Donkey Anti-Goat IgG H&L (HRP) アブカムab6885
ロバアンチウサギIgGハンド&L (HRP) アブカムab97064
ロバアンチラットIgGハンド&L (HRP) Abcamab102182
ダウ SYLGARD 184 シリコーン封止剤 透明電子顕微鏡 科学24236-102 部構成、10:1 混合比
丸型カバーガラス、直径 8mm 、#1.5 厚さ 電子顕微鏡科学72296-08
Ender-3 Pro 3DプリンターShenzhen Creality 3D Technology Co., LTD
遠赤外線加熱ブランケットKent ScientificRT-0520
Fc 受容体ブロッカーInnovex BiosciencesNB309
Fiji イメージング処理パッケージhttps://imagej.net/software/fiji/
FluoroSpheresカルボン酸塩、0.04µm, yellow-green (505/515)InvitrogenF8795
ゲーティングシステム:バイオパックシステムズ株式会社これらのコンポーネントを組み合わせることで、イメージング中のマウスのバイタルモニタリングとマウス呼吸のゲーティング画像取得が可能になります。すべてBIOPACシステムから取得しました。
Acqknowledgeソフトウェア ACK100W ACK100M
デフアンプモジュール Cシリーズ DA100C
デュアルゲーティングシステム 小動物DTU200 
MP160 for Windows - 解析システムMP160WSW 
MouseOx Plus 120V MOX-120V;015000 
圧力パッド TSD110 
GelfoamPfizer9031508吸収性ゼラチンスポンジ
硬化細ハサミFine Science Tools14090-112組 ステンレス製 シャープシャープ
チップ ストレートチップ 26 mm
刃先 長さ11cm
ヒト/マウスミエロペルオキシダーゼ/MPO 抗体R&D SystemsAF3667
ホットビーズ滅菌器Fine Science Tools18000-45使用前に約30分
をオンにし、>200
&でツールを滅菌します。C for 30 s
イマリス ビットプレーンwww.bitplane.com
イマージョン ミディアム イマーソール W 2010ツァイス444969-0000-000 
BD超細針付きインスリンジ 6mm x 31G 1 mL/ccBD324912
イソフルラン (フルリソ)VetOne502017
Lycopersicon Esculentum (トマト) レクチン (LEL, TL), DyLight® 594Vector Laboratories DL-1177-1
LysM-eGFPマウスwww.mmrrc.org012039-MU
マイクロ解剖鉗子RobozRS-5135鋸歯状、わずかなカーブ、0.8 mmの先端幅、4インチの長さ
マイクロ解剖鉗子RobozRS-51531 x 2歯、わずかなカーブ、0.8 mm tip
幅、4インチ長さ
MTS MiniBionix II 808MTSシステム油圧サーボ材料試験機
好中球エラスターゼ 680 FASTプローブパーキンエルマーNEV11169
NitrogenGeneral Welding Supply Corp.
酸素ゼネラル溶接供給株式会社
ポリ乳酸フィラメントハッチボックス直径 1.75 mm
ProLong Diamond 退色防止 封入剤InvitrogenP36970
Puralube 眼科用軟膏Dechra NDC17033-211-38
Reflex 7 創傷クリップRoboz SurgicalRS-9255
ステンレススチールグリッドFotofabOne グリッドは直径 0.200 インチで、0.016 x 0.016 インチの合計 52 個のグリッド正方形があります。各正方形の間には0.003インチのスペースがあります。  
表面処理された滅菌組織培養プレートフィッシャーサイエンティフィックFB012929イメージングウィンドウの硬化面として使用される蓋
TriMスコープ多光子顕微鏡 LaVision BioTecImagingは、2つのTi:Sapphireレーザー(Mai TaiおよびInSight、Spectra-Physics)と光パラメトリック発振器を備えた直立2光子顕微鏡(Trimscope、LaVision BioTec)で行われました。次のロングパスダイクロイックビームスプリッター(Chroma)を使用して、信号を4つのフォトマルチプライザーチューブに向けました：
T560LP
T665LPXXR
T495lxpr
Vetbond3M70200742529
VWRマイクロカバーガラスVWR48404-453
326895

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dondossola, E., et al. Intravital microscopy of osteolytic progression and therapy response of cancer lesions in the bone. Science Translational Medicine. 10 (452), (2018).
  2. Haeger, A., et al. Collective cancer invasion forms an integrin-dependent radioresistant niche. Journal of Experimental Medicine. 217 (1), 20181184(2020).
  3. Harper, K. L., et al. Mechanism of early dissemination and metastasis in Her2(+) mammary cancer. Nature. 540 (7634), 588-592 (2016).
  4. Eickhoff, S., et al. Robust anti-viral immunity requires multiple distinct T cell-dendritic cell interactions. Cell. 162 (6), 1322-1337 (2015).
  5. Engelhardt, J. J., et al. Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells. Cancer Cell. 21 (3), 402-417 (2012).
  6. Sammicheli, S., et al. Inflammatory monocytes hinder antiviral B cell responses. Science Immunology. 1 (4), (2016).
  7. Entenberg, D., et al. A permanent window for the murine lung enables high-resolution imaging of cancer metastasis. Nature Methods. 15 (1), 73-80 (2018).
  8. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5562(2011).
  9. Ritsma, L., et al. Surgical implantation of an abdominal imaging window for intravital microscopy. Nature Protocols. 8 (3), 583-594 (2013).
  10. Pittet, M. J., Garris, C. S., Arlauckas, S. P., Weissleder, R. Recording the wild lives of immune cells. Science Immunology. 3 (27), (2018).
  11. Alieva, M., Ritsma, L., Giedt, R. J., Weissleder, R., van Rheenen, J. Imaging windows for long-term intravital imaging: General overview and technical insights. Intravital. 3 (2), 29917(2014).
  12. Heo, C., et al. A soft, transparent, freely accessible cranial window for chronic imaging and electrophysiology. Scientific Reports. 6, 27818(2016).
  13. Anderson, T. L. Fracture Mechanics: Fundamental and Applications. , CRC Press, Taylor & Francis Group. Florida. (2005).
  14. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (73), e50088(2013).
  15. Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
  16. Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
  17. Sobolik, T., et al. Development of novel murine mammary imaging windows to examine wound healing effects on leukocyte trafficking in mammary tumors with intravital imaging. Intravital. 5 (1), 1125562(2016).
  18. Jacquemin, G., et al. Longitudinal high-resolution imaging through a flexible intravital imaging window. Science Advances. 7 (25), (2021).

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