方法論記事

iNEXT-DiscoveryとInstruct-ERIC:構造生物学のトランスレーショナルリサーチのためのハイエンドサービスの統合

DOI：

10.3791/63435

⸱

2021年11月16日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biochemistry and Oncode Institute, The Netherlands Cancer Institute, Amsterdam, 2CERM/CIRMMP, University of Florence, 3Instruct-ERIC, Oxford University, 4MISTRAL beamline, Alba Light Source, 5Center for Biomolecular Magnetic Resonance (BMRZ), Goethe University Frankfurt, 6Division of Structural Biology, Oxford University, 7Macromolecular Crystallographyy, Helmholtz-Zentrum Berlin

この記事について

要約

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

議論された記事:

Ahmad, M. U. D. et al. フラグメントベースのリード探索におけるスクリーニングのためのナノ示差走査蛍光法.視覚化実験ジャーナル:JoVE。(171)、E62469(2021)。

Barbieri, L., Luchinat, E. 高細胞密度バイオリアクターを用いたリアルタイム定量的細胞内NMRによるヒト細胞内のタンパク質-リガンド相互作用のモニタリング.視覚化実験ジャーナル:JoVE。(169)、E62323(2021)。

Berg, H. et al. 最小サンプルで最大自動化モードでのNMRベースのフラグメントスクリーニング。視覚化実験ジャーナル:JoVE。(172)、E62262(2021)。

Beriashvili, D., Schellevis, R. D., Napoli, F., Weingarth, M., Baldus, M. 固体NMRによる天然膜のタンパク質の高解像度研究.視覚化実験ジャーナル:JoVE。(169)、E62197(2021)。

Cornaciu, I. et al.グルノーブルのEMBL HTX施設の自動結晶学パイプライン。視覚化実験ジャーナル:JoVE。(172)、E62200(2021)。

Crawshaw, A. et al.VMXmビームラインでの微結晶のサンプル調製パイプライン。視覚化実験ジャーナル:JoVE。(172)、E62306(2021)。

Douangamath, A. et al. XChem施設のダイヤモンド光源における効率的なフラグメントスクリーニングの達成。視覚化実験ジャーナル:JoVE。(171)、E62414(2021)。

Groen, J. et al.Cryo Soft X線トモグラフィーによる細胞の3D地図作成。視覚化実験ジャーナル:JoVE。(169)、E62190(2021)。

Horrell, S. et al. ダイヤモンド光源での固定ターゲットシリアルデータ収集。視覚化実験ジャーナル:JoVE。(168)、E62491(2021)。

Jiménez-Moreno, A. et al. Cryo-EMとscipionによる単粒子解析.視覚化実験ジャーナル:JoVE。(171)、E62261(2021)。

Moravcová, J., Pinkas, M., Holbová, R., Nováček, J. CryoElectron tomographyのための出芽酵母の調製とCryoFIBマイクロマシニング.視覚化実験ジャーナル:JoVE。E62351(2021年)。

Vyas, N. et al. 極低温保存された細胞からのクライオ構造照明顕微鏡データ収集.視覚化実験ジャーナル:JoVE。(171)、E62274(2021)。

Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. 極低温電子線トモグラフィーデータ取得の最適化のための戦略.視覚化実験ジャーナル:JoVE。(169)、E62383(2021)。

White, J. B. R. et al. 単一粒子クライオ電子顕微鏡法:サンプルから構造まで。 視覚化実験ジャーナル:JoVE。(171)、E62415(2021)。

Wollenhaupt, J. et al. ヘルムホルツ・ツェントルム・ベルリンでの結晶学的断片スクリーニングのためのワークフローとツール.視覚化実験ジャーナル:JoVE。(169)、E62208(2021)。

編集記事

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

構造生物学の分野は、生体分子構造の原子の詳細を通じて生物学を理解する強力なシステムに発展し、生化学的経路と疾患の分子基盤の理解を深め、トランスレーショナルリサーチに不可欠なツールを提供しています。

長年にわたり、構造生物学は静的な構造を提供するだけでなく、溶液と細胞の両方での分子相互作用についても報告し、時間スケールとダイナミクスを調べてきました。原子や個々の分子からウイルス粒子や細胞全体に至るまで、さまざまなサイズスケールでプロセスを説明するための情報を取得できます。さまざまな技術は、X 線、中性子、または電子に基づく散乱法、たとえば X 線結晶学 (MX) や小角 X 線散乱 (SAXS) など、相乗的な一連の実験的アプローチを提供します。固体および溶液核磁気共鳴(NMR);クライオ電子顕微鏡(クライオEM)による単一粒子再構成。クライオ EM 断層撮影法、クライオソフト X 線断層撮影法、細胞内 NMR などの方法は、特に他のイメージング ツールに関連して、高分子系を研究するためのこのアプローチの武器に追加されます。今日の統合構造生物学は、分子相互作用の親和性と時間スケールに関する補完的な情報を提供する追加の生物物理学的手法とともに、生命を理解し、医薬品、生物製剤(抗体、ナノボディ、ワクチン)、生体材料、およびプラスチックを分解し、環境を助けるために使用できる酵素などのその他の生物学的薬剤を開発するための手ごわいパッケージを提供します。

欧州委員会(EC)は早くから、構造生物学研究が社会にもたらす利益を認識し、1980年代以降、ヨーロッパは高価な構造生物学機器をより大きな科学界に無料で開放することに多大な投資を行ってきました。数百万ユーロの施設へのアクセスの民主化は、構造生物学の分野を国際的に発展させるための原動力であり、基礎となりました。これにより、ヨーロッパはこの分野の最先端に立ち、それによって強力な産業部門を可能にし、地域経済に貢献しました。

ECは、構造生物学技術における外部研究者のアクセスとトレーニングの長く印象的な伝統を大切にしています。2019年末まで、ハイエンド施設とすべてのヨーロッパの研究者に無料で構造生物学にアクセスできるようにしたiNEXTプログラム(NMR、EM、およびトランスレーショナル研究のためのX線のインフラストラクチャ)の成功に続き、2020年2月にHorizon2020プロジェクトiNEXT-Discoveryが開始され、構造生物学インフラストラクチャへの全額出資のアクセスがさらに4年間行われました。並行して、Instruct-ERICは、研究インフラに関する欧州戦略フォーラムのランドマークであり、ヨーロッパおよび国際的な科学コミュニティにとって構造生物学の持続可能な拠点を構成しています。彼らは共に、生命科学者やその他の人々を構造生物学の研究に参加させることを目指しており、そのために、学界や産業界の研究者に、世界中の最高の構造生物学の専門知識、技術、施設へのアクセスを提供しています。また、追加のパートナーとともに、ワークショップや実践的なトレーニングも開催しています。

Covid19のパンデミックにより、iNEXT-DiscoveryおよびInstruct-ERIC研究施設への移動は大幅に妨げられ、実質的に実践的なトレーニングの機会が禁止されています。これを部分的に補うために、iNEXT-DiscoveryとInstruct-ERICはどちらもウェビナーシリーズ(https://inext-discovery.eu/events/what-can-inext-discovery-do-for-us、 https://instruct-eric.eu/content/instructeric-webinar-series-structure-meets-function)と、Journal of Visualized Experimentsのこの特別Methods号を手配しました。ここでは、いくつかの主流のアクセス手順だけでなく、統合構造生物学の分野で開発中の特殊なルーチンについても詳しく説明しています。私たちの方法については今号で詳しく説明していますが、現地で確立するのが難しい専門知識や機器を必要とするものもあります。Instruct-ERICおよびiNEXT-Discovery施設は、高度なスキルを持つ現地スタッフの支援と監督のもと、構造研究に必要な生体分子の作製を含むこれらの方法を提供するために利用できます。

高分子構造を決定するための改良された方法
過去10年間、クライオEMは高分子複合体構造を決定するための非常に人気のある技術に発展しました。リーズ大学(英国)のチームは、ワークフロー中に最適化できる変数と一般的な問題のトラブルシューティングに焦点を当てて、単一粒子EM分析に関連するすべてのステップの概要を提供します1。外部ユーザーによる顕微鏡のオンライン操作が標準となる中、効率的な遠隔操作とイメージングのためのプロトコルが求められています。単一粒子分析では、ガラス化サンプルを画像化して、ランダムな方向の粒子を示すムービーを作成します。画像処理ワークフローは、研究中の標本を再構成するためのパラメーターを識別します。CSIC(ES)のソフトウェアScipionは、このワークフローを作成するためのすべてのツールを提供し、結果の簡単なトレーサビリティも可能にします2。

非常に小さな結晶サンプルのX線回折データを収集することは、技術的な課題だけでなく、大きな研究機会ももたらします。Diamond(英国)チームは、クライオEMツールを使用して、サンプルの前後のX線経路に真空を含む専用のビームライン環境でデータを収集する前に、低ノイズサポートで周囲の液体を最小限に抑えた単一のグリッド上に数百個の微結晶を準備することを紹介します3。シンクロトロンでの連続X線データ収集は、他の困難な結晶系を研究するための鍵でもあります。別の寄稿では、Diamondは、一連の例4を通じて、さまざまな結晶送達システムを使用したデータ収集のための段階的な手順、図、およびビデオを示しています。

創薬における現代統合構造生物学
X線結晶構造解析は、フラグメントベースの創薬として十分に確立されており、リード候補にスムーズに開発できるヒットを特定するためにすでに一般的に使用されています。ダイヤモンド5、ヘルムホルツ・ツェントルム・ベルリン(DE)およびMAX IV(SE)6、およびEMBLグルノーブルユニット(FR)7 のチームは、効率的なターゲット結晶化、フラグメントソーク、結晶マウント、結晶構造駆動のフラグメントスクリーニング、および構造堆積のためのワークフローの自動化における最新の開発について説明します。彼らのパイプラインはかなり自動化されており、世界中の外部の研究者によって使用されています。これらは、すでに100を超えるターゲット(多くの場合リモート)に適用され、さらなる化合物設計と構造支援リード開発のためのヒットを特定しています。

NMRは、可溶性または膜結合のタンパク質またはポリヌクレオチドのいずれかを標的とする、医薬品開発キャンペーンのフラグメントスクリーニングにも一般的に使用されています。フランクフルト(ドイツ)のゲーテ大学は、最適化されたNMRスクリーニングパイプラインを提示し、実験と分析中の手動介入を減らします8。同社のサンプルチェンジャーは、数日間の中断のない実験と自動分析の間に、1回の実行で数百のNMRサンプルを処理します。

さらに、生物物理学的手法はX線とNMRを補完します。オランダがん研究所(NL)のチームは、フラグメント9の添加によるターゲット融解温度の変化を測定するための熱シフトアッセイ用のナノ示差走査熱量測定を使用するワークフローを提示します。タンパク質の品質と濃度に関する前提条件の後には、実験計画、データ収集、および分析のための分析プロトコルが続きます。

細胞構造生物学に向けて
クライオ電子断層撮影法は、細胞内の高分子複合体を調べるためによく選択される方法です。ガラス化サンプルからの画像は、さまざまな傾斜角度で取得され、3Dトモグラムが再構成され、そこからサブボリュームが抽出され、サブトモグラム平均化によってより高い解像度が得られます。電子は物質と強く相互作用するため、このような研究には厚さ200nm未満の試料が必要です。CEITECチーム(CZ)は、プランジ凍結後に細胞ラメラを調製するためのプロトコル10 を提示します。クライオETの自動化は目覚ましい進歩を遂げましたが、チルトシリーズの取得を行うまでに何時間ものデータ収集が必要であり、ターゲットは通常、目視グリッド検査によって識別されます。EMBL Heidelberg (DE) によって、グリッドとグリッド正方形をマッピングし、ターゲットを選択し、チルト シリーズ取得11 を設定するための自動化プロトコルが作成されました。

ALBA(ES)とDiamondシンクロトロンは、無傷の細胞を調べることができるクライオEM断層撮影の代替手段、すなわちクライオソフトX線断層撮影法(cryo-SXT)12の落とし穴と利点について一緒に議論します。超解像技術を極低温に適応させることで、クライオETおよびクライオSXTとの相関イメージングが可能になります。また、ハイスループットクライオ構造照明顕微鏡(cryo-SIM)は、従来の蛍光の分解能を2倍にし、厚いサンプル中の分子または構造の特定の位置につながります。これは、クライオSXTと相関させて、細胞コンテキスト内の特定の特徴を正確に特定することができます13。

ユトレヒト大学(NL)のチームは、天然膜やタンパク質-脂質-糖鎖システムなどの困難な生理学的システムの研究に使用できるサンプル調製と高感度固体NMR実験を報告しています14。また、細胞内溶液NMRは、機能的なプロセスを解明するために急速に進化しています。CERM/CIRMMP(IT)チームは、高磁場磁石15のコアにあるNMRプローブ内の生細胞に栄養素と酸素を補充できるバイオリアクターを組み立てて操作する方法を説明しています。これにより、細胞内タンパク質とリガンドの相互作用をモニタリングするなど、拡張された測定や時間分解実験が可能になります。

結びつき
このJoVE号は、ヨーロッパの研究インフラにおける最近の構造生物学の発展と応用に完全に専念しています。iNEXT-DiscoveryとInstruct-ERICを組み合わせることで、構造生物学の専門家だけでなく、ますます非専門の生命科学者やその他の研究者も、最先端のサービスを提供することで研究目標を追求することができます。

開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

著者らは開示するものは何もない。

謝辞

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

このJoVEメソッドコレクション号は、欧州委員会のHorizon 2020プログラムから資金提供を受けたiNEXT-Discovery(プロジェクト番号871037)から資金提供を受けています。

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. White, J. B. R., et al. Single particle cryo-electron microscopy: From sample to structure. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62415(2021).
  2. Jiménez-Moreno, A., et al. Cryo-EM and single-particle analysis with scipion. Journal of. Visualized Experiments: JoVE. (171), e62261(2021).
  3. Crawshaw, A., et al. A sample preparation pipeline for microcrystals at the VMXmbeamline. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e62306(2021).
  4. Horrell, S., et al. Fixed target serial data collection at diamond light source. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62491(2021).
  5. Douangamath, A., et al. Achieving efficient fragment screening at XChemfacility at diamond light source. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62414(2021).
  6. Wollenhaupt, J., et al. Workflow and tools for crystallographic fragment screening at the helmholtz-zentrum Berlin. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (169), e62208(2021).
  7. Cornaciu, I., et al. The automated crystallography pipelines at the EMBL HTX facility in grenoble. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e62200(2021).
  8. Berg, H., et al. NMR-based fragment screening in a minimum sample but maximum automation mode. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e62262(2021).
  9. Ahmad, M. U. D., et al. Nano-differential scanning fluorimetry for screening in fragment-based lead discovery. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62469(2021).
  10. Moravcová, J., Pinkas, M., Holbová, R., Nováček, J. Preparation and CryoFIB micromachining of Saccharomyces cerevisiae for CryoElectrontomography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. , e62351(2021).
  11. Weis, F., Hagen, W. J. H., Schorb, M., Mattei, S. Strategies for optimization of cryogenic electron tomography data acquisition. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (169), e62383(2021).
  12. Groen, J., et al. A 3D cartographic description of the cell by cryosoft X-ray tomography. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (169), e62190(2021).
  13. Vyas, N., et al. Cryo-structured illumination microscopic data collection from cryogenically preserved cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62274(2021).
  14. Beriashvili, D., Schellevis, R. D., Napoli, F., Weingarth, M., Baldus, M. High-resolution studies of proteins in natural membranes by solid-state NMR. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (169), e62197(2021).
  15. Barbieri, L., Luchinat, E. Monitoring protein-ligand interactions in human cells by real-time quantitative in-cell NMR using a high cell density bioreactor. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (169), e62323(2021).

再版と許可

このJoVE記事のテキストまたは図の再利用許可をリクエスト

許可をリクエスト

タグ

Nano differential Scanning FluorimetryProtein ligand InteractionsIn cell NMRFragment based Lead DiscoverySolid state NMRAutomated CrystallographyCryo EMSingle particle AnalysisCryo electron TomographyData Acquisition StrategiesHigh resolution Protein StudiesBioreactor Technology

関連記事